Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

O objetivo geral deste procedimento é explicar como derivar células formadoras de colônias endoteliais ou e CFCs do sangue do cordão umbilical humano. Isso é feito primeiro plaqueando células mononucleares do sangue do cordão umbilical e, em seguida, clonando e expandindo as conseqüências da colônia de E CFCs. O segundo passo é caracterizar as células in vitro usando uma nova técnica de ensaio de célula única para potencial proliferativo clonal.

Finalmente, as células são caracterizadas em um ensaio de formação de vasos in vivo através da produção e implantação de géis contendo E CFCs em camundongos nod skid. Em última análise, a formação in vivo de vasos cheios de sangue do hospedeiro de novo pode ser avaliada pela coloração h e e dos implantes celulares contendo ECFC. A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes é que esses métodos permitem o exame do potencial proliferativo das células endoteliais em um único nível celular.

As implicações dessa técnica podem ser estendidas para encontrar ferramentas diagnósticas e terapêuticas para doenças como doença arterial selvagem ou DAP, porque essa técnica nos permite examinar o potencial proliferativo e a capacidade gênica das células endoteliais de um paciente. Antes de iniciar o procedimento, adicione um mililitro de colágeno de cauda de rato, digite um em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços e, em seguida, incube a placa durante a noite no dia do procedimento, alicote o sangue do cordão umbilical em unidades de 15 mililitros em tubos de centrífuga cônicos de 50 mililitros. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS a cada tubo e pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes.

Em seguida, coloque 15 mililitros de PA em uma pipeta, coloque a ponta da pipeta no fundo do tubo de sangue diluído e subponha cuidadosamente a centrífuga alpac dos tubos por 30 minutos a 740 vezes G em temperatura ambiente sem a configuração do freio de desaceleração. Após a separação celular, use uma pipeta de transferência para remover a camada nebulosa de células mononucleares de baixa densidade localizada na interface entre o pico fial e o plasma diluído. Dispensar as células recolhidas num tubo cónico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de E GM dois meios e pulverizar as células mononucleares durante 10 minutos a 515 vezes G à temperatura ambiente com o travão de desaceleração elevada, aspirar cuidadosamente e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, depois de lavar as células peletizadas com EGM duas vezes resus, suspenda-as células mononucleares em EGM dois a 1,25 vezes 10 elevado à sétima células por mililitro. Agora pipete quatro mililitros da suspensão de células mononucleares em cada poço da placa revestida de colágeno e incube as células até que as colônias se formem no primeiro dia. Após a incubação, remova lentamente o meio gasto dos poços com uma pipeta sem perturbar as células frouxamente aderentes.

Em seguida, adicione cuidadosamente quatro mililitros de E GM dois aos poços e retorne a placa à incubadora. As colônias geralmente aparecem entre os dias cinco e 14 do dia anterior ao procedimento. Com 50 microlitros de colágeno de cauda de rato.

Digite um para cada poço de uma placa de 96 poços como antes e incube a placa durante a noite no dia do procedimento. Comece lavando as células que foram passadas apenas duas a três vezes duas vezes com PBS. Após aspirar a lavagem final de PBS, coloque um cilindro de clonagem revestido com gel estéril ao redor de cada colônia, pressionando cada cilindro firmemente contra a placa usando uma pinça estéril.

Adicione duas a três gotas de triplo E expresso quente em cada cilindro de clonagem e incube os cilindros por três a cinco minutos até que as células comecem a se desprender. Depois que as células começaram a se desprender em aproximadamente 250 microlitros de EGM, dois meios no centro do cilindro e pipeta para cima e para baixo para gerar uma única célula Agora transfira a suspensão de célula única de cada cilindro de clonagem separadamente para um tubo de microcentrífuga individual.

Infecte as células em uma placa de seis poços com lentivírus que expressam EGFP e colete as células que expressam EGFP por citometria fluorescente. Em seguida, incube as células positivas para EEG FP e EGM dois nas placas revestidas de colágeno. Quando os E CFCs estiverem prontos, colete-os usando a viagem E expresso como acabamos de demonstrar e resus suspenda as células e e GM dois médios para uma concentração final de aproximadamente 10 elevado à sexta células por mililitro.

Em seguida, usando um classificador de fluxo com uma baixa taxa de fluxo de 20 células por segundo, classifique um único ECFC positivo para EGP por poço na placa de 96 poços revestida com colágeno previamente preparada, ajuste o volume final de cada poço com EGM dois para aproximadamente 200 microlitros por poço. Em seguida, use um microscópio de fluorescência invertida para garantir que cada poço contenha apenas uma célula. Incubar a placa durante um período de duas semanas com duas mudanças de mídia no dia 14 da cultura.

Lave cada poço com 100 microlitros de PBS antes de fixar as células com 100 microlitros de aldeído paraforme a 4% por 30 minutos. Para e CFCs que não expressam EGFP, adicione reagente cyt, um corante nuclear fluorescente verde após a fixação de paraformaldeído e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Use um microscópio de fluorescência para quantificar visivelmente o número de células endoteliais expandidas, conforme demonstrado aqui, poços com um número de células endoteliais de dois a 50 são considerados aglomerados de células endoteliais.

Poços com 51 a 2000 células são de baixo potencial proliferativo e CFCs e poços com 2001 ou mais são considerados de alto potencial proliferativo e CFCs. Depois de separar as células com triplo E expresso como antes, obtenha uma contagem de células viáveis da cultura de células por hemo, citômetro e azul trian. Transfira 2,4 milhões de células viáveis para um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, peletize as células por centrifugação enquanto as células estão sendo giradas.

Misture bem os componentes da matriz de gel e, em seguida, ajuste o pH para 7,4 com hidróxido de sódio, mantendo a solução no gelo. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 360 microlitros de quente e GM dois. Em seguida, adicione 840 microlitros da solução de matriz de gel às células e misture a solução cuidadosamente até que as células estejam completamente suspensas no gel Transfira esta suspensão de gel de um mililitro de celularização para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e incube a placa até que o gel polimerize.

Então, antes de incubar durante a noite, cubra suavemente o gel com dois mililitros de EGM quente dois no dia seguinte e imediatamente antes da implantação. Use uma tesoura de íris para dissecar o gel em duas partes iguais e retorne as peças de gel para o mesmo poço de cultura contendo e GM dois meios. Depois de confirmar a sedação com beliscões no dedo do pé, raspe a parte inferior do abdômen de um aceno anestesiado de cinco a seis semanas, deslize o mouse e limpe completamente o local da cirurgia girando as almofadas de álcool e betadina.

Em seguida, use uma tesoura de íris afiada estéril para fazer uma incisão de aproximadamente cinco milímetros no quadrante inferior do abdômen, expondo o espaço subcutâneo entre a pele e o músculo abdominal. Cego. Disseque a camada dérmica do músculo abdominal em duas áreas diferentes do abdômen para criar bolsas de 15 a 20 milímetros de largura, uma levando superior ao quadrante abdominal superior e outra em outra área do abdômen. Em seguida, levantando a camada dérmica, apenas mime a incisão.

Insira metade do gel em uma bolsa abdominal e a outra metade do gel na outra bolsa abdominal. Após a inserção dos géis, feche cada incisão com dois a três pontos usando cinco pontos de polipropileno em uma agulha cortante. Rotule os cartões de gaiola e realize monitoramento e analgesia pós-cirúrgicos de acordo com os requisitos institucionais e de protocolo.

Depois de sacrificar o animal no dia 14 da implantação, limpe o abdômen do camundongo com compressas de álcool e corte a pele mimada na linha de incisão original. Em seguida, excise retalhos de pele mimados até a provável localização dos géis. Corta circunferencialmente ao redor dos géis para remover cada implante e, em seguida, coloca os implantes excisados no fixador de zinco.

Usando esta técnica de derivação ECFC, observamos o crescimento da formação de colônias primárias já no quinto dia. Observe a morfologia de paralelepípedos dessas culturas ECFC atuais, conforme indicado pelas pontas das setas. As colônias expandidas expressam antígenos endoteliais, mas não expressam antígenos hematopoiéticos.

Conforme mostrado nesta avaliação fenotípica representativa in vitro de células endoteliais e hematopoiéticas, a imunofenotipagem revelou que os CFCs expressam antígenos endoteliais como CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL um, flick um, flip quatro e NRP dois, mas não expressaram antígenos hematopoiéticos, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR quatro ou CD 1 33. É importante ressaltar que, conforme representado neste gráfico de barras, as colônias expandidas exibem uma hierarquia completa do potencial proliferativo clonal no nível de célula única que varia de aglomerados de duas a 50 células até colônias maiores que 2001. Essas micrografias de colônias coradas com cyt, um corante nuclear fluorescente verde, foram obtidas após o sangue do cordão umbilical derivado de E CFCs serem cultivados no nível de célula única por 14 dias.

Além disso, os e CFCs formam vasos sanguíneos humanizados que são perfundidos com glóbulos vermelhos hospedeiros quando implantados em camundongos imunodeficientes. Nesta coloração h e e de ECFC derivado do sangue do cordão umbilical contendo implantes de gel CELLULARIZE, microvasos preenchidos com glóbulos vermelhos hospedeiros que se formaram no gel de colágeno fibronectina após 14 dias de implantação podem ser observados. Aqui, a coloração anti-CD 31 humana em marrom confirma ainda mais a origem humana desses vasos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como derivar e CFCs do sangue do cordão umbilical humano e de como clonar, expandir e caracterizar a funcionalidade das colônias ECFC após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em endotélio vascular explorarem o potencial proliferativo clonal endotelial e a capacidade gênica das células endoteliais obtidas de várias fontes.