Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

O objetivo geral deste procedimento é explicar como obter células formadoras de colônias endoteliais ou CFCs a partir de sangue do cordão umbilical humano. Isso é realizado primeiramente por meio do plaqueamento de células mononucleares provenientes do sangue do cordão umbilical, seguido pelo clonamento e expansão de colônias derivadas de CFCs. O segundo passo consiste em caracterizar as células in vitro utilizando uma técnica inovadora de ensaio em célula única para avaliar o potencial proliferativo clonal.

Por fim, as células são caracterizadas em um ensaio de formação de vasos in vivo por meio da produção e implantação de géis contendo E CFCs em camundongos nod skid. Em última análise, a formação in vivo de vasos sanguíneos recém-formados preenchidos por sangue do hospedeiro pode ser avaliada por coloração de h e e dos implantes celulares contendo ECFCs. A principal vantagem dessas técnicas em relação aos métodos existentes é que esses métodos permitem a análise do potencial proliferativo de células endoteliais em nível de célula única.

As implicações dessa técnica podem ser estendidas para a busca de ferramentas diagnósticas e terapêuticas para doenças como a doença arterial periférica ou DAP, pois este método permite examinar o potencial proliferativo e a capacidade genica das células endoteliais de um paciente. Antes de iniciar o procedimento, adicione um mililitro de colágeno de cauda de rato, tipo I, em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços e, em seguida, incube a placa durante a noite no dia do procedimento. Aliquote o sangue de cordão umbilical em unidades de 15 mililitros em tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS a cada tubo e pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes.

Em seguida, aspire 15 mililitros do fial PA em uma pipeta, posicione a ponta da pipeta no fundo do tubo com sangue diluído e delicadamente sobrepunha o fial PA. Centrifugue os tubos por 30 minutos a 740 ×g à temperatura ambiente, sem usar a função de frenagem. Após a separação celular, utilize uma pipeta de transferência para remover a camada turva de células mononucleares de baixa densidade localizada na interface entre o pico do fial e o plasma diluído. Transfira as células coletadas para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio E GM dois e centrifugue as células mononucleares por 10 minutos a 515 ×g à temperatura ambiente, com a frenagem de desaceleração em velocidade alta. Em seguida, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Em seguida, após lavar as células do pellet duas vezes com EGM dois, suspenda as células mononucleares em EGM dois a 1,25 × 10⁷ células por mililitro. Agora, pipete quatro mililitros da suspensão de células mononucleares em cada poço da placa revestida com colágeno e incube as células até a formação de colônias no primeiro dia. Após a incubação, remova lentamente o meio gasto dos poços com uma pipeta, sem perturbar as células fracamente aderidas.

Em seguida, adicione cuidadosamente quatro mililitros de E GM dois aos poços e retorne a placa ao incubador. As colônias geralmente aparecem entre os dias cinco e 14, um dia antes do procedimento. Com 50 microlitros de colágeno de cauda de rato.

Coloque um tipo em cada poço de uma placa de 96 poços como antes e incube a placa durante a noite no dia do procedimento. Comece lavando as células que foram subcultivadas apenas duas a três vezes, duas vezes com PBS. Após aspirar a lavagem final de PBS, coloque um cilindro de clonagem estéril revestido com gel ao redor de cada colônia, pressionando firmemente cada cilindro contra a placa usando pinças estéreis.

Adicione duas a três gotas de meio Triple E aquecido a cada cilindro de clonagem e incube os cilindros por três a cinco minutos, até que as células comecem a se desprender. Após o início do desprendimento celular, adicione aproximadamente 250 microlitros de meio EGM dois ao centro do cilindro e pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão de células isoladas. Em seguida, transfira separadamente a suspensão de células isoladas de cada cilindro de clonagem para um tubo individual de microcentrífuga.

Infete as células em uma placa de seis poços com lentivírus expressando EGFP e colete as células que expressam EGFP por citometria de fluxo. Em seguida, incube as células positivas para EGFP e meio EGM-2 em placas revestidas com colágeno. Quando as CFCs estiverem prontas, colete-as usando tripé, como demonstrado anteriormente, e re-suspenda as células no meio EGM-2 até uma concentração final de aproximadamente 10⁶ células por mililitro.

Em seguida, utilizando um classificador de fluxo com uma taxa baixa de 20 células por segundo, classifique uma única ECFC positiva para EGP por poço em uma placa de 96 poços previamente revestida com colágeno, ajustando o volume final de cada poço com EGM dois para aproximadamente 200 microlitros por poço. Em seguida, utilize um microscópio invertido de fluorescência para garantir que cada poço contenha apenas uma célula. Incube a placa ao longo de um período de duas semanas, com duas trocas de meio no dia 14 do cultivo.

Lave cada poço com 100 microlitros de PBS antes de fixar as células com 100 microlitros de paraformaldeído a 4% por 30 minutos. Para CFCs que não estão expressando EGFP, adicione o reagente cit, um corante nuclear fluorescente verde, após a fixação com paraformaldeído e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Utilize um microscópio de fluorescência para quantificar visualmente o número de células endoteliais expandidas, conforme demonstrado aqui; poços com um número de células endoteliais entre dois e 50 são considerados aglomerados de células endoteliais.

Poços com 51 a 2000 células são CFCs com baixo potencial proliferativo e poços com 2001 ou mais são considerados CFCs com alto potencial proliferativo. Após destacar as células com triplo E, como antes, obtenha uma contagem de células viáveis da cultura celular por hemocitômetro e azul de tripano. Transfira 2,4 milhões de células viáveis para um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, faça a centrifugação das células enquanto elas sedimentam.

Misture bem os componentes da matriz gelificante e, em seguida, ajuste o pH para 7,4 com hidróxido de sódio, mantendo a solução em gelo. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 360 microlitros de e GM dois morno. Em seguida, adicione 840 microlitros da solução da matriz gelificante às células e misture cuidadosamente a solução até que as células fiquem completamente suspensas no gel. Transfira esta suspensão celular gelificada de um mililitro para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e incube a placa até que o gel polimerize.

Em seguida, antes de incubar durante a noite, cubra suavemente o gel com dois mililitros de meio EGM dois morno no dia seguinte e imediatamente antes da implantação. Use tesoura de íris para dissecar o gel em dois pedaços iguais e devolva os fragmentos de gel à mesma placa de cultura contendo meio EGM dois. Após confirmar a sedação por meio do aperto dos dedos dos pés, raspe o abdômen inferior de um camundongo nod, skid anestesiado com cinco a seis semanas de idade e limpe minuciosamente o local cirúrgico com discos alternados de álcool e betadine.

Em seguida, utilize tesoura de íris estéril e afiada para fazer uma incisão de aproximadamente cinco milímetros no quadrante inferior do abdômen, expondo o espaço subcutâneo entre a pele e o músculo abdominal. Disseque, com dissecção romba, a camada dérmica do músculo abdominal em duas áreas diferentes do abdômen para criar bolsos com largura de 15 a 20 milímetros, um direcionado superiormente ao quadrante abdominal superior e outro para uma outra área do abdômen. Em seguida, levante a camada dérmica logo ao lado da incisão.

Insira uma metade do gel em um bolsão abdominal e a outra metade do gel no outro bolsão abdominal. Após a inserção dos géis, feche cada incisão com dois a três pontos usando suturas de polipropileno 5-0 em uma agulha cortante. Rotule as fichas das gaiolas e realize o monitoramento pós-cirúrgico e analgesia conforme os requisitos institucionais e do protocolo.

Após sacrificar o animal no dia 14 após a implantação, passe álcool sobre o abdômen do camundongo com cotonetes e corte a pele ao longo da linha da incisão original. Em seguida, retire retalhos de pele ao redor da localização provável dos géis. Faça cortes em torno dos géis para remover cada implante e, então, coloque os implantes removidos no fixador de zinco.

Utilizando esta técnica de obtenção de ECFC, observamos o crescimento da formação de colônias primárias já no quinto dia. Observe a morfologia em pavimento (tipo "cobblestone") dessas culturas de ECFC no quinto dia, conforme indicado pelas setas. As colônias expandidas expressam antígenos endoteliais, mas não expressam antígenos hematopoéticos.

Como mostrado nesta avaliação fenotípica in vitro representativa de células endoteliais e hematopoiéticas, a imunofenotipagem revelou que as CFCs-e expressam antígenos endoteliais como CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, flick1, flip4 e NRP2, mas não expressaram antígenos hematopoiéticos, como CD45, CD14, CD11b, C-Kit, CXCR4 ou CD133. Importante, como representado neste gráfico de barras, as colônias expandidas exibem uma hierarquia completa de potencial proliferativo clonal ao nível de célula única, que varia desde aglomerados de duas a 50 células até colônias com mais de 2001 células. Essas micrografias de colônias coradas com cit, um corante nuclear fluorescente verde, foram obtidas após CFCs-e derivadas de sangue de cordão serem cultivadas ao nível de célula única por 14 dias.

Além disso, os ECFCs formam vasos sanguíneos humanizados que são perfundidos com hemácias do hospedeiro quando implantados em camundongos imunodeficientes. Nesta coloração com hematoxilina e eosina (H&E) de implantes em gel CELLULARIZE contendo ECFCs derivados de sangue de cordão, podem-se observar microvasos preenchidos com hemácias do hospedeiro, formados no gel de colágeno e fibronectina após 14 dias de implantação. Aqui, a marcação com anti-CD31 humano na cor marrom confirma ainda mais a origem humana desses vasos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como derivar CFCs a partir de sangue humano do cordão umbilical e de como clonar, expandir e caracterizar a funcionalidade das colônias de CFCs após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do endotélio vascular explorarem o potencial proliferativo clonal e a capacidade genética de células endoteliais obtidas de múltiplas fontes.