Name: Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Aprenda a derivar células endoteliais formadoras de colônias (ECFCs) do sangue do cordão umbilical humano. Este método permite caracterizar o potencial proliferativo clonal e a capacidade de formação de vasos in vivo para aplicações em medicina regenerativa.

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Dr. Yoder é consultor de Tecnologias EndGenitor, Inc. e membro do conselho de Rimedion Technologies, Inc.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Caracterização fenotípica e funcional dos putativos células progenitoras endoteliais é importante para identificar os ECFCs autênticas que são capazes de clonalmente e serialmente re-plaqueamento em cultura e dar origem a duráveis ​​e funcional vasos sanguíneos implantáveis ​​in vivo. O sangue do cordão umbilical humano é enriquecido com ECFCs ea concentração desses declínios células circulantes com o envelhecimento ou a doença de 10. Estudos recentes sugerem que ECFC podem desempenhar papéi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Injeção de heparina sódica, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Cânula de mistura </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> FBS definido </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE expressa </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Tipo Rat colágeno I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FcR Bloco </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC Conjugated </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, conjugado com FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, conjugado com FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE conjugado </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE conjugado </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE conjugado </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, o anticorpo k, conjugado com FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, o anticorpo k, PE conjugado </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Ms IgG 2a, o anticorpo k, conjugado com FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-CD31 humano </td><td> Dako </td><td> clone JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22 mícrons sistema de filtração de vácuo </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial, 17.4N </td><td> Pescador </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótica </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC zinco Fixação </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox reagente verde </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Cilindros de clonagem, estéreis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais formadoras de colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Vistas de longa data de formação de novos vasos sanguíneos através de angiogênese, vasculogênese e arteriogênese foram avaliados recentemente 1. A presença de circulação de células progenitoras endoteliais (EPCs) foram primeiramente identificadas no sangue periférico humano adulto por Asahara et al. Em 1997 2 trazendo uma infusão de novas hipóteses e estratégias para a regeneração e reparação vascular. EPCs são raras, mas os componentes normais do sangue circulante de que o lar de locais de formação dos vasos sanguíneos ou remodelação vascular, e facilitar quer vasculogênese pós-natal, a angiogênese, ou arteriogênese em grande parte através da estimulação parácrina de parede do vaso existente derivadas de células 3. Nenhum marcador específico para identificar um EPC foi identificado, e no presente estado do campo é entender que tipos de células-tronco hematopoiéticas, incluindo numerosos proangiogenic e células progenitoras, células circulantes angiogênicas, TIE2 + de monócitos, cel progenitor mielóidels, tumorais macrófagos associados, e M2 macrófagos activados participar em estimular o processo angiogénico em uma variedade de sistemas de modelos animais e pré-clínicos em seres humanos em numerosos estados de doença 4, 5. Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) são raras circulantes células endoteliais viáveis ​​caracterizadas por potencial robusto clonal proliferativa, colônia secundária e terciária capacidade de formação sobre repique, e capacidade de formar intrínseca em vasos in vivo sobre o transplante em ratos imunodeficientes 6-8. Enquanto ECFCs foram isoladas com sucesso a partir do sangue periférico de indivíduos adultos saudáveis, o sangue do cordão umbilical (CB) de recém-nascidos saudáveis ​​e parede do reservatório de numerosos humanos vasos arteriais e venosos 6-9, CB possui a maior freqüência de ECFCs 7 que exibição o mais robusto potencial clonal proliferativa e forma os vasos sanguíneos duráveis ​​e funcionais in vivo 8, 10-13. Enquanto a derivação deECFC a partir de sangue periférico adulto tem sido apresentada 14, 15, aqui descrever as metodologias para a derivação, a clonagem, a expansão, e in vitro em bem como em caracterização in vivo das ECFCs do umbilical humano CB.

Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) estão circulando células endoteliais com potencial clonal proliferativa robusto que exibe intrínseco<em&gt; In vivo</emNavio&gt; capacidade de formação. Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais excrescência derivados de CB são importantes para identificar e isolar<em&gt; Bona fide</em&gt; ECFCs potencial para aplicação clínica na reparação de tecidos danificados.

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

As visões consagradas sobre a formação de novos vasos sanguíneos via angiogênese, vasculogênese e arteriogênese foram revisadas recentemente1. A presença de ...

O objetivo geral deste procedimento é explicar como obter células formadoras de colônias endoteliais ou CFCs a partir de sangue do cordão umbilical humano. Isso é realizado primeiramente por meio do plaqueamento de células mononucleares provenientes do sangue do cordão umbilical, seguido pelo clonamento e expansão de colônias derivadas de CFCs. O segundo passo consiste em caracterizar as células in vitro utilizando uma técnica inovadora de ensaio em célula única para avaliar o potencial proliferativo clonal.Por fim, as células são caracterizadas em um ensaio de formação de vasos in vivo por meio da produção e implantação de géis contendo E CFCs em camundongos nod skid. Em última análise, a formação in vivo de vasos sanguíneos recém-formados preenchidos por sangue do hospedeiro pode ser avaliada por coloração de h e e dos implantes celulares contendo ECFCs. A principal vantagem dessas técnicas em relação aos métodos existentes é que esses métodos permitem a análise do potencial proliferativo de células endoteliais em nível de célula única.As implicações dessa técnica podem ser estendidas para a busca de ferramentas diagnósticas e terapêuticas para doenças como a doença arterial peri

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Este protocolo permite a geração e caracterização confiáveis de células endoteliais de crescimento sanguíneo (BOECs) a partir de um pequeno volume de sangue periférico adulto. As BOECs podem ser usadas como substitutas para células endoteliais de pacientes com distúrbios vasculares e como substrato para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas.

Geração e cultura de sangue Conseqüência células endoteliais do sangue periférico humano

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

O sistema esferóide tridimensional do ensaio da angiogênese da cocultura é projetado imitar a angiogênese fisiológica. Os esferoides da co-cultura são dados forma por dois precursores vasculares humanos da pilha, por ecfcs e por MSCS, e incorporados no gel do colagénio. O novo sistema é eficaz para avaliar moduladores angiogênicos e fornece informações mais relevantes para o estudo in vivo.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Caracterização das Células Endoteliais de Crescimento Sanguíneo (CBO) do Sangue Periférico Porcino

Aprenda a derivar células endoteliais formadoras de colônias (ECFCs) do sangue do cordão umbilical humano. Este método permite caracterizar o potencial proliferativo clonal e a capacidade de formação de vasos in vivo para aplicações em medicina regenerativa.

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

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