Claro conduzido enzimática descarboxilação

O objetivo geral deste experimento é conduzir reações enzimáticas usando luz visível. Nesta abordagem, a luz é usada para converter ácidos graxos em alcinos terminais sob condições de reação leves. A descarboxilação requer a quebra das ligações CC.

E essa ligação é muito estável, o que torna essa reação muito difícil. O uso da luz é uma abordagem sustentável para alcançar uma reação tão difícil. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando tentamos adicionar peróxido de hidrogênio diretamente à reação, o que levou à inativação das enzimas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma quantidade constante de peróxido de hidrogênio. Primeiro, usamos OleT purificado para biocatálise acionada por luz para caracterizar nossa enzima. Posteriormente, também testamos o extrato bruto que seria importante para o desenvolvimento de aplicações industriais.

Depois de clonar o gene OleT sintético no vetor de expressão e transformar o plasmídeo em E.Coli conforme descrito no protocolo de texto, inocular as células em dois tubos de ensaio contendo três mililitros de meio LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as pré-culturas em uma coqueteleira por 15 horas. Diluir dois mililitros da cultura em 200 mililitros de LB com ampicilina em dois frascos de um litro.

Incubar os frascos em um agitador a 37 graus Celsius e 180 RPM até que as culturas atinjam uma densidade óptica de 600 nanômetros entre 0,6 e 0,8. Em seguida, adicione 0,5 milimolar de ácido delta aminolevulínico às culturas. E então induza as células adicionando tetraciclina a 0,2 microgramas por mililitro aos frascos.

Incubar as culturas por 15 horas a 20 graus Celsius e 180 RPM. Após a indução, decantar as culturas em tubos de centrifugação e centrifugar os tubos a 12000 vezes G e quatro graus Celsius durante 20 minutos. Descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os pellets pipetando 50 mililitros de tampão Tris gelado e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga cônico. Continue centrifugando a 4000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em três mililitros de tampão pipetando.

Lise as células por sonicação com três ciclos de 30 segundos, parando por um minuto entre os ciclos. Em seguida, centrifugue o lisado a 15000 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, pipete cuidadosamente o extrato livre de células em tubos de centrífuga cônicos. Para a preparação do extrato bruto para a biocatálise acionada pela luz, transfira três mililitros de um extrato livre de uma célula para um filtro de centrífuga de 10 kilodalton e centrifugue a 4000 vezes G a quatro graus Celsius para remover pequenas moléculas.

Ressuspenda a proteína em três mililitros de Tris. Para caracterizar a atividade do OleT na biocatálise acionada por luz, a proteína precisa ser purificada. Para iniciar a purificação da proteína, carregue três mililitros do extrato livre de células em colunas de centrifugação NTA de níquel equilibradas.

Sele as colunas com tampões inferiores e tampas de rosca. E agite-os levemente até que a resina esteja uniformemente distribuída. Continue incubando as colunas em um agitador suspenso.

Em seguida, centrifugue a coluna. Em seguida, lave as colunas adicionando um mililitro de tampão de lavagem e centrifugando-as a 700 vezes G por dois minutos. Repita a lavagem mais duas vezes.

Após a lavagem, coloque as colunas em tubos de centrífuga cônicos e adicione um mililitro de tampão de eluição a cada coluna. Centrifugar os tubos a 700 vezes G durante dois minutos e repetir a eluição mais duas vezes. Adicionar os extractos combinados em coluna a um filtro de centrifugação de 10 kilodalton e centrifugá-lo a 4000 vezes G e quatro graus Celsius para separar o imidazol utilizado para a eluição da enzima.

Por fim, determine a pureza e a concentração da proteína, conforme indicado no protocolo de texto. Para iniciar o procedimento de biotransformação, primeiro adicione 10% de um surfactante como tergitol e 28,4 miligramas de ácido esteárico à água destilada para fazer 10 mililitros de uma solução estoque de 10 milimolares. Aqueça a solução em uma câmara de aquecimento, a 60 graus Celsius, até que o ácido esteárico esteja completamente dissolvido.

Use esta solução para preparar uma mistura de reação de acordo com o próximo protocolo. Adicione FMN, EDTA, tampão e ácido esteárico a dois tubos de vidro transparente e mexa em banho-maria a 25 graus Celsius. Continue adicionando 200 microgramas por mililitro da enzima purificada ou extrato bruto aos tubos.

E ilumine-os com uma lâmpada LED transparente a uma distância de dois centímetros. Em seguida, pegue amostras de 200 microlitros em pontos de tempo específicos em tubos pré-preenchidos com 20 microlitros de ácido clorídrico a 37% para interromper as reações. Em seguida, adicione cinco microlitros de uma solução de ácido mirístico de 10 milimolares a cada amostra como um padrão interno.

Para analisar os produtos da reação, adicione duas vezes 500 microlitros de acetato de etila aos tubos. Inverta os tubos para misturá-los e centrifugue por um minuto a 13.000 vezes G.Em seguida, transfira 400 microlitros dos sobrenadantes para tubos de microcentrífuga e evapore-os completamente soprando suavemente nos tubos com ar comprimido. Adicione 200 microlitros de MSTFA aos tubos.

E incube a mistura a 60 graus Celsius por 30 minutos para derivatizar as amostras antes da análise. Analisar os produtos da reacção injectando uma amostra de quatro microlitros num cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector de ionização de chama, utilizando o perfil de temperatura descrito no protocolo de texto. Em seguida, determinar a proporção de um heptadecano e beta-hidroxiácido formados em cada amostra de reação com um cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa.

Use a temperatura do forno e as configurações do espectrômetro de massa conforme descrito no protocolo de texto. Injectar um microlitro de cada amostra no cromatógrafo de fase gasosa e registar o cromatograma. Por fim, monitore os cromatogramas GCMS para cada amostra e analise-os de acordo com o protocolo do fabricante.

Os pesos moleculares dos produtos das reações enzimáticas foram determinados por meio de um cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas. Para ácidos graxos com cadeias acila mais longas, a enzima OleT, preferencialmente catalisa sua descarboxilação em olefinas de diferentes comprimentos. As amostras da reação de biotransformação foram analisadas por um cromatógrafo gasoso equipado com um detector de ionização de chama.

A descarboxilação do ácido esteárico demonstrou ocorrer três vezes mais rápido do que a reação de hidroxilação com 99% do ácido esteárico convertido em uma mistura de 3,3: 1 de um heptadecano para ácido 2-hidroxiesteárico. Uma vez dominada, a biocatálise impulsionada pela luz pode ser feita em poucas horas se, digamos, eu executar corretamente. Na catálise da luz, o desafio é vincular reações úteis à colheita da luz.

No nosso caso, temos a luz dentro da molécula FMN como fotossensibilizador e os ligamos à nossa enzima por meio da molécula de transferência, que é o peróxido de hidrogênio.