Claro conduzido enzimática descarboxilação

O objetivo geral deste experimento é promover reações enzimáticas utilizando luz visível. Nesta abordagem, a luz é usada para converter ácidos graxos em alcinos terminais sob condições brandas de reação. A descarboxilação exige a quebra de ligações CC.

E essa ligação é muito estável, o que torna esta uma reação muito difícil. O uso de luz é uma abordagem sustentável para realizar uma reação tão difícil. Tivemos a ideia inicial para este método ao tentar adicionar diretamente peróxido de hidrogênio à reação, o que levou à inativação das enzimas.

A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma quantidade constante de peróxido de hidrogênio. Primeiramente, utilizamos OleT purificada para a biocatálise acionada por luz, a fim de caracterizar nossa enzima. Posteriormente, também testamos extrato bruto, o que seria importante para o desenvolvimento de aplicações industriais.

Após clonar o gene sintético OleT no vetor de expressão e transformar o plasmídeo em E. coli conforme descrito no protocolo textual, inocular as células em dois tubos de ensaio contendo três mililitros de meio LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incubar as pré-culturas em agitador durante 15 horas. Diluir dois mililitros da cultura em 200 mililitros de LB com ampicilina em dois erlenmeyers de um litro.

Incube os frascos em agitador a 37 graus Celsius e 180 rpm até que as culturas atinjam uma densidade óptica a 600 nanômetros entre 0,6 e 0,8. Em seguida, adicione 0,5 milimolar de ácido delta-aminolevulínico às culturas. E então induza as células adicionando tetraciclina a 0,2 microgramas por mililitro aos frascos.

Incube as culturas por 15 horas a 20 °C e 180 rpm. Após a indução, decante as culturas para tubos de centrífuga e centrifugue os tubos a 12000 ×g e 4 °C por 20 minutos. Descarte o sobrenadante.

Re-suspenda os pellets pipetando 50 mililitros de tampão Tris gelado e transfira a suspensão para um tubo cônico de centrífuga. Em seguida, centrifugue a 4000 ×g e 4 °C por 15 minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda cada pellet em 3 mililitros de tampão mediante pipetagem repetida.

Lise as células por sonicamento com três ciclos de 30 segundos, com pausa de um minuto entre os ciclos. Em seguida, centrifugue o lisado a 15000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos e, cuidadosamente, transfira o extrato livre de células para tubos cónicos de centrífuga. Para o preparo do extrato bruto para a biocatálise acionada por luz, transfira três mililitros de um extrato livre de células para um filtro centrífugo de 10 kilodaltons e centrifugue a 4000 × g a quatro graus Celsius para remover moléculas pequenas.

Re-suspenda a proteína em três mililitros de Tris. Para caracterizar a atividade da OleT na biocatálise acionada por luz, a proteína precisa ser purificada. Para iniciar a purificação da proteína, carregue três mililitros do extrato livre de células em colunas giratórias de níquel NTA equilibradas.

Selar as colunas com tampões inferiores e tampas rosqueáveis. E agitar levemente até que a resina esteja uniformemente distribuída. Em seguida, incubar as colunas em um agitador rotativo.

Em seguida, centrifugue a coluna. Depois, lave as colunas adicionando um mililitro de tampão de lavagem e centrifugando-as a 700 ×g por dois minutos. Repita a lavagem mais duas vezes.

Após a lavagem, coloque as colunas em tubos cônicos de centrífuga e adicione um mililitro de tampão de eluição a cada coluna. Centrifugue os tubos a 700 × g durante dois minutos e repita a eluição mais duas vezes. Adicione os extratos combinados das colunas a um filtro de centrífuga de 10 quilodaltons e centrifugue a 4000 × g e quatro graus Celsius para separar a imidazol utilizada na eluição da enzima.

Por fim, determine a pureza e a concentração da proteína conforme indicado no protocolo do texto. Para iniciar o procedimento de bioconversão, adicione primeiro 10% de um surfactante, como tergitol, e 28,4 miligramas de ácido esteárico à água destilada para preparar 10 mililitros de uma solução estoque 10 milimolar. Aqueça a solução em uma câmara de aquecimento a 60 graus Celsius até que o ácido esteárico esteja completamente dissolvido.

Use esta solução para preparar uma mistura de reação de acordo com o próximo protocolo. Adicione FMN, EDTA, tampão e ácido esteárico a dois tubos de vidro transparentes e agite em banho-maria a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microgramas por mililitro da enzima purificada ou extrato bruto aos tubos.

E ilumine-os com uma lâmpada de LED clara a uma distância de dois centímetros. Em seguida, colete amostras de 200 microlitros em pontos de tempo específicos em tubos previamente preenchidos com 20 microlitros de ácido clorídrico a 37% para interromper as reações. Depois, adicione cinco microlitros de uma solução de ácido mirístico 10 milimolar a cada amostra como padrão interno.

Para analisar os produtos da reação, adicione duas vezes 500 microlitros de acetato de etila aos tubos. Inverta os tubos para misturá-los e centrifugue por um minuto a 13.000 vezes G. Em seguida, transfira 400 microlitros dos sobrenadantes para tubos de microcentrífuga e evapore-os completamente soprando suavemente nos tubos com ar comprimido. Adicione 200 microlitros de MSTFA aos tubos.

E incubar a mistura a 60 graus Celsius por 30 minutos para realizar a derivatização das amostras antes da análise. Analisar os produtos da reação injetando uma amostra de quatro microlitros em um cromatógrafo a gás equipado com detector de ionização de chama, utilizando o perfil de temperatura descrito no protocolo do texto. Em seguida, determinar a razão entre heptadecano e ácido beta-hidroxílico formados em cada amostra reacional por meio de um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massas.

Utilize a temperatura do forno e as configurações do espectrômetro de massas conforme descrito no protocolo do texto. Injete um microlitro de cada amostra no cromatógrafo a gás e registre o cromatograma. Por fim, monitore os cromatogramas de CG-EM para cada amostra e analise-os de acordo com o protocolo do fabricante.

Os pesos moleculares dos produtos das reações enzimáticas foram determinados utilizando um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massas. Para ácidos graxos com cadeias acila mais longas, a enzima OleT catalisa preferencialmente sua descarboxilação em olefinas de diferentes comprimentos. As amostras da reação de biotransformação foram analisadas por um cromatógrafo a gás equipado com um detector de ionização de chama.

A descarboxilação do ácido esteárico demonstrou ocorrer três vezes mais rápido do que a reação de hidroxilação, com 99% do ácido esteárico convertido em uma mistura na proporção de 3,3:1 de heptadecano para ácido 2-hidroxiesteárico. Uma vez dominada, a biocatálise acionada por luz pode ser realizada em algumas horas, desde que eu a execute corretamente. Na catálise fotossensibilizada, o desafio consiste em associar reações úteis à captação de luz.

No nosso caso, temos a luz dentro da molécula de FMN como fotossensibilizador e as ligamos à nossa enzima por meio de uma molécula transportadora, que é o peróxido de hidrogênio.