Reações Enzimáticas em Cascata para a Síntese de Aminoálcoois Quirais a partir de L-lisina

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar e purificar os Aminoácidos Quirais, que são compostos com uma ampla gama de aplicações, desde auxiliares quirais para síntese orgânica até terapia farmacêutica. Este é um medidor de rendimento para obter acesso ao aminoálcool quiral, derivado do aminoácido natural, lisina em duas ou três etapas enzimáticas em um procedimento de uma parte. As principais vantagens deste procedimento são a simplicidade do protocolo e a eficiência das etapas de purificação.

Demonstrando o processo estará Aurelie Fossey-Jouenne, a técnica do meu laboratório. Para sintetizar o derivado de lisina di-hidroxilado, adicione tampão hepes, l-lisina, ácido alpaquita glutárico, ascorbato de sódio e mais sal em um frasco erlenmyer de 250 ml. Em seguida, adicione água até um volume final de 10 ml, levando em consideração o volume da solução enzimática a ser adicionada.

Adicione a desoxigenase KD-01 a uma concentração final de 0,075 mg por ml. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente a 300 rpm pelo tempo apropriado. Após a mistura, transfira 10mcl da mistura de reação para um tubo ependorf de 1,5 ml.

Em seguida, adicione aquias solução de bicarbonato de sódio, etanol e 2,5 mg por ml de solução DNFB em etanol. Feche o microtubo e agite a solução por 1 hora a 1000 rpm e 65 graus Celsius. Quando terminar, use uma mini centrífuga para assentar a solução.

Tempere a mistura de reação com 10mcl de ácido hidrocróico 1M. Vortex a solução e, em seguida, use uma mini centrífuga para acalmá-la. Usando uma seringa de isca de 1 ml, filtre a mistura sobre um filtro de seringa não estéril de 4 mm de diâmetro, com uma membrana de fluoreto de polivinilideno hidrofílico de 0,22 mcm.

Em seguida, colocar a amostra da mistura de reacção derivada num instrumento de HPLC. Injete 10mcl na coluna C-18 Usando uma detecção UV, a 400 nanômetros para analisar o produto. Quando o monitoramento da reação indicar uma reação completa, adicione ácido alfaquita glutárico, ascorbato de sódio e mais sal ao frasco.

Adicione a desoxigenase KD-02 a uma concentração final de aparaoximato de 0,5 mg por ml. Calculado usando o volume de reação inicial. Agitar a mistura de reação à temperatura ambiente a 300 rpm, durante 18 horas.

Quando o monitoramento da reação indicar uma reação concluída, adicione 100mcl de 100 DTT milimolar à mistura de reação. Mais 100mcl de 100 PLP milimolar. Adicione a descarboxilase purificada Dccpin a uma concentração final aproximada de 0,5 mg por ml.

Calculado usando o volume de reação inicial. Em seguida, agite a mistura de reação à temperatura ambiente a 300 rpm por 18 horas. Quando a reação estiver completa, resfrie a mistura colocando o frasco em um banho de gelo.

Adicione cuidadosamente 0,25 ml de HCL 6 molar e agite suavemente a mistura de reação fria durante a adição. Agora, transfira a mistura acdic para um tubo de centrífuga de fundo cônico de 50ml, usando uma pipeta de pastagem de vidro. Centrifugue a mistura a 1.680 vezes a gravidade e 4 graus Celsius por 15 minutos.

Após centrifugação, transferir o sobrenadante para um balão de fundo redondo de 250 ml. Em seguida, adicione 10ml de água deionizada ao tubo da centrífuga que contém o pellet. Vórtice para ressuspender o pellet.

Depois de centrifugar a amostra, transferir o sobrenadante para o balão redondo de fundo, contendo o primeiro sobrenadante. Congelar os sobrenadantes recolhidos, emergindo do balão em azoto líquido com um giro manual constante. Transfira o frasco imediatamente para um liofilizador de bancada para evitar que o material descongele.

Após a conclusão do processo de liofilização, retire o balão do liofilizador e execute as etapas de purificação. Para a descarboxilação biocatalítica de mono-hidroxila L-lisinas, o DC de S Rumerentium exibiu atividade em relação a todas as mono-hidroxilisinas. Onde a melhor conversão observada para os três e cinco derivados das hidroxi-diaminas quirais correspondentes.

Como esperado, a dccpin acabou sendo a mais adequada para a descarboxilação de 4R-hidroxi-L-lisina 2. Em condições de reação padrão, a conversão de 3S-hidroxi-L-lisina 1 em sua contraparte descarboxilada 5, com DCcpin foi baixa. E nenhuma atividade foi observada em relação à 5R-hidroxi-L-lisina.

Para a descarboxiilação biocatalítica de desidroxi-L-lisinas, apenas 3R, 4R, di-hidroxi-L-lisina 3 foi quantitativamente convertido na di-hidroxi-diamina 7 correspondente sob as condições de reação padrão. A conversão de 45-di-hidroxi-L-lisina 8 foi moderada, mas foi melhorada com o aumento da carga enzimática. Nem o PLP-DC foi ativo em relação à 35-dihidroxi-L-lisina 9.

As reações enzimáticas em cascata exibindo conversão quantitativa, conforme determinado pelo monitoramento por HPLC, foram aumentadas com sucesso. Os aminoálcoois foram purificados a partir de misturas complexas de reações enzimáticas e excelentes rendimentos, e caracterizados por RMN. Uma vez dominada, esta síntese em cascata enzimática e subsequente purificação podem ser feitas em 48 horas se forem pré-formadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que uma boa oxigenação da reação maior é essencial para as reações dioxigenadas. Bem como um monitoramento cuidadoso, para garantir que toda a lisina seja consumida antes de adicionar a dicarboxidase. A principal desvantagem deste protocolo são as faixas limitadas subsidiadas da enzima dioxigenase e descarboxilase.

No entanto, a síntese biochatalítica de vários aminoácidos, a partir de aminoácidos, pode ser explorada usando um conjunto diferente de enzimas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma reação enzimática em cascata e como purificar aminoácidos a partir de misturas de reações complexas. Não se esqueça de que trabalhar com DNFB pode ser perigoso e precauções como usar equipamento de proteção individual e realizar a reação em uma capela de exaustão devem ser tomadas.