Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a integração de enxertos ósseos cranianos em termos de regeneração óssea e neovascularização, utilizando abordagens de imagem multmodal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da medicina regenerativa, como o acoplamento entre osteogênese e angiogênese. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma determinação tridimensional em alta definição da árvore vascular e permite o estudo do órgão completo. Demonstrar o procedimento será Doron Vic, um estudante de doutorado no meu laboratório, após a eutanásia de um camundongo Bab com sete a oito semanas de idade.

De acordo com o protocolo descrito, use uma máquina de cortar cabelo para raspar a região calvarial no sentido contrário ao crescimento dos pelos. Aplique isopropanol 70% no cadáver, incluindo a cabeça, para desinfetar. Em seguida, use um bisturi número 11 para cortar a pele do couro cabeludo e remova o periósteo utilizando uma broca dentária e uma ponteira com diâmetro interno de 4,5 milímetros.

Destaque um fragmento circular de osso calvarial. Transfira o fragmento ósseo para uma placa plástica de 100 milímetros contendo solução salina estéril. Neste momento, observe com pinça curva o sangue e o tecido mole aderidos ao fragmento ósseo.

Segure um fragmento ósseo por vez e use um aplicador de algodão para limpá-lo completamente, removendo qualquer tecido cerebral, tecido mole e sangue. Use tesoura fina para cortar delicadamente quaisquer lascas de osso que permaneçam presas ao enxerto, de modo que o enxerto tenha uma forma arredondada perfeita.

Mergulhe cada enxerto uma vez em um tubo de 15 mililitros contendo etanol a 70% e duas vezes em tubos de 15 mililitros contendo PBS para remover o etanol. Congele o aloenxerto em um congelador a menos 80 graus Celsius em tubos de criopreservação por pelo menos uma semana após o congelamento. Certifique-se de que o aloenxerto pareça transparente ao trabalhar com camundongos transgênicos receptores que expressam luciferase sob o controle do promotor de osteocalcina.

Após anestesiar um camundongo fêmea com sete a oito semanas de idade utilizando anestésicos injetáveis e verificar a sedação, use uma tesoura de corte contra o sentido do crescimento dos pelos para raspar a região calvarial. Aplique um agente depilatório para remover quaisquer resíduos de pelos e use gaze seca para removê-lo após não mais de dois minutos.

Em seguida, utilize gaze embebida em soro fisiológico para limpar a área. Desinfete o couro cabeludo aplicando clorexidina a 5% por via subcutânea. Injete cinco miligramas por quilograma de carprofeno diluído em 200 microlitros de soro fisiológico.

Aplicar pomada oftálmica para prevenir ressecamento e manter o animal sobre uma placa térmica em todo o momento. Em seguida, posicionar o animal sob o binóculo cirúrgico. Depois, utilizando tesoura fina e pinça, fazer um corte oval de um centímetro de comprimento na pele do couro cabeludo com a pinça.

Segure o periósteo e use uma tesoura fina para cortá-lo com uma broca dentária e uma broca de refinamento com diâmetro externo de cinco milímetros; faça o defeito calvarial dois milímetros anterior à sutura lambdoide para evitar a penetração da dura-máter. Fure até três quartos da espessura do osso e use uma espátula para destacar o fragmento ósseo. Uma etapa crítica do protocolo é a determinação da localização do defeito.

A lesão na sutura lambdoide levará a uma hemorragia maciça. Portanto, deve-se ter cuidado para não perturbar o durometro subjacente e o seio sagital superior. Para implantar um enxerto autólogo.

Utilize 10 mililitros de solução salina estéril em uma placa plástica de 10 milímetros para lavar o fragmento ósseo. Remova coágulos sanguíneos sem remover o tecido mole para implantar um enxerto alógeno descongelado previamente e normalize a amostra à temperatura ambiente. Em seguida, lave o fragmento ósseo com pinça curva.

Coloque o enxerto ósseo no defeito de modo que não toque nas margens do defeito. Em seguida, utilizando gel de fibrina, cole o enxerto ao osso hospedeiro. Suture a pele com fio Vicryl 4-0 e aplique iodo-povidona no corte cirúrgico.

Marque a orelha do camundongo e injete 0,25 miligramas por quilograma de anti sedan. Para reverter o efeito anestésico do meato. Realize os cuidados pós-operatórios de acordo com o protocolo descrito no texto.

Prepare a solução salina heparinizada pesando 2000 unidades de heparina sódica e transferindo para um tubo de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de solução salina estéril ao tubo e agite. Encha bem uma seringa de bloqueio com 20 mililitros com 15 mililitros de solução salina heparinizada aquecida e conecte a seringa a um conjunto venoso de couro cabeludo de calibre 23.

Fixe a seringa a uma bomba de infusão e configure a bomba para 10 mililitros a uma taxa de um mililitro por minuto. Após anestesiar um camundongo de acordo com o protocolo descrito no texto, confirme a sedação com um aperto no dedo da pata e posicione o camundongo firmemente sobre as costas em uma placa de fixação revestida com um forro absorvente.

Em seguida, corte a pele do abdômen até o pescoço. Corte a parede abdominal até o processo xifoide. Depois, corte a caixa torácica ao longo de sua face lateral, certificando-se de que o coração esteja totalmente exposto e de que o coração e os pulmões não estejam danificados.

Use um hemostato para retrair o esterno. Insira a agulha borboleta a três milímetros no ventrículo esquerdo. Em seguida, com cola de três segundos, fixe a agulha ao coração e à parede torácica. A inserção da agulha borboleta no ventrículo esquerdo é um procedimento delicado.

Tente evitar a inserção no ventrículo direito ou muito profundamente no ventrículo esquerdo, pois isso fará com que penetre na parede posterior do coração. Em seguida, ative imediatamente a bomba. Após um minuto, dissecar a veia cava inferior para despressurizar a vasculatura.

Incline a placa de modo que os fluidos escoem para longe da cabeça. Uma perfusão bem-sucedida resultará na clareza do fígado e dos vasos sanguíneos. Agora, perfunda 10 mililitros de formaldeído 4%.

Evitar a penetração de bolhas de ar na vasculatura. Quando a perfusão estiver completa, indicada pelo endurecimento da cauda, use 10 mililitros de solução salina heparinizada para lavar o formaldeído. Prepare o agente de contraste radio-opaco de acordo com as instruções do fabricante.

Por meio da mistura do diluente do composto e do agente de cura em um tubo plástico, perfundir o animal com o agente de contraste a uma taxa de um mililitro por minuto. As artérias coronárias, intestinais e hepáticas devem ficar amarelas quando a perfusão estiver completa. Cortar o tubo até a agulha de borboleta e envolver a carcaça em papel para evitar o vazamento da solução para a região calvarial.

Coloque o animal a quatro graus Celsius durante a noite para permitir a polimerização no dia seguinte. Para dissecar a região calvarial, use um bisturi para cortar a pele o mais lateral possível, evitando danificar a região craniana de interesse. Localize o enxerto ósseo e, em seguida, use tesoura fina para cortar o osso craniano a 10 milímetros de distância do enxerto.

Utilizando um scanner de microtomografia computadorizada. Defina o campo de visão em 20,5 milímetros, energia de raios X em 55 kVp, intensidade em 145 microampères, mil projeções por 360 graus e um tempo de integração de 200 milissegundos. Escaneie a amostra isolada de osso calvarial.

Observe as fatias reconstruídas em 2D geradas pelo software de micro-TC. Certifique-se de escanear adequadamente a região de interesse e, em seguida, localize o defeito calvarial. Se os vasos perfundidos forem facilmente identificáveis, utilize ácido tricloroacético a 6% diluído em água bidestilada.

Para descalcificar a amostra, reescaneie a amostra utilizando os mesmos parâmetros descritos anteriormente. Localize a sutura lambdoide nos cortes reconstruídos em 2D. Defina um volume de interesse cilíndrico, ou VOI, com dois milímetros de altura e diâmetro de oito milímetros, tangente à sutura.

Este é o sítio anatômico do defeito. Em seguida, segmente o osso a partir do tecido mole. Defina o limite inferior em 130 e aplique um filtro gaussiano 3D restrito para suprimir parcialmente o ruído nos volumes.

Gere uma reconstrução 3D. Certifique-se de que o VOI está corretamente posicionado utilizando o software IPL e o objeto DT. Com a função Peram, gere um mapa de espessura.

Essa função descreve o volume do vaso para cada diâmetro de vaso, realizando imagem e tomografia computadorizada microscópica. De acordo com o protocolo descrito no texto, como mostrado aqui, sete dias após a cirurgia, a tomografia computadorizada demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de diâmetro pequeno e médio que nutriam toda a área do enxerto em camundongos que receberam autotransplantes, em comparação com camundongos que receberam aloenxertos, nos quais os vasos pareciam penetrar a partir do exterior. Além disso, a imagem de fluorescência mostrou uma perfusão sanguínea significativamente maior nos animais tratados com autotransplante.

No dia 14, a árvore vascular no aloenxerto alcança toda a proximidade do enxerto. No entanto, o volume dos vasos foi significativamente menor em comparação com o grupo Autógraft. Essa diferença foi mais acentuada quando os vasos com diâmetros de 0,08 a 0,1 milímetro foram comparados, como visto aqui 28 dias após a cirurgia, o volume da vasculatura retornou ao nível basal sete dias após a cirurgia.

O grupo com autoenxerto demonstrou mineralização óssea significativamente maior, conforme observado por imagem de fluorescência utilizando uma sonda direcionada à hidroxiapatita. O osso formou-se por toda a proximidade do enxerto neste grupo, enquanto no grupo com aloenxerto formou-se apenas nas margens do defeito, como indicado por um formato em anel. Sessenta e cinco dias após a cirurgia, o volume ósseo foi significativamente maior e a espessura do enxerto foi significativamente maior nos animais que receberam autoenxertos em comparação com aloenxertos. Uma vez dominada, esta técnica cirúrgica pode ser realizada em cerca de 25 minutos. Após este procedimento, pode-se realizar imagem de fluorescência utilizando outras sondas para responder perguntas adicionais, por exemplo, atividades de osteoclastos e envolvimento da resposta imune.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imaginar a regeneração óssea na angiogênese subjacente.