Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a integração de enxertos ósseos cranianos em termos de regeneração óssea e neovascularização usando abordagens de imagem multimodais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa, como o acoplamento osteogênese e angiogênese. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma determinação 3D de alta definição dos três vasculares, e permite o estudo do órgão completo demonstrando o procedimento será Doron Vic, um estudante de doutorado em meu laboratório Depois de sacrificar sete a oito semanas de idade Bab sea mouse.

De acordo com o protocolo de texto, use uma máquina de cortar cabelo para raspar a região da calvária na direção contrária ao crescimento do cabelo. Aplique 70% de isopropanol na carcaça, cabeça para desinfetar. Em seguida, use um bisturi número 11 para cortar a pele do couro cabeludo e remova o periósteo usando uma broca dentária e um dente de 4,5 milímetros de diâmetro interno.

Separe um fragmento circular de osso da calvária. Transfira o fragmento ósseo para um prato de plástico de 100 milímetros contendo solução salina estéril. Neste ponto, observe o sangue e o tecido mole presos ao fragmento ósseo com uma pinça curva.

Segure um fragmento de osso de cada vez e use um aplicador com ponta de algodão para esfregá-lo completamente. Removendo qualquer tecido cerebral, tecido mole e sangue. Use uma tesoura fina para cortar suavemente quaisquer lascas de osso que permaneçam presas ao enxerto para que o enxerto tenha uma forma arredondada perfeita.

Mergulhe cada enxerto uma vez em um tubo de 15 mililitros contendo 70% de etanol e duas vezes em tubos de 15 mililitros contendo PBS para lavar o etanol. Congele o aloenxerto em um freezer de 80 graus Celsius negativos em tubos criogênicos por pelo menos uma semana após o congelamento. Certifique-se de que o aloenxerto pareça transparente trabalhando com camundongos transgênicos receptores que expressam luciferase sob o controle do promotor da osteocalcina.

Depois de anestesiar um camundongo fêmea de sete a oito semanas usando anestésicos injetáveis e verificar a sedação. Use uma máquina de cortar cabelo na direção oposta ao crescimento do cabelo para raspar a região da calvária. Aplique um depilatório para remover quaisquer restos de pêlo e use gaze seca para limpá-lo depois de não mais de dois minutos.

Em seguida, use gaze embebida em solução salina para limpar a área. Desinfete o couro cabeludo aplicando 5% de clorexidina por via subcutânea. Injete cinco miligramas por quilograma de carprofeno diluído em 200 microlitros de solução salina.

Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento e mantenha o animal em uma almofada térmica o tempo todo. Em seguida, posicione o animal sob os binóculos de operação. Em seguida, usando uma tesoura fina e uma pinça, faça um corte oval de um centímetro de comprimento na pele do couro cabeludo com uma pinça.

Segure o periósteo e use uma tesoura fina para cortá-lo com uma broca odontológica e um diâmetro externo de cinco milímetros para refinar o defeito da calvária dois milímetros antes da sutura lambdoide para evitar a penetração da dura-máter. Perfure três quartos do caminho no osso e use uma espátula para destacar o fragmento ósseo. Uma etapa crítica no protocolo é o término da localização do defeito.

A lesão na sutura laboral levará a sangramento maciço. Portanto, deve-se tomar cuidado para não interromper o durômetro subjacente e o sagital superior. Para implantar um auto-enxerto

Use 10 mililitros de solução salina estéril em uma placa de plástico de 10 milímetros para lavar o fragmento ósseo. Remova os coágulos sanguíneos sem remover o tecido mole para implantar um aloenxerto, descongele com antecedência e normalize a amostra à temperatura ambiente. Em seguida, lave o fragmento ósseo com uma pinça curva.

Coloque o enxerto ósseo no defeito para que não toque nas margens do defeito. Em seguida, usando gel de fibrina, cole o enxerto no osso hospedeiro. Suturar a pele com quatro suturas de Vicryl e aplicar iodopovidona no corte cirúrgico.

Marque a orelha do rato e injete 0,25 miligramas por quilograma anti-sedan. Para reverter o efeito anestésico do meato. Realizar os cuidados pós-operatórios de acordo com o protocolo de texto.

Prepare solução salina heparinizada pesando 2000 unidades de heparina sódica e transferindo para um tubo de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de solução salina estéril ao tubo e agite. Encha uma seringa de 20 mililitros com 15 mililitros de solução salina heparinizada aquecida e conecte a seringa a um conjunto de veias do couro cabeludo de calibre 23.

Fixe a seringa em uma bomba de seringa e ajuste a bomba para 10 mililitros a um mililitro por minuto. Depois de anestesiar um mouse de acordo com o protocolo de texto, confirme a sedação com uma pitada no dedo do pé e prenda o mouse. Está de costas para uma placa de fixação envolvida com um revestimento de superfície absorvente.

Em seguida, corte a pele do abdômen ao pescoço. Corte a parede abdominal até o processo xifóide. Em seguida, corte a caixa torácica ao longo de seu aspecto lateral, certificando-se de que o coração esteja totalmente exposto e o coração e os pulmões não estejam danificados.

Use um hemostático para retrair o esterno. Insira a agulha borboleta três milímetros no ventrículo esquerdo. Em seguida, com três segundos de cola, cole a agulha no coração e na parede torácica A inserção da agulha borboleta no ventrículo esquerdo é um procedimento delicado.

Tente evitar a inserção no ventrículo direito ou muito profundamente no ventrículo esquerdo, pois ele penetrará na parede posterior do coração. Em seguida, ative imediatamente a bomba. Após um minuto, dissecar o AVC da veia inferior para despressurizar a vasculatura.

Incline a prancha para que os fluidos fluam para longe da cabeça. A perfusão bem-sucedida resultará em uma limpeza do fígado e dos vasos sanguíneos. Agora perfundido 10 mililitros de 4% de formaldeído.

Evitar a penetração de bolhas de ar na vasculatura. Quando a perfusão estiver completa, conforme indicado por um enrijecimento da cauda, use 10 mililitros de solução salina heparinizada para eliminar o formaldeído. Prepare o agente de contraste radiopaco de acordo com as instruções do fabricante.

Misturando o diluente composto e o agente de cura em um tubo de plástico, perfundir o animal com o agente de contraste a uma taxa de um mililitro por minuto. As artérias intestinal e hepática coronárias devem ficar amarelas quando a perfusão estiver completa. Corte o tubo na agulha borboleta e embrulhe a carcaça em papel para evitar vazamento da solução para a região da calvária.

Coloque o animal a quatro graus Celsius durante a noite para permitir a polimerização no dia seguinte. Para dissecar a região da calvária, use um bisturi para cortar a pele o mais lateral possível, evitando danificar a região craniana de interesse. Localize o enxerto ósseo e, em seguida, use uma tesoura fina para cortar o osso craniano a 10 milímetros de distância do enxerto.

Usando um scanner de micro CT. Defina o campo de visão para 20,5 milímetros, energia de raios-x para 55 KVP, intensidade para 145 microamperes, mil projeções por 360 graus e um tempo de integração de 200 milissegundos. Escaneie a amostra isolada de osso da calvária.

Observe os cortes reconstruídos em 2D que foram gerados pelo software de micro TC. Certifique-se de escanear a região de interesse corretamente e, em seguida, localize o defeito da calvária. Se os vasos perfundidos forem facilmente identificáveis, use ácido tricloroacético a 6% diluído em água bidestilada

Para descalcificar a amostra, digitalize novamente a amostra usando os mesmos parâmetros que acabamos de descrever. Localize a sutura lambdoide nas fatias 2D reconstruídas. Defina um volume cilíndrico de interesse ou VOI de dois milímetros de altura e com diâmetro de oito milímetros que seja tangencial à sutura.

Este é o local anatômico do defeito. Em seguida, segmentar o osso do tecido mole. Defina o limite inferior para 130 e aplique um filtro gaussiano 3D restrito para suprimir parcialmente o ruído nos volumes.

Gere uma reconstrução 3D. Certificando-se de que o VOI esteja posicionado corretamente usando o software IPL e o objeto DT. A função Peram gera um mapa de espessura.

Esta função descreve o volume do vaso para cada diâmetro de vaso, realizar imagens e microtomografia computadorizada. De acordo com o protocolo de texto, como mostrado aqui, sete dias após a cirurgia, a tomografia computadorizada demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de pequeno e médio diâmetro que nutriram toda a área do enxerto em camundongos que receberam autógrafos, em oposição aos camundongos que receberam aloenxertos onde os vasos pareciam penetrar de fora. Além disso, a imagem de fluorescência mostrou perfusão sanguínea significativamente maior em animais tratados com autógrafos.

No dia 14, a árvore vascular no aloenxerto atinge todas as proximidades dos enxertos. No entanto, o volume do vaso foi significativamente menor em comparação com o grupo Autographt. Essa diferença foi mais proeminente quando os vasos com diâmetros de 0,08 a 0,1 milímetros foram comparados, como visto aqui 28 dias após a cirurgia, o volume da vasculatura retornou à linha de base sete dias após a cirurgia.

O grupo autoenxerto demonstrou mineralização óssea significativamente maior, conforme visto por imagem de fluorescência usando uma sonda direcionada por hidroxiapatita. O osso se formou em toda a proximidade do enxerto neste grupo, enquanto se formou apenas nas margens do defeito no grupo do aloenxerto, marcado por uma forma de anel 56 dias após a cirurgia, o volume ósseo foi significativamente maior e a espessura do enxerto foi significativamente maior nos animais que receberam autógrafos versus aloenxertos. Uma vez dominada, esta técnica cirúrgica pode ser feita em cerca de 25 minutos. Após este procedimento, imagens de fluorescência usando outros probs podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, por exemplo, atividades de osteoclastos e envolvimento da resposta imune.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens da regeneração óssea na angiogênese subjacente.