Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito

O objetivo geral deste procedimento é tratar embriões de peixe-zebra com nitrito e determinar seu efeito teratogênico. Este método pode ajudar a responder a algumas das questões-chave no campo da toxicologia do desenvolvimento, como avaliar os efeitos teratogênicos de produtos químicos no desenvolvimento embrionário. A principal vantagem deste procedimento é que ele usa embriões de peixe-zebra que se desenvolvem externamente e podem ser observados ao microscópio.

Para os experimentos demonstrados aqui, mantenha linhagens de peixe-zebra do tipo selvagem, como a cepa de Tuebingen, a 28,5 graus Celsius e um ciclo claro-escuro de 14 horas e 10 horas, respectivamente. Na noite anterior à colheita dos ovos, adicione água de peixe e divisórias em tanques de acasalamento e coloque peixes machos e fêmeas em lados separados da divisória. Para garantir que ovos suficientes sejam produzidos, monte 30 pares de peixes.

Na manhã seguinte, depois que as luzes se acenderem, remova as divisórias para iniciar o acasalamento. Verifique os tanques de acasalamento em busca de ovos a cada 15 minutos. Assim que os peixes botarem ovos, use uma peneira de chá para colher os embriões e combine-os em um recipiente grande com tampão E3.

Incube os ovos a 28,5 graus Celsius. Às 1,5 horas após a fertilização, ou HPF, sob um microscópio de dissecação, use uma pipeta de transferência de plástico para descartar os óvulos não fertilizados que parecerão opacos. Transfira 50 embriões cada para placas de Petri de vidro de 100 por 15 milímetros contendo 50 mililitros de tampão E3 em triplicado para cada condição de tratamento.

Por exemplo, para 11 condições de tratamento, prepare 33 pratos de 50 embriões cada. Para três placas de Petri de embriões a 2 HPF, remova o tampão E3 e adicione 50 mililitros de etanol 300 milimolar diluído em tampão E3. Cubra os pratos com parafilme para minimizar a evaporação do etanol.

Incube os embriões no tampão etanol por 22 horas a 28,5 graus Celsius, depois remova a solução e use o tampão E3 para lavar o etanol, girando o prato várias vezes. Repita a lavagem mais duas vezes. Para 3 placas de Petri de embriões em 2 HPF remover o E3 e substituir por 50 mililitros de E3 fresco. Para nove placas de Petri a 2 HPF, remova o E3 e adicione 50 mililitros de 1.000 miligramas por mililitro de nitrito de sódio dissolvido em E3 e incube a 28,5 graus Celsius, substituindo a solução de nitrito de sódio diariamente.

Após 46 horas, remova três das nove placas de nitrito de sódio, remova a solução e use tampão E3 para lavar as placas três vezes. 24 horas depois, remova três placas diferentes de nitrito de sódio do incubador, remova a solução e use tampão E3 fresco para lavar os embriões três vezes. 24 horas depois, execute etapas de lavagem semelhantes para as últimas três placas.

Em seguida, para outro conjunto de três placas de Petri, substitua o tampão E3 por 200 miligramas por mililitro de nitrito de sódio e, em seguida, configure grupos de três placas de 50 embriões cada uma com 400, 600, 800 e 1.000 miligramas por mililitro de nitrito de sódio. Incubar os embriões por 70 horas, repondo a solução de nitrito de sódio diariamente. Após a incubação, remova a solução das placas e use tampão E3 para lavar as placas três vezes.

Para outras três placas de Petri de embriões, substitua o tampão E3 por 50 mililitros de 1.000 miligramas por mililitro de nitrato de sódio no tampão E3. Após expor os embriões por 70 horas, use E3 para lavar os embriões conforme demonstrado anteriormente. Durante cada dia de exposição, sob um microscópio estéreo, conte o número de embriões mortos, procurando falta de batimentos cardíacos e circulação sanguínea ou falta de mobilidade após um minuto de observação.

Remova os embriões mortos. Ao final dos experimentos, para eutanasiar as larvas, use uma pipeta de transferência para remover o tampão E3, adicione 50 mililitros de 0,2%MS-222 e incube por 10 minutos. Após uma lavagem E3 para remover o MS-222, deixando algum volume para pipetar adequadamente o embrião, adicione as larvas a 4% de PFA, gire o prato várias vezes e use uma pipeta de transferência para colocar as larvas em um frasco de vidro com PFA suficiente para encher o frasco.

Em seguida, fixe as larvas na geladeira durante a noite. Após a fixação, use um estereoscópio e uma câmera digital com aumento de 30X para tirar fotos das larvas. Oriente as larvas de modo que a anterior fique para a esquerda e a superfície dorsal fique no topo do campo.

A exposição ao etanol 300 milimolar por 22 horas não teve efeito sobre a sobrevida, consistente com resultados anteriores. Como mostrado aqui, os fenótipos observados incluíram edema pericárdico e não insuflação da bexiga natatória. Defeitos cranianos faciais e atraso no desenvolvimento também foram observados e não são mostrados aqui.

O tratamento com nitrito de sódio resultou em efeitos leves a graves na sobrevida, dependendo da concentração, com concentrações mais altas de nitrito de sódio resultando em menores taxas de sobrevivência. Esta figura ilustra que em concentrações mais altas, como 1.000 miligramas por mililitro, tempos de incubação mais longos também têm um impacto mais severo na sobrevivência. Finalmente, como mostrado aqui, ao contrário dos peixes tratados com nitrato, as larvas tratadas com nitrito têm defeitos de desenvolvimento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 3 horas e é importante lembrar de remover os embriões diariamente para minimizar a contaminação. Após este procedimento, outros métodos, como a hibridização in situ, podem ser realizados para avaliar a expressão gênica. Esta técnica é uma comunhão para os pesquisadores explorarem os potenciais teratogênicos de produtos químicos no desenvolvimento do peixe-zebra.