Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish
25 de agosto de 2019
Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.
Os procedimentos de teste de toxicidade serão demonstrados pelo Dr. Ashok Aspatwar, um pesquisador sênior do meu laboratório. Nosso protocolo identifica efeitos fora do alvo e detecta efeitos tóxicos sutis de produtos químicos na fase inicial da descoberta que podem ser perdidos na cultura celular ou outros modelos animais. As principais vantagens de nossa técnica são: é rápida e eficiente, requer uma quantidade muito pequena de produtos químicos, e as instalações básicas do laboratório.
O rastreamento de toxicidade nos ajudará a decidir a concentração para estudar sua eficiência contra a micobacterium que causa a tuberculose e para um cálculo pré-clínico. Este método utiliza insights sobre efeitos fora do alvo de produtos químicos e, portanto, este método pode ser usado em qualquer área de pesquisa onde a toxicidade da química é de importância primária. Este método é muito simples e pode ser realizado por qualquer pessoa sem experiência prévia.
Indivíduos sem experiência devem planejar o experimento cuidadosamente e usar apenas um composto. Este método fornece efeitos tóxicos dos produtos químicos na forma de alterações fenotípicas nos embriões de zebrafish em desenvolvimento e, portanto, a segurança dos compostos testados. Para começar, coloque de dois a cinco zebrafish machos adultos e três a cinco zebrafish fêmeas adultas em tanques de acasalamento durante a noite.
Pela manhã, acenda a luz à medida que a reprodução é induzida pelo ciclo automático de luz escura e subsequente. Para evitar o tratamento do estresse aos animais, permita que os animais descansem por duas semanas antes de usar os mesmos indivíduos para reprodução. No dia seguinte antes do meio-dia, colete os embriões usando um coador de malha fino, e transfira-os para uma placa de petri contendo meio de embrião E3.
Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo para examinar cada lote de embriões. Identifique a aparência opaca e remova-as como embriões não fertilizados ou mortos. Mantenha os embriões a 28,5 graus Celsius em uma incubadora durante a noite.
Na manhã seguinte, examine os embriões sob um microscópio estéreo e remova quaisquer embriões insalubres ou mortos. Use cuidadosamente uma pipeta pasteur para transferir um embrião para cada poço de uma placa de 24 poços. Certifique-se de que cada poço contém meio E3 suficiente para cobrir os embriões.
Tire os frascos que contêm compostos inibidores armazenados a 4 graus Celsius em uma geladeira. Use um equilíbrio analítico para pesar a quantidade apropriada do composto e prepare 250 microliters de 100 mililitros de solução de estoque para cada composto em meio E3 ou outro solvente apropriado. Em seguida, use o meio E3 para fazer diluições seriais das soluções de estoque baseadas em níveis de toxicidade em tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Dos poços que cada um contém um embrião DPF, use uma pipeta pasteur e uma pipeta de 1 mililitro para remover a água E3 uma linha de cada vez. Distribua imediatamente 1 mililitro de cada diluído das soluções de estoque nos poços da placa de 24 poços a partir do baixo e movendo-se para maior concentração. Para os grupos de controle, adicione água E3 ou outro solvente relevante.
Rotule 24 placas de poço com o nome e concentração do composto e mantenha as placas a 28,5 graus Celsius em uma incubadora. Tome cuidado para que os diluentes dos produtos químicos nos poços não seja evaporado na incubadora selando as laterais de 24 placas de poço. Vinte e quatro horas após a exposição dos compostos químicos, use uma pipeta pasteur para transferir as larvas expostas a cada concentração do composto em uma pequena placa de petri contendo celulose de metila de 3% de alto peso molecular.
Com uma sonda de metal, coloque-a de lado. Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo ligado a uma câmera. Tire as imagens e salve as imagens em uma pasta separada a cada dia até o final do experimento.
Digite todas as observações em uma tabela todos os dias, seja em uma mesa online ou em uma folha impressa. Para exposição a compostos neurotóxicos, as quatro a cinco larvas DPF podem mostrar padrão de natação anormal. Nesse caso, faça um registro de tais mudanças capturando um curto vídeo de 30 segundos a um minuto das larvas.
Após cinco dias de exposição aos compostos químicos, note a concentração em que metade dos embriões morrem como a concentração letal meio máxima 50 de cada produto químico. Construa uma curva para mortalidade de embriões para todas as concentrações utilizando um programa adequado. Neste protocolo, a parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou múltiplos compostos químicos em um único experimento.
Para os compostos que induzem quaisquer defeitos fenotípicos nas larvas, os defeitos foram registrados a cada 24 horas durante o período de um a cinco dias após a exposição ao produto químico. Os embriões tratados com inibidores beta CA nas concentrações de 250 micromolares e 125 micromolars apresentam vários defeitos fenotípicos em comparação com o controle. Por exemplo, embriões não-esques mesmo no dia 3, estrutura corporal curva, saco de gema não usado e edema pericárdico, e ausência de sacos de otolito nas larvas cinco dias após o tratamento.
Em outro estudo, os embriões tratados com inibidores de CA mostraram a ausência de sacos de otolito e bexiga de natação. Os experimentos identificaram um composto representativo de anidrato 9, que induziu alterações fenotípicas mínimas ou não durante o desenvolvimento embrionário a 500 micromolar. O composto mostrou alta concentração de LC50.
No entanto, em comparação com um controle, o mesmo composto em 300 micromolar foi encontrado como neurotóxico e induziu ataxia nas larvas após cinco dias de exposição. Boa qualidade dos embriões são importantes para a triagem de toxicidade de produtos químicos. Para obter embriões de boa qualidade, use um par jovem de zebrafish adulto para reprodução.
Os compostos que emergem como seguros podem ser ainda mais caracterizados pela realização de experimentos in vitro e in vivo relevantes. No campo do desenvolvimento de drogas antituberculose, essa técnica ajudou a criar mais experimentos para incobadão in vivo de mycobacterium marinum em embriões de zebrafish. O protocolo envolve o uso de produtos químicos que podem ser tóxicos para os humanos.
As pessoas envolvidas nos experimentos devem tomar os devidos cuidados ao manusear os produtos químicos.
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Visão Geral
Embriões de peixe-zebra são utilizados para testes de toxicidade de compostos químicos devido ao seu desenvolvimento externo e sensibilidade a produtos químicos. Este método permite a detecção de alterações fenotípicas sutis com uso mínimo do composto, tornando-o um sistema de teste eficiente e economicamente viável.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Toxicologia
- Neurociência
- Farmacologia
Antecedentes
- Os embriões de peixe-zebra são ideais para avaliar a toxicidade de substâncias químicas.
- Eles se desenvolvem externamente, proporcionando uma visão clara das alterações fenotípicas.
- Pequenas quantidades de substâncias químicas podem ser testadas diretamente nos embriões.
- Essa abordagem pode identificar efeitos inespecíficos frequentemente negligenciados em outros modelos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um protocolo rápido e eficiente de teste de toxicidade.
- Identificar efeitos tóxicos sutis de substâncias químicas nas fases iniciais de descoberta.
- Auxiliar na determinação de concentrações para estudos posteriores contra patógenos.
Métodos Utilizados
- Aplicação direta de compostos químicos a embriões de peixe-zebra.
- Observação de alterações fenotípicas para avaliar a toxicidade.
- Utilização de instalações laboratoriais básicas para testes.
- Triagem para efeitos colaterais de produtos químicos.
Resultados Principais
- O método é simples e pode ser realizado sem experiência prévia.
- Ele identifica efetivamente os efeitos fora do alvo de produtos químicos.
- Resultados rápidos facilitam decisões rápidas para estudos posteriores.
- Aplicável em diversas áreas de pesquisa onde a toxicidade química é crucial.
Conclusões
- Os embriões de peixe-zebra fornecem um modelo valioso para testes de toxicidade.
- O método aumenta a eficiência da avaliação química em estágios iniciais.
- Ele pode ser adaptado para diversas aplicações de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A triagem de toxicidade em embriões de peixe-zebra permite a detecção precoce de efeitos tóxicos inespecíficos e sutis na descoberta de fármacos, reduzindo a eliminação em estágios avançados. O método possibilita a avaliação rápida de compostos com baixo volume, melhorando a eficiência de capital e a confiança preditiva na seleção de candidatos promissores. É particularmente valioso para priorizar compostos em programas de descoberta de agentes antituberculose e outros direcionados a patógenos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao revelar defeitos fenotípicos associados à exposição ao composto.
- Valor Operacional: Requer apenas 3–6 mg do composto, permitindo a triagem de moléculas valiosas ou de fornecimento limitado.
- Valor Preditivo: Detecta neurotoxicidades e toxicidades desenvolvimentais não identificadas em culturas celulares, aprimorando a redução de riscos do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de CL50 e leituras fenotípicas com resolução temporal para modelagem de resposta à dose.
- Valor Operacional: Utiliza infraestrutura padrão de estereomicroscopia e incubadora, não exigindo equipamentos especializados.
- Escalabilidade: Testa múltiplas concentrações em uma única placa de 24 poços, permitindo campanhas de triagem de média produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona achados iniciais de toxicidade com validação subsequente in vivo, como estudos de inibição de mycobacterium marinum.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Identifica compostos com mínima perturbação fenotípica (por exemplo, anidrase carbônica 9 a 500 µM) para progressão.
- Alinhamento de Biomarcadores: Pontos finais fenotípicos como edema pericárdico e inflação da bexiga natatória funcionam como indicadores de toxicidade translacionáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta para orientar a otimização do composto líder e a seleção de candidatos pré-clínicos, especialmente quando a disponibilidade do composto é limitada.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste de hipóteses sobre fenótipos de desenvolvimento e neurotoxicidade induzidos por compostos.
- Triagem: Oferece pontuação reprodutível de mortalidade e defeitos subletais entre 1 e 5 dias após a fertilização.
- Análises: Fornece cálculos de CL50 e perfis temporais de defeitos para classificação comparativa de compostos.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade de modelos de toxicidade embrionária até modelos de inibição de patógenos em organismo inteiro.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um ponto de verificação padronizado e de baixo recurso para toxicidade, aplicável em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao capturar perfis de toxicidade em organismos inteiros.
- Valor Operacional: Conclui em 8 a 10 horas por execução, permitindo iterações rápidas nas fases de acerto para liderança.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir ou não ao identificar precocemente toxicidades inaceitáveis, reduzindo riscos biológicos nos portfólios.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco, direcionando recursos a compostos com perfis de segurança mais limpos.
Considerações de Implementação
- Exige conhecimentos básicos em manejo de zebrafish e manipulação de embriões.
- Requer estereomicroscópio, incubadora a 28,5°C e material de laboratório padrão (placas de 24 poços, pipetas de Pasteur).
- Exige estadiamento consistente dos embriões e análise cega para garantir a confiabilidade dos dados entre diferentes usuários.
- É necessário considerar a solubilidade do composto e os controles de solvente na série de diluições.
- Limita-se à avaliação de toxicidade aguda; efeitos crônicos ou específicos de órgãos exigem modelos complementares.
