Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

O objetivo geral do método qPCR é avaliar a carga viral do herpesvírus-2 equino em amostras biológicas de equinos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de diagnóstico de doenças respiratórias em cavalos, dados quantitativos sobre novos recursos interpretativos para profissionais. A principal vantagem desta técnica é que ela é sensível, específica e um método rápido.

Outra vantagem é o desenvolvimento de acordo com a norma AFNOR NF U47-600, que é o representante francês no comitê internacional de normalização. Demonstrando o procedimento estará Erika Hue, uma jovem pesquisadora da minha unidade. Para extrair ácidos nucléicos de uma amostra biológica de fluidos respiratórios, sob uma capela de exaustão, comece adicionando 140 microlitros de amostra biológica a 560 microlitros de solução de lise e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Adicione 560 microlitros de etanol à amostra e aplique 630 microlitros da solução total em uma coluna de sílica e centrífuga. Aplique os 630 microlitros restantes na coluna de sílica e centrifugue novamente. Depois que a amostra for aplicada à coluna, use 500 microlitros cada um dos tampões de lavagem AW1 e AW2 para lavar a coluna duas vezes.

Em seguida, para eluir os ácidos nucléicos da coluna, adicione 50 microlitros de eluição à temperatura ambiente ou tampão AVE. Feche a tampa e incube em temperatura ambiente por um minuto. Centrifugar então a 6 000 gs durante um minuto.

Para amplificar o DNA, após titular os primers e a sonda de acordo com o protocolo de texto, prepare 22,5 microlitros de mistura de reação para cada reação adicionando 12,5 microlitros de mistura mestre de PCR, 20 primers micromolares diretos e reversos, 10 micromolares da sonda e água ultrapura suficiente conforme necessário para atingir 22,5 microlitros. Para evitar contaminação, sempre prepare a mistura de reação de PCR em uma área específica. Alíquota de 22,5 microlitros da mistura de reação apropriada para cada poço de reação de uma placa de 96 poços.

Incluir controlos negativos para extração e PCR para garantir que nenhum dos reagentes está contaminado com ADN indesejado. Em seguida, adicione 2,5 microlitros da amostra, do controle negativo de extração, do controle negativo de PCR ou da amostra de controle positivo aos poços de reação correspondentes. Em seguida, use um selo de placa adesiva para cobrir a placa.

E centrifugue a 6.000 gs por 10 segundos. Coloque a placa em um sistema de PCR em tempo real. Em seguida, selecione o modelo para o layout do ensaio e as configurações do programa de PCR mostradas aqui e inicie a execução.

Depois de transferir os dados brutos do sistema de PCR em tempo real para uma planilha, defina o limite nos gráficos de amplificação acima da linha de base e dentro da região de crescimento exponencial para obter o ciclo de limite para cada amostra. Plote cada ponto padrão definido como uma curva padrão para obter linearidade. Em seguida, calcule o número de cópias para as diferentes amostras com base na curva padrão.

Para determinar o limite de detecção dos resultados do qRT-PCR, dispense 90 microlitros de água ultrapura em seis tubos. Para preparar seis diluições seriais de dez vezes do plasmídeo para atingir a zona de redução, comece transferindo 10 microlitros da diluição de trabalho do plasmídeo para o tubo com 90 microlitros de água ultrapura. Um breve vórtice e centrifugue o tubo.

Em seguida, transfira 10 microlitros do tubo para o próximo tubo de água. Após o vórtice e a centrifugação, repita a transferência até que todos os tubos de água recebam o plasmídeo. Depois de amplificar o DNA nas seis diluições seriais de dez vezes, conforme descrito anteriormente neste vídeo, determine a zona de redução, que é a última diluição do plasmídeo que produz um sinal positivo e a primeira diluição sem a detecção.

Para preparar seis diluições seriais duplas, dispense 25 microlitros de água ultrapura em seis tubos. A partir da última diluição do plasmídeo que deu um sinal positivo das diluições dez vezes, transfira 25 microlitros do tubo para o primeiro tubo de água. Vortex e centrifugue antes de preparar as cinco diluições restantes, conforme demonstrado.

Amplifique o DNA das diluições seriais duplas, conforme descrito anteriormente neste vídeo. Depois de amplificar o DNA dos três ensaios independentes, calcule o número de réplicas positivas de 24 réplicas para cada nível de concentração de plasmídeo. Determine o LOD com uma confiança de 95% ou LOD 95% PCR, que é o nível que resulta na detecção de 23 réplicas positivas de 24 réplicas.

Para determinar o LOD do método: Prepare cinco diluições seriais duplas, começando com 25 microlitros da diluição de trabalho do plasmídeo, que é quatro vezes mais concentrada do que a última concentração de uma diluição de dez vezes que deu um sinal positivo. O plasmídeo usado na etapa de amplificação vem de uma diluição de trabalho do plasmídeo preparada em uma área específica para evitar contaminação. É um passo crítico.

Transferir 5 microlitros de cada diluição de plasmídeo para quatro tubos com 135 microlitros do material de recurso negativo para obter quatro réplicas dos cinco padrões positivos. Efectuar a extracção dos quatro replicados para os cinco padrões positivos e efectuar o procedimento de amplificação conforme descrito anteriormente neste vídeo. Contar o número de réplicas positivas em oito réplicas para cada nível de concentração de plasmídeos.

Finalmente, determine o método LOD, que é o último nível em que oito réplicas de oito réplicas são positivas. O método quantitativo de RT-PCR descrito neste vídeo detecta e quantifica o herpesvírus-2 equídeo em fluidos respiratórios. Neste experimento, diluições seriais de dez vezes foram feitas para estimar a zona de redução, que fica entre as diluições 10 elevado a 9 negativo e 10 elevado a 10 negativo.

O valor de PCR LOD foi determinado com uma nova diluição serial dupla na zona de redução. Para determinar a faixa de linearidade e o LOQ PCR O valor de LOD PCR foi usado para iniciar o intervalo de seis diluições seriais de dez vezes entre 2,6, o valor de LOD PCR e 260.000 cópias por 2,5 microlitros de amostra. O LOQ PCR é a concentração mais baixa na faixa de linearidade.

A caracterização de todo o método é a validação de todas as etapas necessárias para a obtenção de dados de qRT-PCR desde a extração do DNA da amostra respiratória, até a amplificação e quantificação do alvo. O desempenho quantitativo do método analítico qRT-PCR foi avaliado e validado com um perfil de acurácia representado neste gráfico. As cargas do genoma viral do EHV2 em 172 amostras de swab nasal de cavalos com distúrbios respiratórios foram quantificadas conforme mostrado aqui.

As cargas do genoma viral foram maiores em cavalos jovens, com a maior carga detectada em 1,9 vezes 10 elevado a 11 cópias por mililitro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de duas horas por etapa de amplificação, e o total de etapas de validação pode ser realizada em menos de quatro semanas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar o risco de contaminação, principalmente ao trabalhar com uma solução de plasmídeo.

Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identificação do genoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a extração e amplificação do DNA e caracterizar suas reservas de PCR. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas como patógenos pode ser extremamente perigoso.

Alguns cuidados, como trabalhar com capuz e uma área de nível de segurança adaptada, devem sempre ser tomados durante a execução deste procedimento.