Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

O objetivo geral do método de PCR em tempo real é avaliar a carga viral do herpesvírus equino-2 em amostras biológicas de cavalos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas diagnósticas de doenças respiratórias em cavalos, fornecendo dados quantitativos sobre novos auxílios interpretativos para clínicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é sensível, específica e rápida.

Outra vantagem é o desenvolvimento de acordo com a norma AFNOR NF U47-600, que é o representante francês no comitê internacional de normalização. Demonstrará o procedimento Erika Hue, uma jovem pesquisadora da minha unidade. Para extrair ácidos nucleicos de uma amostra biológica de fluidos respiratórios, sob uma capela de exaustão, comece adicionando 140 microlitros de amostra biológica a 560 microlitros de solução de lise e incube à temperatura ambiente por 10 minutos.

Adicione 560 microlitros de etanol à amostra e aplique 630 microlitros da solução total em uma coluna de sílica e centrifugue. Aplique os 630 microlitros restantes na coluna de sílica e centrifugue novamente. Após a aplicação da amostra na coluna, use 500 microlitros de cada um dos tampões de lavagem AW1 e AW2 para lavar a coluna duas vezes.

Em seguida, para eluir os ácidos nucleicos da coluna, adicione 50 microlitros de tampão de eluição ou AVE em temperatura ambiente. Feche a tampa e incube em temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, centrifugue a 6.000 ×g por um minuto.

Para amplificar o DNA, após a titulação dos iniciadores e sonda de acordo com o protocolo descrito, prepare 22,5 microlitros de mistura de reação para cada reação, adicionando 12,5 microlitros de mistura mestra de PCR, iniciadores direto e reverso a 20 micromolar, sonda a 10 micromolar e quantidade suficiente de água ultra-pura conforme necessário para atingir 22,5 microlitros. Para evitar contaminação, prepare sempre a mistura de reação de PCR em uma área específica. Aliquotar 22,5 microlitros da mistura de reação apropriada em cada poço de uma placa de 96 poços.

Inclua controles negativos para extração e PCR para garantir que nenhum dos reagentes esteja contaminado com DNA indesejado. Em seguida, adicione 2,5 microlitros da amostra, do controle negativo de extração, do controle negativo de PCR ou da amostra controle positiva aos poços de reação correspondentes. Depois, use um selo adesivo para placas para cobrir a placa.

Em seguida, centrifugue a 6.000 ×g por 10 segundos. Coloque a placa em um sistema de PCR em tempo real. Então, selecione o modelo para o delineamento do ensaio e as configurações do programa de PCR mostradas aqui e inicie a corrida.

Após transferir os dados brutos do sistema de PCR em tempo real para uma planilha, ajuste o limiar nos gráficos de amplificação acima da linha de base e dentro da região de crescimento exponencial para obter o ciclo de limiar de cada amostra. Plote cada conjunto de pontos padrão como uma curva padrão para obter linearidade. Em seguida, calcule o número de cópias para as diferentes amostras com base na curva padrão.

Para determinar o limite de detecção dos resultados de qRT-PCR, distribua 90 microlitros de água ultra-pura em seis tubos. Para preparar seis diluições seriadas de dez vezes do plasmídeo com o objetivo de atingir a zona de abatimento, comece transferindo 10 microlitros da diluição trabalhista do plasmídeo para o tubo contendo 90 microlitros de água ultra-pura. Vortexe brevemente e centrifugue o tubo.

Em seguida, transfira 10 microlitros do tubo para o próximo tubo contendo água. Após homogeneizar em vórtex e centrifugar, repita a transferência até que todos os tubos de água recebam o plasmídeo. Após amplificar o DNA nas seis diluições seriadas decimais conforme descrito anteriormente neste vídeo, determine a zona de abatimento, que é a última diluição do plasmídeo que produz um sinal positivo e a primeira diluição sem detecção.

Para preparar seis diluições seriadas de duas vezes, distribua 25 microlitros de água ultra-pura em seis tubos. A partir da última diluição do plasmídeo que apresentou sinal positivo nas diluições decimais, transfira 25 microlitros do tubo para o primeiro tubo com água. Agite em vórtex e centrifugue antes de preparar as cinco diluições restantes conforme demonstrado.

Amplifique o DNA das diluições seriadas em dobro conforme descrito anteriormente neste vídeo. Após a amplificação do DNA dos três ensaios independentes, calcule o número de replicatas positivas dentre as 24 replicatas para cada nível de concentração do plasmídeo. Determine o LLD com um grau de confiança de 95 por cento ou LLD 95 por cento PCR, que é o nível que resulta na detecção de 23 replicatas positivas em 24 replicatas.

Para determinar o LLD do método, prepare cinco diluições seriadas em duplicata, iniciando com 25 microlitros da diluição de trabalho do plasmídeo que é quatro vezes mais concentrada do que a última concentração de uma diluição decenal que forneceu um sinal positivo. O plasmídeo utilizado na etapa de amplificação provém de uma diluição de trabalho de plasmídeo preparada em uma área específica para evitar contaminação. É uma etapa crítica.

Transfira 5 microlitros de cada diluição do plasmídeo para quatro tubos com 135 microlitros do material de recurso negativo para obter quatro réplicas dos cinco padrões positivos. Realize a extração das quatro réplicas para os cinco padrões positivos e execute o procedimento de amplificação conforme descrito anteriormente neste vídeo. Conte o número de réplicas positivas entre oito réplicas para cada nível de concentração do plasmídeo.

Por fim, determine o método de LLD, que é o último nível no qual oito réplicas de um total de oito réplicas são positivas. O método de RT-PCR quantitativa descrito neste vídeo detecta e quantifica o herpesvírus equino-2 em fluidos respiratórios. Neste experimento, foram realizadas diluições seriadas em dez vezes para estimar a zona de abatimento, que se situa entre as diluições 10 elevado à potência negativa 9 e 10 elevado à potência negativa 10.

O valor da PCR-LOD foi determinado com uma nova diluição seriada em dobro na zona de redução. Para determinar a faixa de linearidade e a PCR-LOQ, o valor da PCR-LOD foi utilizado como ponto inicial para uma faixa de seis diluições seriadas em dez vezes, entre 2,6, o valor da PCR-LOD, e 260.000 cópias por 2,5 microlitros de amostra. A PCR-LOQ é a menor concentração dentro da faixa de linearidade.

A caracterização de todo o método consiste na validação de todas as etapas necessárias para obter dados de qRT-PCR, desde a extração de DNA da amostra respiratória até a amplificação e quantificação do alvo. O desempenho quantitativo de todo o método analítico de qRT-PCR foi avaliado e validado com um perfil de exatidão representado neste gráfico. As cargas genômicas do vírus EHV2 em 172 amostras de swab nasal de cavalos com distúrbios respiratórios foram quantificadas conforme mostrado aqui.

As cargas genômicas virais foram mais altas em cavalos jovens, com a carga mais alta detectada de 1,9 vezes 10 à 11ª cópias por mililitro. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas por etapa de amplificação, e o conjunto total de etapas de validação pode ser concluído em menos de quatro semanas, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar o risco de contaminação, especialmente ao trabalhar com uma solução de plasmídeo.

Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identificação do genoma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a extração e amplificação do DNA e caracterizar seus produtos de PCR. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas, como patógenos, pode ser extremamente perigoso.

Algumas precauções, como trabalhar em uma capela e em uma área com nível de segurança adaptado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.