Name: Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprenda a otimizar a localização e quantificação de proteínas centroméricas-cinetocóricas endógenas e exógenas em células humanas usando imunofluorescência indireta. Este método permite analisar níveis proteicos em diferentes fases da anáfase.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM68418.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nos últimos anos, muitos estudos têm desenvolvido diferentes ensaios de microscopia quantitativa em células fixas. 42 Progress em biologia centrômero-kinetochore muitas vezes requer uma compreensão da função específica do centrômero ou específicos de kinetochore de proteínas das quais regulação espacial-temporal subcelular reflete a evolução das funções do estas proteínas durante o ciclo celular. Portanto, aqui desenvolvemos métodos de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente...

&quot;centrômeros&quot; foram classicamente definidos como regiões de recombinação meiótica suprimida em genética e, mais tarde reconhecida como a constrição primária de cromossomos mitóticos, que desempenha um papel essencial na segregação cromossômica precisas durante a mitose. &quot;cinetócoros&quot; foram descritos como as estruturas em camadas múltiplas que se ligam aos microtúbulos na superfície de centrómeros, conforme revelado por microscopia electrónica; &quot;cinetócoros&quot; foram definidos mais tarde, como o complexo macromolecular que localiza no centrômero dos cromossomos mitóticos. Apesar da divergência dramática de sequências de ADN centromérico entre os vertebrados, cinetócoro estrutura e composição são altamente conservadas. A interacção dinâmica entre os microtúbulos do fuso e do kinetochore é necessário para a segregação fiel de cromossomos durante a mitose e defeitos na função centrômero-kinetochore levam a aneuploidia e, assim, o câncer. O centrómero na maioria dos eucariotasnão tem nenhuma sequência de ADN definida, mas é composto por matrizes grandes (0,3-5) Mb de ADN repetitivo consistindo alphoid de ADN satélite α-171-pb. Salvo em brotamento de levedura, identidade centrómero é conseguido não por a sequência de ADN mas pela presença de um nucleossoma especial que contém a variante histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] em seres humanos). 5 nucleossomas CENP-A localizar a placa interna de cinetócoros mamíferos 7 e se ligam ao DNA α-satélite 171 pb. centrômeros ativos requerem CENP-A contendo nucleossomos para dirigir o recrutamento de uma rede constitutiva associada ao centrômero (CCAN) e as proteínas cinetócoro, que em conjunto regulam a fixação dos cromossomas ao fuso mitótico e subsequente progressão do ciclo através do ponto de verificação do fuso. À luz da evidência acima, CENP-A tem sido proposta para ser a marca epigenética do centrômero 8; No entanto, o processo pelo qual CENP-A é incorporada into de ADN centromérico e os fatores responsáveis ​​por essa incorporação ainda não foram bem caracterizados. Um domínio de direccionamento centrómero curta (CATD) reside na histona dobrar região de CENP-A, e a substituição da região correspondente de H3 com o CATD é suficiente para H3 directa ao centrómero. 9 Vários estudos sugeriram papéis funcionais para pós-translacional modificação (PTM) de CENP-A 12-16; No entanto, os mecanismos moleculares destes PTMs de CENP-A no recrutamento para centrómeros ainda não foram elucidados. Nós relatado anteriormente que a atividade ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessário para CENP-A K124 ubiquitinação e localização de CENP-A para centrômeros 17. A descoberta e caracterização de proteínas cinetócoro levaram a nova visão sobre a segregação de cromossomas. 18 mais de 100 componentes cinetócoro foram identificados em células de vertebrados por várias abordagens. 19,20 Um sobpe de como cinetócoros montar e função também vem da caracterização das funções celulares de cada rede centrômero-kinetochore proteínas e proteína-proteína dentro das células. 19 visualização direta e de imagem avançados métodos de microscopia de fluorescência fornecer notável resolução de componentes centrômero-kinetochore e permitir observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetócoros. Além disso, métodos de imunofluorescência indirecta (IIF) A coloração por utilização de anticorpos específicos são cruciais para estas observações. No entanto, apesar dos numerosos relatórios sobre protocolos de IFI, alguns problemas discutidos em de proteínas específicas de centrómero-cinetócoro detalhe. 1-4 Assim, o desenvolvimento de métodos e relatórios de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente cada proteína centrómero-cinetócoro é extremamente importante. Na coloração IIF, deve-se proceder com o protocolo de coloração para evitar a perda da proteína de interesse ouo resto da célula. Contudo, a fixação destrói os locais antigénicos ocasionalmente, e diferentes combinações de anticorpos para o antigénio funcionar mal com um fixador, mas muito bem com a outra, 21 e escolha de fixador depende em grande parte da proteína (s) de interesse. Portanto, diferentes métodos fixadoras são cruciais na coloração IIF de proteínas centrômero-kinetochore. Aqui métodos optimizados de imunofluorescência indirecta (IIF) e um ensaio de coloração para dirigir a localização de proteínas de centrómero-cinetócoro endógenos, incluindo CENP-A e CENP-A proteínas exógenas Bandeira-marcadas, e a quantificação destas proteínas em células humanas têm sido desenvolvidos. Estes métodos podem ser aplicados para a análise de proteínas de centrómero-cinetócoro em outras espécies.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>reagente de transfecção I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>reagente de transfecção II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Meio de soro reduzido, quente em 37 & C banho-maria antes da utilização</td></tr><tr><td>de DMEM com elevado teor de glicose (Dulbecco») s Águia modificada' s meio)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM com alto teor de glicose, quente em 37 &graus; C banho maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, origem americana</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (soro fetal bovino)</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina SOLUÇÃO</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-Lisina, 0,1% p/v, em água</td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPura</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Água estéril de grau de cultura de tecidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Tampa de vidro (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Borracha de cobertura Surgipath</td><td>105</td><td>(22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cluster de Cultura de Células de 6 Poços</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Placa de poliestireno de 6 poços&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina; Caneta Fisher</td><td>/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>Local de ligação</td><td>AD100.1</td><td>Caneta de barreira hidrofóbica (para uma barreira repelente de água na coloração imunofluorescente)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol para análise de células mitóticas</td></tr><tr><td>TN-16, inibidor de microtúbulos (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 para análise de células mitóticas</td></tr><tr><td>BSA (albumina de soro bovino)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Reagente de bloqueio</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Detergente para permeabilização</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fixação reagant</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Para coloração nuclear</td></tr><tr><td>p-fenilenodiamina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Para montagem de meio</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Fosco</td><td>VWR Internacional</td><td>48312-013</td><td>Micro slides&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-B&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF, fixação de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fixação de paraformaldeído)</td></tr><tr><td>Anticorpo anticentrômero (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Anti-soro de centrômero humano; razão de diluição de 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-I</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Hec1</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Flag</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A anticorpo</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; razão de diluição de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RBX1</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Anticorpo policlonal de coelho; taxa de diluição de 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo; taxa de diluição de 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com fluoróforo</td> <td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td> (Anticorpo secundário purificado por afinidade)</tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com fluoróforo</td> <td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td> (anticorpo secundário purificado por afinidade)</tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado (substituição aprovada para leite em pó cravo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lote# 90629)</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência motorizado Leica DM IRE2 de leite desnatado&nbsp;</td><td>Microscópio de fluorescência motorizado Leica</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Lente de imersão em óleo HCX PL APO 63x</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X</td></tr> lente de <tr><td>imersão em óleo HCX PL APO 100x lente de imersão em óleo</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X lente de imersão em óleo</td></tr><tr><td>Leica EL6000 Fonte de luz compacta</td><td>Leica</td><td></td><td>Fonte de luz compacta externa para excitação fluorescente</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Câmera CCD digital&nbsp;</td><td>Câmera digital CCD Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab versão 5.5.2 Software de Imagem Científica&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Para observação, aquisição, quantificação e análise de imagens</td></tr><tr><td>Velocity versão 6.1.1 Software de análise de imagem 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Para observação, aquisição, quantificação e análise</td></tr><tr><td>de imagens Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Comprimidos de coquetel de inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Reagente de ensaio de proteína comercial I para medição da concentração de proteína (compatível com SDS a 2%)</td></tr><tr><td>Ensaio de Proteína Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Reagente de ensaio de proteína comercial II para medição da concentração de proteína (compatível com 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>membrana PVDF para transferência</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo de cabra DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); proporção de diluição de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>anticorpo secundário conjugado com DyLightanticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG-HRP Santa</td><td>Cruz</td><td>SC-2005</td><td>anticorpo secundário conjugado com HRP de cabra anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (secundário purificado por afinidade anticorpo); razão de diluição de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>IgG-HRP</td> Santa <td>Cruz</td><td>SC-2004</td><td>anticorpo secundário conjugado com HRP anticorpo secundário conjugado com DyLightAnticorpo secundário conjugado com corante fluorescente IR (anticorpo secundário purificado por afinidade); razão de diluição de 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab versão 5.5.2. Software de imagem científica&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Quantificação de Volocidade)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Buzina disruptora para sonicação</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Microtip para sonicação</td></tr><tr><td>Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Sistema de imagem infravermelha para detecção de immunoblot</td></tr><tr><td>Software de Análise de Estúdio de Imagem Ver 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software C</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System&nbsp;</td><td>Imager de quimioluminescência</td> <td>Bio-Rad</td><td></td> para detecção de immunoblot</tr><tr><td>Quantidade Um software de análise 1-D&nbsp;</td><td>Software Bio-Rad</td><td></td><td>D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade Máxima</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Substrato quimioluminescente aprimorado ultra-sensível (ECL)</td></tr></tbody></table>

proteínas análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos centromere-cinetócoro

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centrômeros" e "cinetocoros" referem-se ao local onde os cromossomos se associam ao fuso durante a divisão celular. A visualização direta das proteínas do centrômero-cinetócoro durante o ciclo celular continua sendo uma ferramenta fundamental na investigação do(s) mecanismo(s) dessas proteínas. Métodos avançados de imagem em microscopia de fluorescência fornecem resolução notável dos componentes do centrômero-cinetócoro e permitem a observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetocoros. Além disso, métodos de coloração por imunofluorescência indireta (IFI) usando anticorpos específicos são cruciais para essas observações. No entanto, apesar de numerosos relatos sobre protocolos de IFI, poucos discutiram em detalhes problemas de proteínas específicas do centrômero-cinetócoro. 1-4 Aqui, relatamos protocolos otimizados para corar proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas usando fixação de paraformaldeído e coloração de IFI. Além disso, relatamos protocolos para detectar proteínas CENP-A exógenas marcadas com Flag em células humanas submetidas à fixação de acetona ou metanol. Esses métodos são úteis na detecção e quantificação de proteínas endógenas de centrômero-cinetócoro e proteínas CENP-A marcadas com Flag, incluindo aquelas em células humanas.

Análise por imunofluorescência da endógena CENP-A suporta a hipótese de que CUL4A-ligase E3 é necessário para a localização de CENP-A a centrómeros Os nossos estudos recentes mostraram que a actividade de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessária para a ubiquitinação de lisina 124 (K124) em CENP-A e localização de CENP-A a centrómeros. 17 Inicialmente, o complexo interfase-centrómero (ICEN) foi isolado pela anti-CENP-a: imunoprecipitação de cromatina nati...

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

O objetivo geral deste ensaio imunofluorescente indireto é otimizar a localização e a quantificação de proteínas endógenas e exógenas do cinetócoro-centrômero, incluindo a proteína A do centrômero e proteínas CENP-A exógenas marcadas com etiqueta flag em células humanas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como identificar e quantificar proteínas do cinetócoro-centrômero. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para quantificar diferentes níveis de expressão do cinetócoro-centrômero, dependendo da anáfase de interesse selecionada.18 horas após a semeadura, lave as células cultivadas uma vez com PBS e adicione 500 microlitros de meio com soro reduzido a cada poço da placa de cultivo de poliestireno de seis poços. Em seguida, transfete as células em cada poço com uma solução fresca da mistura A e B e incube os cultivos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após quatro horas e meia, troque o meio por DMEM com alta concentração de glicose suplementado com FBS e antibióticos e retorne a placa à incubadora de cultivo celular.48 a 72 horas depois, aspire o meio de cultura celular e lave as células uma vez com PBS, adicionando o salino pelas laterais dos poços de cultura para evitar perturbar as células. Em seguida, fixe as células com paraformaldeído a 4% por 30 minutos a 4 graus Celsius. Ao final do período de fixação, lave as células duas vezes com o tampão Kb2 e permeabilize as amostras no tampão Kb1 por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave as células uma vez com o tampão Kb2 e bloqueie qualquer ligação inespecífica com a adição de tampão Kb2 fresco. Após cinco minutos à temperatura ambiente, use pinças para remover as lamínulas semeadas de cada um dos poços e use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar barreiras hidrofóbicas ao redor de cada amostra de lamínula. Transfira as lamínulas para uma nova placa de poliestireno de seis poços e imerja as amostras no anticorpo primário apropriado durante uma hora a 37 graus Celsius.Em seguida, lave as células três vezes com tampão Kb2 e marque-as com o anticorpo secundário apropriado por mais uma hora a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, lave as amostras com cinco lavagens de 6 minutos cada em tampão Kb2. Em seguida, marque os núcleos celulares com tampão Kb3 contendo DapE por cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por uma ou duas lavagens em tampão Kb2 e reponha o tampão Kb2 nos poços.Agora, coloque uma gota de meio de montagem no centro de uma lâmina de microscópio para cada lamínula de células e remova qualquer líquido das amostras celulares. Por fim, posicione cuidadosamente cada amostra no centro de uma das lâminas de microscópio preparadas e remova o excesso de meio de montagem com uma toalha de papel. Como observado neste experimento representativo, os níveis de expressão proteica endógena de CENP-A nos lisados totais de células transfectadas com siRNA para CUL4A foram semelhantes aos níveis de expressão de CENP-A nas células transfectadas com siRNA para Luciferase.Além disso, os níveis proteicos de CENP-A endógena nos lisados totais de células transfetadas com siRNA para RBX1 foram semelhantes aos níveis de CENP-A endógena nas células transfetadas com siRNA para Luciferase, sugerindo que a ligase E3 CUL4A RBX1 é necessária para a localização de CENP-A nos centrômeros. Mutantes de lisina em CENP-A perdem a capacidade de se localizar nos centrômeros, indicando que a ubiquitinação de CENP-A em K124 é essencial para sua localização nos centrômeros. Importante ressaltar que a fusão exógena de monoubiquitina à proteína CENP-A resgatou o mutante CENP-A K124R, que havia perdido a localização, restabelecendo a proteína em sua posição centrômera.Uma vez dominados, os procedimentos de fixação celular e coloração imunofluorescente podem ser concluídos em cinco a seis horas, se realizados corretamente. Lembre-se de aplicar suavemente todas as soluções nas laterais dos poços para que as células não sejam deslocadas de seus lamínulas durante a lavagem ou imersão das amostras. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído aquecido fora de um ambiente ventilado ou com materiais inflamáveis próximos ao fogo pode ser extremamente perigoso, e que as precauções apropriadas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

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Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

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Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

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Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

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Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

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Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

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Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

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Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

Aprenda a otimizar a localização e quantificação de proteínas centroméricas-cinetocóricas endógenas e exógenas em células humanas usando imunofluorescência indireta. Este método permite analisar níveis proteicos em diferentes fases da anáfase.

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

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