Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

O objetivo geral deste ensaio imunofluorescente indireto é otimizar a localização e quantificação de proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro, incluindo a proteína A do centrômero e proteínas CENP-A exógenas marcadas com bandeira em células humanas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como identificar e quantificar as proteínas do centrômero-cinetócoro. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para quantificar diferentes níveis de expressão de centrômero-cinetócoro, dependendo da anáfase selecionada de interesse.

18 horas após a semeadura, lave as células cultivadas uma vez com PBS e adicione 500 microlitros de meio de soro reduzido a cada poço da placa de cultura de poliestireno de seis poços. Em seguida, transfecte as células em cada poço com uma solução de mistura A e B recém-preparada e incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após quatro horas e meia, troque o DMEM de glicose média para alta suplementado com FBS e antibióticos e retorne a placa à incubadora de cultura de células.

48 a 72 horas depois, aspire o meio de cultura de células e enxágue as células uma vez com PBS, adicionando a solução salina nas laterais dos poços de cultura para evitar perturbar as células. Em seguida, fixe as células com 4% de paraformaldeído por 30 minutos a 4 graus Celsius. No final do período de fixação, enxágue as células duas vezes com tampão Kb2 e permeabilize as amostras em tampão Kb1 por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, enxágue as células uma vez com tampão Kb2 e bloqueie qualquer ligação não específica com a adição de tampão Kb2 fresco. Após cinco minutos em temperatura ambiente, use uma pinça para remover as lamínulas semeadas de cada um dos poços e use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar barreiras hidrofóbicas ao redor de cada amostra de lamínula. Transfira as lamínulas para uma nova placa de poliestireno de seis poços e mergulhe as amostras no anticorpo primário apropriado por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, enxágue as células três vezes com tampão Kb2 e marque-as com o anticorpo secundário apropriado por mais uma hora a 37 graus Celsius. No final da incubação, enxaguar as amostras com cinco lavagens de 6 minutos em tampão Kb2. Em seguida, rotule os núcleos celulares com tampão Kb3 contendo DapE por cinco minutos à temperatura ambiente, seguido de uma a duas lavagens em tampão Kb2 e reabastecimento dos alvéolos com tampão Kb2.

Agora coloque uma gota de meio de montagem no centro de uma lâmina de microscópio para cada lamínula de células e remova qualquer líquido das amostras de células. Por fim, coloque cuidadosamente cada amostra no centro de uma das lâminas de microscópio preparadas e remova qualquer excesso de meio de montagem com uma toalha de papel. Como observado neste experimento representativo, os níveis de expressão endógena da proteína CENP-A nos lisados celulares totais de células transfectadas com CUL4A siRNA foram semelhantes aos níveis de expressão de CENP-A em células transfectadas com Luciferase siRNA.

Além disso, os níveis de proteína de CENP-A endógena nos lisados celulares totais de células transfectadas por siRNA RBX1 foram semelhantes aos níveis endógenos de CENP-A das células transfectadas com siRNA luciferase, sugerindo que a ligase CUL4A RBX1 E3 é necessária para a localização de CENP-A nos centrômeros. Os mutantes de lisina CENP-A perdem sua capacidade de se localizar dentro dos centrômeros, sugerindo que a ubiquitilação de CENP-A K124 é essencial para a localização de CENP-A nos centrômeros. É importante ressaltar que a fusão exógena de monoubiquitina da proteína CENP-A resgatou o mutante CENP-A K124R de deslocalização, retornando a proteína à sua localização centromérica.

Uma vez dominados, os procedimentos de fixação celular e coloração imunofluorescente podem ser concluídos em cinco a seis horas se forem realizados corretamente. Lembre-se de aplicar suavemente todas as soluções nas laterais dos poços para que as células não sejam desalojadas de suas lamínulas ao enxaguar ou imergir as amostras. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído aquecido fora de uma sala ventilada ou que materiais inflamáveis perto do fogo podem ser extremamente perigosos e que as devidas precauções devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.