Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

O objetivo geral deste ensaio de quinase in vitro é identificar locais de fosforilação em uma proteína de interesse que são específicos para a quinase dependente de ciclina 1. A identificação de locais de fosforilação específicos de CDK1 é importante, pois fornecem informações mecanicistas sobre como o CDK1 controla o ciclo celular. A regulação do ciclo celular é crítica para a segregação cromossômica completa da fase e os defeitos levam a aberrações cromossômicas e câncer.

A principal vantagem desta técnica é que ela se baseia em proteínas purificadas, portanto, pode ser aplicada a qualquer organismo modelo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinada com estudos funcionais em células. Este método é importante, pois o número conhecido de alvos de CDK1 ainda é baixo, apesar do fato de que CDK1 fosforila cerca de oito a 13% do proteum. Embora este método identifique locais de fosforilação específicos de CDK1, ele pode ser modificado para identificar locais de fosforilação para outras quinases, desde que a quinase purificada esteja disponível.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as condições para o ensaio de quinase precisam ser otimizadas para cada alvo de proteína para obter alta eficiência de fosforilação. De preferência 100%Use o software IGPS 3.0 e visite o servidor web para prever os locais de fosforilação específicos de CDK1 na sequência da proteína-alvo CENP-F. Verifique os locais de fosforilação em relação à sequência de consenso CDK1.

Inicie a expressão da proteína preparando uma pré-cultura. Seguindo as instruções do fabricante, transforme um microlitro do plasmídeo de expressão em 50 microlitros de células competentes para E.coli. Depois de adicionar o plasmídeo, incubar as células no gelo durante 30 minutos.

Em seguida, incube as células por 45 segundos a 42 graus Celsius. Após a incubação, coloque as células no gelo por um minuto, adicione 400 microlitros de LB às células e, em seguida, incube a cultura por uma hora a 37 graus Celsius enquanto agita. Em seguida, coloque 200 microlitros da cultura em placas de ágar LB, suplementada com os antibióticos de interesse, dependendo da construção.

Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 12 a 20 horas sem agitar. Em seguida, pegue uma colônia da placa de ágar LB e inocule a colônia em 50 mililitros de meio LB suplementado com a combinação de antibióticos desejada. Incube a cultura a 37 graus Celsius enquanto agita a 160 a 180 rotações por minuto por 12 a 20 horas.

Para cada litro de meio LB adicione os antibióticos e 10 mililitros de 40% em peso por volume de solução estéril de glicose filtrada. A este meio, adicione 20 mililitros da pré-cultura densamente cultivada. Em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius enquanto agita a 160 a 180 rotações por minuto.

Verificar a absorvância da cultura a 600 nanômetros em intervalos regulares. Quando a absorbância atingir 0,5 a 0,6, induza a expressão da proteína adicionando 0,2 milimolar IPTG. Em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius por três horas enquanto agita.

Após três horas, colha as células por centrifugação a 4.100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, usando um rotor basculante. Após a centrifugação, expulsar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 20 mililitros de tampão de ligação GST para CENP-F e seu tampão de ligação de seis para carioferina alfa para cada litro de cultura.

Em seguida, armazene as células a menos 80 graus Celsius. Para purificar o CENP-F, primeiro descongele as células com a construção CENP-F. Em seguida, ajuste o volume para 20 mililitros com um buffer de ligação GST.

Uma vez ajustado o volume, adicione todos os redutores e os inibidores da protease, um após o outro, para preparar a suspensão celular para a lise subsequente. Em seguida, transferir a suspensão da célula para um copo de vidro e mergulhar o copo num banho de água gelada. Em seguida, sonicar a cultura.

Após a sonicação, adicione 250 PMSF micromolares ao lisado e, em seguida, inspecione o lisado, que deve ser transparente nesta fase. Em seguida, centrifugar o lisado a 12 000 a 40 000 vezes G durante 25 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare a coluna adicionando dois mililitros de glutationa agarose um a um chorume a uma pasta descartável de cromatografia.

Para equilibrar a coluna, lave-a primeiro com 25 mililitros de água ultrapura e depois 25 mililitros de tampão de ligação GST. Terminada a centrifugação, decantar o sobrenadante e, em seguida, filtrá-lo através de um tamanho de vazamento de 0,2 micrómetro. Em seguida, despeje o lisado na coluna obstruída para a etapa de ligação.

Tampe a coluna e incube-a a quatro graus Celsius por 30 minutos enquanto nuta suavemente e evite espuma. Após 30 minutos, transfira a coluna para uma prateleira e deixe a resina assentar. Em seguida, colete o fluxo e lave a coluna duas vezes com 25 mililitros de tampão de ligação GST.

Quando a lavagem estiver concluída, tampe novamente a coluna. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de ligação GST e 250 microlitros de estoque de protease PS com atividade de 1000 unidades por miligrama à coluna. Novamente tampe a coluna e gire a coluna suavemente para ressuspender a resina no tampão, depois incube a coluna a quatro graus Celsius por 16 a 20 horas.

Após o término do período de incubação, adicione quatro mililitros de tampão de ligação GST para eluir o fragmento CENP-F da coluna que foi clivada proteoliticamente. Em seguida, para eluir a etiqueta GST novamente, conecte a coluna. Em seguida, adicione quatro mililitros de tampão de eluição GST contendo glutationa à coluna.

Em seguida, incube a coluna por 10 minutos para eluir a tag GST vinculada. Após 10 minutos, recolher o eluído. Em seguida, realize a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS para analisar as frações de eluição de protease PS e glutationa.

Em seguida, para concentrar a amostra de proteína, pipetar o eluato de protease PS para o compartimento superior de uma unidade de filtro centrífugo com um limite de peso molecular de três kilodalton. Em seguida, centrifugar o eluído a 4, 100 vezes G em incrementos de 10 a 15 minutos a quatro graus Celsius num rotor basculante, para concentrar a amostra. Após cada incremento, misturar a amostra de proteína no filtro de concentração, pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a formação de um gradiente de concentração.

Para purificar o CENP-F por filtração em gel, anexar uma coluna de filtração em gel a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas. Em seguida, equilibre a coluna com um volume de coluna de tampão de filtração de gel. Em seguida, centrifugue o fragmento CENP-F em um tubo de microcentrífuga a 21.700 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Após o término da centrifugação, injete a amostra na coluna, depois elua a coluna com tampão de filtração em gel e colete frações de 0,6 mililitro do fragmento CENP-F. Em seguida, analise o perfil de filtração de gel e execute um SDS-PAGE das frações de pico. Frações de pool que contêm CENP-F puro.

Em seguida, concentrar o fragmento CENP-F purificado a 3,3 miligramas por mililitro. Para determinar a concentração de proteína, diluir o fragmento CENP-F na proporção de um para 100 com água ultrapura. Em seguida, registre o espectro de comprimento de onda de 220 a 300 nanômetros no espectrofotômetro.

Em seguida, prepare alíquotas de 50 microlitros do CENP-F purificado em microtubos de 0,5 mililitro, depois congele rapidamente os tubos em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos. Para o ensaio de quinase, misture o fragmento CENP-F com ATP e ciclina B CDK1 junto com outros tampões em um microtubo de 0,5 mililitro. Em seguida, preparar uma segunda amostra sem ciclina B CDK1 como controlo negativo.

Em seguida, incube as amostras em banho-maria a 30 graus Celsius por uma a 16 horas. Para a identificação bem-sucedida dos locais de fosforilação por espectrometria de massa, é fundamental que a eficiência de fosforilação seja a mais alta possível, de preferência 100% Para aumentar a eficiência de fosforilação, adicione mais quinase e aumente o tempo de incubação para 16 horas. Em seguida, adicione volumes iguais de solução de cloridrato de guanidina de seis molares à reação de ensaio de quinase restante e ao controle negativo e execute espectrometria de massa para identificar o local de fosforilação.

Para obter dados de espectrometria de massa de alta qualidade, também é importante que a amostra de proteína purificada seja altamente pura e homogênea. A primeira análise SDS-PAGE é feita, que mostra um claro deslocamento ascendente da banda no gel para o CENP-F fosforilado em comparação com o controle negativo sem CDK1, indicando que o cNLS do CENP-F é um substrato de CDK1. Em seguida, a espectrometria de massa é feita para analisar o número e a eficiência dos sítios de fosforilação do CENP-F.

O espectro de massa da armadilha iônica ESI do CENP-F fosforilado in vitro intacto mostra que existem cinco picos, indicando quatro locais de fosforilação e o quinto pico é a proteína não fosforilada. Em seguida, este perfil de eluição de exclusão de tamanho mostra que o volume de eluição do pico alfa de carioferina muda para uma massa maior na adição do tipo selvagem CENP-F, o que não é observado na adição do mutante CENP-F. Isso indica que a versão fosfomimética S3048D do CENP-F enfraquece a interação do CENP-F cNLS com a carioferina alfa.

Finalmente, a análise SDS-PAGE feita mostra que o fragmento CENP-F do tipo selvagem com cNLS intacto coelui com carioferina alfa, indicando forte interação. No entanto, o mutante S3048D de CENP-F e carioferina alfa eluem em picos separados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar os locais de fosforilação obtidos em relação à sequência de fosforilação de consenso de CDK1 e verificar se o substrato identificado está localizado no mesmo compartimento celular que CDK1.

Após este procedimento, a verificação funcional deve ser realizada nas células ou modelos animais para confirmar que os locais de fosforilação identificados têm uma função fisiológica. Várias ferramentas estão disponíveis para verificação funcional, como inibidores específicos de CDK1 e mutações fosfomiméticas. Devido ao grande número de substratos de CDK1 no proteum, muitos substratos de CDK1 humanos ainda precisam ser descobertos e o ensaio de quinase in vitro será uma ferramenta importante para identificar, mapear e verificar esses locais.

A identificação desses locais de fosforilação permite estudos mecanísticos de como o CDK1 controla o ciclo celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar locais de fosforilação específicos de CDK1 e proteínas-alvo por um ensaio de quinase in vitro.