Name: Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Aprenda a identificar sítios de fosforilação específicos da Cdk1 usando ensaio de quinase in vitro com proteínas purificadas. Este método revela mecanismos de regulação do ciclo celular e pode ser adaptado para outras quinases.

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Agradecemos o Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, Universidade da Califórnia em Berkeley por análise de espectrometria de massa e comentários úteis. Agradecemos o Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutos de ciências biológicas, da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China para fornecer uma construção completo do CENP-F. Finalmente, agradecemos a Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer na Binghamton University para acesso ao equipamento. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de pesquisa para a Universidade Estadual de Nova York e o departamento de química, Universidade Estadual de Nova York em Binghamton.

Os autores não têm nada para divulgar.

Nosso ensaio da quinase em vitro é um método muito poderoso para identificar alvos moleculares para a quinase Cdk1, que é um controlador mestre do ciclo celular e regula muitos processos celulares importantes. O método determina se uma proteína purificada é um substrato para a Cdk1 e permite a identificação dos sítios de fosforilação específica. Isto facilita estudos mecanicistas para regulação de processos celulares por fosforilação através de Cdk1.
O fator mais crítico para sucesso ...

As cinases são enzimas que tranferem grupos fosfato do ATP para substratos e regulam muitos processos celulares. Esta fosforilação é reversível, rápido, adiciona duas cargas negativas e armazena energia livre e é uma das modificações posttranslational mais comuns usadas pelas células. Cdk1, que é também conhecido como o homólogo de proteína 2 de ciclo de divisão celular (cdc2) é um controlador mestre do ciclo celular em todos os eucariontes1,2,3,4,5e fosforila um Estima-se 8-13% do proteome6,7.
Enquanto estudos recentes de proteomic identificaram muitos sítios de fosforilação de proteínas, na maioria dos casos, a quinase responsável por essas modificações é desconhecida. O número de conhecidos destinos Cdk1, particularmente em células humanas é baixo7. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como permite estudos mecanicistas que estabelecem como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é importante para a segregação do cromossomo fiel e divisão celular, e uma miríade de processos celulares precisam ocorrer para apoiar esta importante função fisiológica. Isso inclui travar a transcrição e tradução antes do início da mitose, bem como uma reorganização dramática na estrutura celular e organização, tais como a desmontagem do envoltório nuclear, condensação do cromossomo e montagem do fuso mitótico. Desregulamentação e erros nestes processos causam câncer, defeitos de nascimento ou morte celular mitótica. Inibidores específicos de Cdk1 como RO-3306 foram desenvolvidos8, que fornece ferramentas poderosas para estudos funcionais, e alguns destes inibidores são atualmente em ensaios clínicos para tratamento de câncer (veja9 para revisão).
Aqui, descrevemos um em vitro quinase que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B é usado para fosforilar um alvo purificado da proteína em vitro. Fosforilação do substrato aumenta a sua massa e adiciona duas cargas negativas; Portanto, fosforilação sucesso é confirmada por um deslocamento para cima da banda gel de proteína em SDS-PAGE. Sites específicos de Cdk1 fosforilação são posteriormente identificados por análise de espectrometria de massa da proteína em vitro fosforilada. Para ajudar com delineamento experimental, revisamos também ferramentas computacionais e referências para a previsão dos sítios de fosforilação Cdk1 específica da sequência de proteínas. Além disso, podemos também descrever protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase. Finalmente, os sítios de fosforilação identificado devem ser verificados por estudos funcionais, e um ensaio simples é descrito aqui para essa finalidade. Combinada, esta é uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular7,10,11. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a quaisquer resultados fiáveis modelo organismo e rendimentos. No entanto, é recomendada verificação funcional da fosforilação obtidos sites em vitro , como as células têm mecanismos reguladores adicionais no lugar, como modificações posttranslational, parceiros de interação ou localização celular que pode processar sites fosforilação acessível ou inacessível para reconhecimento por Cdk1.
Cdk1 reconhece um site de fosforilação de consenso que consiste em arquivos em (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), onde X é qualquer resíduo e uma serina ou treonina é o sítio de fosforilação. Especialmente importante para o reconhecimento é a presença da prolina na posição + 1. Além disso, os resíduos básicos são preferidos nas posições + 2 ou + 3, com a maioria dos sites de fosforilação Cdk1 específicas contendo um Lys ou Arg + a 3 posição6,12.
Ativação de Cdk1 é fortemente regulamentada e leva ao aparecimento de mitose1,2,3,4,5. A atividade de quinases cyclin-dependente em geral depende de sua associação com ciclinas distintas (ciclina A, B, C, D e E em seres humanos), que são expressos em níveis durante todo o ciclo celular13de oscilação. Expressão de Cdk1 é constante em todo o ciclo celular e a regulação da sua actividade baseia-se na sua associação com as subunidades reguladoras cyclin A e cyclin B5,13,14,15, como bem como modificações borne-translational. Formação do complexo Cdk1/cyclin B é necessária para a quinase ativação5,14,15,16,17,18. Na fase G2, ciclina B é traduzido no citoplasma e importada para o núcleo onde se liga ao Cdk15,14,15,16,17,18; no entanto, B Cdk1/cyclin realiza inativada por fosforilação em resíduos Thr14 e Tyr15 pelos humano Cdk1-inibitório quinases Myt1 (quinase cdc2-inibitório de membrana-associado tirosina e treonina-específico) e Wee1, respectivamente,19, 20,21. Na fase tardia do G2, desfosforilação de Thr14 e Tyr15 por divisão celular ciclo 25 fosfatase (cdc25) ativa a atividade da quinase do complexo Cdk1/cyclin B e desencadeia o início da mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. a fosforilação de Thr161 também é necessária para ativação de Cdk1/cyclin B e é mediada por Cdk7, o Cdk-activação da quinase (CAK)18. Degradação da ciclina B em anáfase inactivates Cdk1, permitindo a saída de mitose24,25. Ativação de Cdk1/cyclin B, portanto, é um processo complicado. O protocolo aqui apresentado é realizado com b de Cdk1/cyclin comercialmente disponível. Durante a expressão recombinante deste complexo em células de inseto, é ativado na vivo por quinases endógena14,20 e permanece ativa no estado purificado. Resultante ativo, recombinante humana Cdk1/cyclin B é apropriado para ensaios de quinase em vitro .
Aqui, descrevemos um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicas do centrômero humano proteína F (CENP-F)10. CENP-F é uma proteína de cinetócoro que reside no núcleo durante a interfase (G1 e S-fase) e é exportada para o citosol no G2 fase26,,27,28 em uma maneira dependente Cdk110, 11. localização nuclear é conferida por um bipartido cNLS26. cNLSs são reconhecidos pelo transporte nuclear factor carioferinas α, que facilita, em conjunto com carioferinas β e RanGDP, a importação de cNLS-carga para o núcleo de29. A exportação nuclear na fase G2 é facilitada através de uma exportação desconhecido caminho10. Uma vez que o CENP-F reside no citosol, ele é recrutado para o envelope nuclear e recrutas por sua vez o motor proteína Dineína complexo30,31. Esta via é importante posicionar o núcleo respectivo para a centrossoma durante os estágios iniciais da montagem do fuso mitótico de forma dependente de Dineína, que é importante para o timing correto de entrada mitótica e para um processo fundamental no cérebro desenvolvimento de31,30,32. Começando na fase G2, CENP-F é também montado no cinetócoro onde tem papéis importantes para cromossomo fiel segregação27,28,33,34,35 . Um passo chave reguladora destas vias é a exportação nuclear do CENP-F na fase G2, que é dependente de Cdk110,11. Descrevemos aqui um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos no cNLS do CENP-F. Phosphomimetic mutações desses sites devagar importação nuclear do CENP-F, sugerindo que B Cdk1/cyclin diretamente regula a localização celular do CENP-F por fosforilação de sua cNLS10.
Em geral, este ensaio da quinase em vitro permite a identificação de substratos específicos para proteínas quinase Cdk1. Purified alvo são fosforilada em vitro pelo complexo B Cdk1/cyclin comercialmente disponível e os locais de fosforilação posteriormente são identificados por espectrometria de massa. A identificação dos sítios de fosforilação específica Cdk1 suporta mecanicistas estudos que revelam como a Cdk1 controla o ciclo celular.

<table><tbody><tr><td>2800 mL de frasco de Fernbach perplexo</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de benzamidina</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>filtro de frasco</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / ciclina B recombinante, humano 20.000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B (fonte alternativa)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B (fonte alternativa)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/ciclina B + 10x tampão PK</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (resíduos 2987 - 3065) plasmídeo pGEX6P1</td><td>Disponível mediante solicitação.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga: Heraeus Multifuge X3R, refrigerada, com rotor basculante TX-1000 Unidades de</td> filtro centrífugo <td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>: Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15, corte de 3 kDa, membranas Ultracel-PL</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L metionina</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>pontas de pipeta de dessalinização: Pontas de zíper</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>colunas de cromatografia descartáveis, Econo-Pac 1,5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS cepa</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>ionização por eletrospray Íon por transformada de Fourier</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>espectrômetro de massa por ressonância ciclotron espectrômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de massa de armadilha de íons por ionização por eletrospray</td><td>Bruker Amazon</td><td></td> rotor de ângulo fixo personalizado<td></td></tr><tr><td>: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>Sistema FPLC: &Auml; kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de filtração em gel: Superdex 200 Aumento 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutationa agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutationa, reduzida</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>agitador de incubação: agitador multitron</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>canamicina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>carioferina &alfa; pet-28a pres plasmídeo</td><td>Disponível mediante solicitação.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani microcentrífuga 5418R da</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td>média</tr><tr><td>, microtubos de 5401000013</td><td></td><td></td><td>Eppendorf</td> refrigerados</tr><tr><td>(0,5 mL)</td><td>Microtubos</td><td>de 30121023 Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td>Gel de afinidade <td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel: Gel de afinidade His-Select Nickel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmídeo</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetilsulfonil</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: Protease pré-cisão</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida Phos-tag</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr> tubos de centrífuga de fundo redondo <tr><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td><td>de gluthathione reduzido</td></tr><tr><td>(tubos Oakridge)</td>Kit de mutagênese dirigida ao local <td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td>de mutagênese dirigida</tr><tr><td>ao local sonificador: sonificador Branson S-250D</td><td>Membrana de diálise Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC (corte de 6-8 kDa)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr> rotor <tr><td>basculante TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação da quinase cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase in vitro do ensaio

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é um controlador mestre para o ciclo celular em todos os eucariontes e fosforila um estimado 8-13% da proteoma; no entanto, o número de destinos identificados para Cdk1, particularmente em células humanas ainda é baixo. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como eles fornecem mecanicistas insights sobre como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é essencial para a segregação do cromossomo fiel, e defeitos neste processo complicado levam a aberrações cromossômicas e câncer.
Aqui, descrevemos um em vitro quinase que é usado para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, uma proteína purificada é fosforilada em vitro por comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B. bem sucedido fosforilação é confirmada por SDS-PAGE, e locais de fosforilação são posteriormente identificados por espectrometria de massa. Descrevemos também protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase e um ensaio para a verificação funcional dos sítios identificados fosforilação, que explora a interação entre um sinal de localização nuclear clássica (cNLS) e seu transporte nuclear receptor carioferinas α. Para ajudar com delineamento experimental, revemos abordagens para predição de sítios de fosforilação Cdk1 específicas de sequências de proteínas. Juntos esses protocolos apresentam uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a qualquer modelo organismo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinado com estudos funcionais de célula.

Recentemente nós usamos um em vitro quinase (Figura 1) para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos em um fragmento do CENP-F que continha um cNLS10. Este sinal confira localização nuclear do CENP-F durante a maior parte da interfase. Na fase G2, CENP-F é exportado do núcleo para o citosol na forma Cdk1-dependente. Para obter insights mecanicistas sobre como Cdk1 regula a localização celular do CENP-F, analisamos a...

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

O objetivo geral deste ensaio de quinase in vitro é identificar locais de fosforilação em uma proteína de interesse que são específicos para a quinase dependente de ciclina 1. A identificação de locais de fosforilação específicos de CDK1 é importante, pois fornecem informações mecanicistas sobre como o CDK1 controla o ciclo celular. A regulação do ciclo celular é crítica para a segregação cromossômica completa da fase e os defeitos levam a aberrações cromossômicas e câncer.A principal vantagem desta técnica é que ela se baseia em proteínas purificadas, portanto, pode ser aplicada a qualquer organismo modelo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinada com estudos funcionais em células. Este método é importante, pois o número conhecido de alvos de CDK1 ainda é baixo, apesar do fato de que CDK1 fosforila cerca de oito a 13% do proteum. Embora este método identifique locais de fosforilação específicos de CDK1, ele pode ser modificado para identificar locais de fosforilação para outras quinases, desde que a quinase purificada esteja disponível.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as condições para o ensaio de quinase precisam ser otimiza

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

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