Centrossomas de imagem na mosca Testículos

O objetivo geral deste procedimento é usar marcadores geneticamente marcados do Centro Somal para rastrear novas mutações genéticas e descobrir a função dos genes do Centro Somal recém-identificados. Isso pode ser feito por três estratégias de imagem diferentes. Rastreie uma imagem de testículos vivos, rastreie B, fixação química dos testículos ou rastreie a imunocoloração C.

O primeiro passo do procedimento é isolar os testículos de moscas que expressam proteínas centríssomas geneticamente marcadas, que podem ser seguidas por imagens imediatas. O segundo passo é fixar quimicamente os testículos, o que também pode ser seguido por imagens. Em terceiro lugar, os testículos podem ser imunocorados e depois fotografados.

Em última análise, as localizações das proteínas centri são identificadas por microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da zona central, como base molecular da formação central, alongamento central e separação central. Comece isolando os testículos da drosófila, conforme detalhado pela publicação JoVE 2 6 4 1.

Depois de isolar os testículos, mergulhe a amostra em seis microlitros de tampão de coloração à temperatura ambiente recém-preparado em uma lâmina de microscópio de vidro carregada positivamente. Aguarde 10 minutos e, em seguida, lave suavemente o excesso de DPI substituindo o tampão de coloração duas vezes. Com seis microlitros de PBS.

Tenha cuidado para não lavar os testículos. Remova as soluções da lâmina usando um pedaço de papel de filtro para absorvê-la. Seis volumes de microlitros funcionam bem para lamínulas de 18 milímetros quadrados.

Agora ajuda usar um bisturi afiado para perfurar os testículos próximos ao tipo de célula de interesse, e isso minimiza a pressão sobre essas células durante a etapa de esmagamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula em cima da amostra e sele-a com esmalte. Em seguida, marque a posição dos testículos na lâmina com uma caneta e prossiga para a imagem.

Depois de isolar os testículos, mergulhe-os em uma gota de seis microlitros de PBS em cima de uma lâmina de microscópio de vidro carregada positivamente. Oriente manualmente os testículos de forma linear ou de outra forma Em seguida, use um pedaço de papel de filtro para absorver o PBS e substitua-o por seis microlitros de tampão fixo recém-preparado.

Após cinco minutos no buffer fixo, retire-o com um pedaço de papel de filtro. Agora mergulhe a amostra em seis microlitros de tampão de coloração DPI recém-preparado por 10 minutos. Lave o DPI substituindo-o por dois volumes de seis microlitros de PBS.

Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula de 18 milímetros quadrados em cima da amostra e sele-a com esmalte. Em seguida, marque a localização dos testículos na lâmina e prossiga com a imagem. Para este procedimento, primeiro prepare algumas lamínulas siliconizadas.

Primeiro, mergulhe as lamínulas em uma pequena bandeja de solução siliconizada por um minuto em temperatura ambiente sob uma coifa, certifique-se de que as lamínulas estejam totalmente expostas e não empilhadas umas sobre as outras. Em seguida, lave as lamínulas três vezes em água por um minuto por lavagem. Em seguida, lavagens de um minuto em etanol a 70% e uma lavagem final de um minuto em água.

Em seguida, deixe as lamínulas siliconizadas secarem ao ar sob uma coifa. Depois de dissecar vários testículos e sepultar uma lâmina com o tipo de amostra, adicione cinco microlitros de PBS à lamínula siliconizada e transfira os testículos para a gotícula de PBS. Várias lamínulas, cada uma com um único testículo, são necessárias para garantir o sucesso.

Em seguida, sob um microscópio de dissecação, perfure cuidadosamente cada um dos testículos, conforme demonstrado anteriormente. Agora, coloque delicadamente um microscópio de vidro carregado positivamente. Deslize sobre a lamínula, permitindo que o PBS se disperse uniformemente entre a lamínula e a lâmina.

Em seguida, retire o excesso de tampão entre a lamínula e a lâmina, o que aumentará a pressão sobre os testículos e os esmagará. Agora solte a lâmina preparada no nitrogênio líquido. Mais lâminas agora podem ser preparadas e adicionadas ao tanque.

Antes de prosseguir com o uso de pinças grandes, remova uma das lâminas do nitrogênio líquido e use rapidamente um bisturi para remover a lamínula. A amostra deve permanecer na lâmina enquanto remove a lamínula da amostra. Tenha cuidado para não borrá-lo ao longo da superfície da lâmina S.

Isso pode ser conseguido usando bisturi para retirar a lama da tampa em um movimento rápido. Agora incube as lâminas em um frasco de coloração de coplan de vidro cheio de metanol. Resfriado a menos 20 graus Celsius por 15 minutos.

Após a incubação, transfira as lâminas para um frasco contendo acetona. Resfriado a menos 20 graus Celsius após 30 segundos na acetona. Lave as lâminas por um minuto em PBS em temperatura ambiente.

Em seguida, incube as lâminas por 10 minutos em PBST recém-preparado para bloquear locais não específicos Durante a incubação da PBS TB, encha os poços de uma câmara de umidade com água Após 10 minutos, remova as lâminas do PBST e seque cada lâmina ao redor da amostra. Tenha cuidado para não secar a amostra em si. À medida que cada lâmina é seca.

Coloque-o na câmara de umidade. É importante secar a área da lâmina ao redor da amostra antes de adicionar a solução de anticorpos. Isso garante que o anticorpo permaneça localizado na amostra, evitando assim a secagem durante a etapa de incubação.

Em seguida, coloque suavemente 100 microlitros de anticorpo primário diluído em P-B-S-T-B-R recém-preparado sobre as amostras. Use uma diluição de um a 200 para anticorpos não caracterizados. Em seguida, coloque um pedaço quadrado de um centímetro de paraforma em cima da amostra para espalhar a solução de anticorpos e proteger a solução de anticorpos da evaporação.

Deixe as amostras incubarem por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, use uma pinça para remover suavemente a paraforma das lâminas. Em seguida, lave as lâminas três vezes em PBST à temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem.

Em seguida, transfira as lâminas para a câmara de umidade com a amostra voltada para cima, adicione suavemente 100 microlitros de anticorpo secundário diluído em PBST, BR nas amostras. Como antes, aplique a paraforma e aguarde uma hora de lavagem do secundário com três lavagens de cinco minutos em PBST e depois três lavagens de cinco minutos em PBS. Em seguida, seque cuidadosamente as lâminas sem tocar nas amostras.

Adicione seis microlitros de mídia de montagem e aplique uma lamínula padrão. Depois de selar a lamínula com esmalte e marcar a posição dos testículos, prossiga com a imagem. Os centrossomas sofrem múltiplas transformações morfológicas e funcionais ao longo da espermatogênese.

Um processo prontamente observado é o alongamento do centrossomo nas espermatogônias, o marcador LAR ANA one GFP marca o ole de 0,6 mícron de comprimento que este ole alonga durante a espermatogênese e atinge um comprimento de 2,5 mícrons em espermátides quase maduras. Como os óleos centris do esperma de drosófila são excepcionalmente longos, a imagem pode ser usada para fazer declarações quantitativas sobre o alongamento do centrossoma. Em comparação com a morfologia do tipo selvagem, várias mutações que alteram o crescimento central foram identificadas.

Dois exemplos são sempre mutações precoces e de bala de canhão que interrompem a espermatogênese antes do início da meiose, mas não bloqueiam o alongamento de centavos nesses mutantes Os óleos de centêncios do espermatócito maduro crescem até cerca de 2,4 mícrons em comparação com os óleos de centavos das células de controle, que atingem um comprimento máximo de 1,8 mícrons. Uma vez masterizado, a faixa A pode ser feita em 20 minutos, a faixa B em 30 minutos e a faixa C em três a cinco horas, dependendo do tamanho da amostra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar imagens do centrossomo em vôo.