Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares
13 de janeiro de 2021
Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.
Nosso protocolo usa sondas fluoróforas regulares e técnicas simples de preparação de espécimes que mantêm a célula imagem em condições fisiológicas para estudar processos celulares altamente dinâmicos e estruturas subcelulares detalhadas. Essa técnica nos permite investigar processos celulares em uma super resolução e em condições fisiológicas por um período prolongado sem sacrificar a resolução especial ou temporária. Comece cortando uma membrana de diálise de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodalton em pequenos pedaços e absorvendo as peças com 100 microliters de meio de célula viva por cerca de cinco minutos.
Enquanto as membranas estão encharcadas, corte o anel externo de um tubo de 50 mililitros em pequenos pedaços e esterilize as peças em 70% de etanol. Para dissecção e montagem de testes, transfira dez de dois a três dias de idade anesthetizado moscas machos em um prato de dissecção sob um microscópio dissecando e usar fórceps finos para remover os testículos. Quando todos os testículos tiverem sido coletados, lave os testículos duas vezes no meio da célula viva e use uma ponta de pipeta para espalhar de 100 a 150 microliters de meio de célula viva para o prato de fundo de vidro preparado.
Use fórceps finos para transferir os testículos de mosca para o centro do prato e remova todos, exceto cerca de 10 microliters do meio. Rapidamente, coloque a membrana pré-molhada sobre os testículos e coloque de dois a três pequenos pesos plásticos na membrana. Imediatamente, adicione 100 a 150 microliters de meio de célula viva fresca e coloque o anel de volta no lado elevado do prato.
Coloque a tampa deslize de volta para o anel e gire um pedaço de papel de tecido na água antes de colocar o papel no deslizamento da tampa. Em seguida, cubra o prato com uma tampa e fixe o prato no palco de um microscópio de super resolução. Para imagens de células-tronco germinativas, abra o software de imagem e ligue a luz transmitida.
Use o objetivo 63X para focar no tecido de testículos e ligar os lasers. Clique em Live"para localizar células-tronco germinais. Ajuste o foco e clique em Tamanho do Quadro", para definir o tamanho do quadro entre 512 por 512 e 1024 por 1024 pixels, e média"para definir a média do quadro para um ou dois.
Clique em Master Gain"para definir o ganho de multiplicação de elétrons para menos de 800, e lasers"para definir a potência laser para 1%a 2% Zoom na região ou célula de interesse para reduzir o tempo de aquisição da imagem e reduzir o branqueamento de fotos, e confirmar que a imagem foi configurada de forma ideal antes de clicar em Iniciar Experimento"para iniciar a captura de imagem de lapso de tempo. Se a Aquisição airyscan não estiver configurada de forma ideal" será exibida, clique em Optimal"nas seções tamanho do quadro, Z-Stack e Área de varredura, e otimize o intervalo de tempo, o número de fatias Z e a duração da imagem de lapso de tempo, de acordo com o design experimental e o tipo de amostra. Após a imagem, selecione Processamento, Batch"e Processamento Airyscan e selecione as imagens a serem processadas.
Em seguida, clique em Executar processo"para obter as imagens de super resolução. A imagem celular viva de testículos de drosophila expressando gfp de tubulina alfa em células germinativas em estágio inicial usando um microscópio confocal de disco giratório, permite a visualização da intensidade assimétrica dos sinais de GFP em dois centrossomos, como um sinal mais brilhante no centro-mãe e um sinal relativamente mais fraco nos centrossos da filha. A diferença de brilho é provavelmente refletida pela assimetria temporal da nucleação do microtúbulo, mas a morfologia detalhada e a quantidade dos microtúbulos não podem ser resolvidas usando microscopia confocal de disco giratório.
Em contraste, a super resolução de células vivas permite a visualização e quantificação da morfologia e números de microtúbulos. Essa resolução melhorada também revela padrões de nucleação assimétrica de microtúbulos, alongamento e aumento da interação com a membrana nuclear. A imagem celular viva também permite a visualização da invaginação da membrana nuclear assimétrica, mas não de microtúbulos individuais que entram diretamente no núcleo.
Em contraste, esta técnica de super resolução de células vivas permite a observação direta desses eventos por imagens simultâneas de microtúbulos e da lâmina nuclear. Durante a metafase, ambos os centrosmers irmãs podem ser detectados como um sinal usando microscopia de disco giratório, embora o acessório central de microtúbulo não possa ser observado. Em contraste, a imagem viva de super resolução permite a visualização do acessório de centromero microtúbulo em prophase precoce.
Certifique-se de colocar uma membrana sobre os testículos para garantir que eles não se movam ou flutuem durante a imagem e para otimizar as configurações do microscópio para evitar branqueamento de fotos e toxicidade fotográfica. Existem muitas maneiras de aplicar esse método, como investigar a dinâmica das proteínas, o estresse linear ou as defesas e processos celulares.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método de imagem de super-resolução em células vivas em tecido intacto, destinado a estudar processos celulares dinâmicos dentro de uma população de células-tronco adultas em seu ambiente nativo. Ele equilibra resolução temporal e espacial para observar fenômenos biológicos em tecido vivo de forma eficaz.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Microscopia
- Imagem de células vivas
Antecedentes
- Importância de manter condições fisiológicas na imagem
- Dificuldades na observação de processos celulares dinâmicos
- Comparação com técnicas tradicionais de microscopia
Métodos Utilizados
- Imagem em tempo real com super-resolução
- Testículos de Drosophila como sistema biológico
- Uso de sondas fluorofóricas e microscopia confocal de disco giratório
Resultados Principais
- Visualização aprimorada da dinâmica e da morfologia dos microtúbulos
- Revelação da nucleação assimétrica dos microtúbulos e suas interações com a membrana nuclear
- Permitiu a observação da fixação do centrômero durante a metáfase e a prófase
Conclusões
- Este estudo demonstra a eficácia da imagem de super-resolução para observar a dinâmica celular.
- O método contribui significativamente para a compreensão dos processos celulares na biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de super-resolução em tempo real em tecidos intactos permite a observação de alta fidelidade de processos subcelulares dinâmicos sob condições fisiológicas, preenchendo uma lacuna crítica na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Ao preservar a resolução espacial e temporal sem exigir sondas especializadas ou alta iluminação, este método viabiliza triagens fenotípicas confiáveis e o desenvolvimento de ensaios em sistemas relevantes para doenças. Sua compatibilidade com fluoróforos endógenos de baixa intensidade amplia a aplicabilidade a fluxos de trabalho de descoberta precoce, onde a confiança no alvo e o valor preditivo são fundamentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a visualização direta do engajamento do alvo e da localização subcelular no contexto nativo do tecido, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Apoia o teste de hipóteses sobre a dinâmica proteica e a formação de complexos sem artefatos de fixação.
- Valor Traducional: Facilita a avaliação da confiança no alvo em modelos relevantes para doenças, como nichos de células-tronco.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas da morfologia dos microtúbulos, padrões de nucleação e interações com organelas para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite a aquisição de imagens em lapso de tempo com baixa fototoxicidade, apoiando campanhas de triagem longitudinais.
- Valor Traducional: Gera dados reprodutíveis e de alto conteúdo, adequados para validação de alvos e otimização de compostos líderes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta a fase de descoberta e a fase pré-clínica ao observar processos celulares em tecido intacto sob condições próximas às fisiológicas.
- Valor Operacional: Mantém a morfologia tecidual e a função celular por períodos prolongados de imagem, apoiando estudos longitudinais.
- Valor Traducional: Permite observações adjacentes a biomarcadores, como o remodelamento da membrana nuclear e a assimetria do centríolo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer leituras de super-resolução que orientam decisões de validação de alvo e identificação de compostos ativos antes do investimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Permite a investigação orientada por hipóteses sobre a dinâmica do citoesqueleto e interações nucleocitoplasmáticas em tecido vivo.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis, adequadas para padronização de ensaios e avaliação de efeitos de compostos.
- Análises: Gera conjuntos de dados de super-resolução que quantificam números de microtúbulos, taxas de alongamento e organização espacial para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade desde a observação em nível subcelular até fenótipos em nível tecidual em nichos de células-tronco.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a diversos tipos celulares e modelos de doenças sem necessidade de engenharia de sondas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao resolver mecanismos subcelulares invisíveis à microscopia limitada pela difração.
- Valor Operacional: Oferece padronização por meio da imobilização de espécimes, imageamento com laser de baixa intensidade e fluxos de trabalho de processamento em lote.
- Valor Estratégico: Reduz a eliminação em estágios avançados ao melhorar a fidelidade da validação de alvos em contextos fisiologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio da redução de riscos mecanicistas em alvos do citoesqueleto e nucleoesqueleto.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos vivos, microscopia de super-resolução e pipelines de processamento de imagens.
- Depende do acesso a sistemas de super-resolução com capacidades Airyscan ou equivalentes e câmaras de controle ambiental.
- Necessita padronização na preparação do espécime, montagem e composição do meio entre diferentes usuários e locais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes níveis de fragilidade tecidual, autofluorescência e acessibilidade genética além dos testículos de Drosophila.
- Limitado pela necessidade de marcação genética dos alvos com fluoróforos compatíveis, como EGFP ou mCherry, em loci endógenos.
