Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

O objetivo geral deste procedimento é descrever um sistema abrangente para sequenciamento de amostras de câncer desafiadoras que combina reagentes de laboratório úmido, controles padronizados e um suporte ao longo do conjunto de bioinformática. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como sequenciar biópsias tumorais de baixa quantidade e baixa qualidade para obter análises e interpretações precisas de variantes de DNA. A principal vantagem desse método é que as amostras difíceis de sequenciar são aquelas que simplesmente têm quantidades limitadas de DNA disponíveis e podem ser analisadas de forma rápida e confiável usando reagentes e controles de fonte única e software de bioinformática totalmente integrado.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à complexidade do NGS direcionado, que este método simplifica. No entanto, os procedimentos para quantificação de bibliotecas e agrupamento de amostras requerem atenção especial para obter uma cobertura uniforme em todas as bibliotecas de amostras. Este protocolo integra processos de bancada úmida e seca para o sequenciamento de amostras de câncer desafiadoras.

O primeiro passo é a quantificação e qualificação do DNA para determinar o número de cópias do molde de DNA que podem ser amplificadas por PCR em tempo real. Inicie o procedimento de quantificação da amostra e controle de qualidade preparando uma quantidade suficiente de uma mistura principal em um tubo de microcentrífuga. Use os seguintes volumes por amostra, 5 microlitros de mistura principal 2x, 0,5 microlitros de mistura de sonda de primer, 0,5 microlitros de mistura de sonda de primer de inibição, 0,05 microlitros de ROX e 2,95 microlitros de diluente.

Adicione nove microlitros da mistura principal em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione um microlitro dos padrões de DNA em duplicata e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Depois de garantir que a amostra de ácido nucleico esteja bem misturada, adicione um microlitro da amostra à mistura principal e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes.

Coloque a placa selada no sistema de PCR. Realize ciclos de PCR de 10 minutos a 95 graus Celsius, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos a 95 graus Celsius e um minuto a 60 graus Celsius. Analise os dados de qPCR gerando um gráfico de regressão linear para cada um dos padrões de DNA duplicados.

A concentração do DNA desconhecido no número de cópias funcionais ou amplificáveis por microlitro é então calculada conforme descrito no texto do protocolo. O próximo passo após a quantificação da amostra e o controle de qualidade é o enriquecimento das sequências de pontos quentes do câncer por PCR multiplex de tubo único. Gene específico ou gsPCR, será realizado para enriquecer 46 loci em 21 genes de câncer.

Prepare uma quantidade suficiente de master mix de gsPCR em um tubo de microcentrífuga usando os seguintes volumes por amostra, cinco microlitros de master mix de amplificação 2x e um microlitro de painel de primer pan-cancer. Alíquota de seis microlitros da mistura mestre gsPCR em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione quatro microlitros de cada amostra de ácido nucleico em poços individuais.

Misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Inclua os controles apropriados. Coloque a placa selada no termociclador para os seguintes ciclos de PCR.

Cinco minutos a 95 graus Celsius. 15 segundos a 95 graus Celsius seguidos de quatro minutos a 60 graus Celsius por dois ciclos. 15 segundos a 95 graus Celsius seguidos de quatro minutos a 72 graus Celsius por 23 ciclos.

Uma extensão final de 10 minutos a 72 graus Celsius, seguida de quatro graus Celsius. Após a PCR específica do gene, execute 10 ciclos de tag-PCR para incorporar adaptadores específicos da plataforma para compatibilidade com o sequenciamento de próxima geração. Adicione 7,5 microlitros da mistura principal de índice 2x e 5,5 microlitros de um código de índice a um poço especificado em uma placa de 96 poços e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes.

Abra cuidadosamente a placa gsPCR e adicione dois microlitros de produto gsPCR à nova placa com a mistura master. Coloque a placa selada no termociclador para os seguintes ciclos de PCR, cinco minutos a 95 graus Celsius, 30 segundos a 95 graus Celsius, 30 segundos a 55 graus Celsius e um minuto a 72 graus Celsius por 10 ciclos e uma extensão final de 10 minutos a 72 graus Celsius. Seguido por quatro graus Celsius.

Após o tag-PCR, a purificação da biblioteca e a seleção do tamanho são realizadas usando a química do grânulo magnético. Comece este procedimento adicionando 11 microlitros de esferas magnéticas de preparação pura de biblioteca em poços separados de uma placa de 96 poços. Abra a placa de PCR e adicione 10 microlitros de produto de PCR às esferas e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes.

Incube a mistura por quatro minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa de 96 poços em um suporte magnético por quatro minutos. Com a placa de 96 poços ainda no suporte, remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta.

Depois de lavar os grânulos duas vezes com etanol contendo tampão de lavagem, conforme descrito no texto do protocolo, seque os grânulos por dois minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova a placa do suporte. Ressuspenda as esferas adicionando 20 microlitros de tampão de eluição a cada poço e pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Incube por dois minutos em temperatura ambiente.

Coloque a placa de 96 poços de volta no suporte magnético por quatro minutos e remova e transfira cuidadosamente 18 microlitros do sobrenadante transparente para um poço em uma nova placa de 96 poços. O próximo passo neste protocolo é a quantificação de cada biblioteca de amostras purificadas por PCR em tempo real relativamente competitivo. Para iniciar este procedimento, prepare uma quantidade suficiente da mistura principal LQ em um tubo de microcentrífuga usando os seguintes volumes por amostra, cinco microlitros de 2x mistura mestre LQ, dois microlitros de mistura de sonda de primer LQ, 0.5 microlitros de padrão LQ e 0.5 microlitros de LQ ROX.

Adicione 8 microlitros da mistura principal LQ a um poço de uma placa óptica de 96 poços. Em poços separados, adicione dois microlitros de uma diluição em série da biblioteca, dois microlitros de controle positivo LQ e dois microlitros de diluente LQ e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Coloque a placa selada no sistema de PCR e atribua detectores FAM e VIC para cada amostra.

Realize a amplificação de PCR usando as seguintes condições de ciclismo, cinco minutos a 95 graus Celsius e 15 segundos a 95 Celsius, seguidos de um minuto a 60 graus Celsius por 40 ciclos. A concentração de cada amostra é então calculada conforme descrito no texto do protocolo. Após a quantificação da biblioteca, cada biblioteca de amostras é normalizada com base em sua concentração medida e agrupada em um único tubo para sequenciamento.

Um módulo de análise simplificado é usado para facilitar os cálculos para normalização de bibliotecas e agrupamento de amostras. Para normalizar a biblioteca, primeiro determine a concentração média em nanomolar em todas as amostras, cada uma contendo um índice único de pares a ser agrupado. Em seguida, determine o volume da amostra individual em microlitros a serem agrupados multiplicando a concentração média em todas as amostras por cinco e, em seguida, dividindo por sua concentração individual.

Adicione o volume normalizado de cada amostra a um único tubo de microcentrífuga para criar o pool de amostras. Diluir o conjunto de amostras para 1,25 nanomolar utilizando um diluente de sequenciação. Prepare o pool de amostras para sequenciamento desnaturando-o na presença do phix control V3. Combine o seguinte, 15 microlitros de amostra de 1,25 nanomolar, três micorlitros de 0,5 nanomolar phix e dois microlitros de hidróxido de sódio 1N.

Após um breve vórtice e centrifugação, incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente. Adicione 8 microlitros da biblioteca desnaturada a 992 microlitros de tampão alto HT1 pré-resfriado em um tubo de microcentrífuga. Adicione 600 microlitros da biblioteca desnaturada e diluída à posição número 17 do cartucho de reagente.

Em tubos de microcentrífuga, diluir separadamente quatro microlitros de cada primer de sequenciamento com 636 microlitros de tampão alto HT1. Adicione 600 microlitros de primers de sequenciamento read-1 diluídos à posição número 18 do cartucho de reagente de sequenciamento. 600 microlitros de primers de leitura de índice diluído para a posição número 19 e 600 microlitros de primers de sequenciamento de leitura 2 diluídos para a posição número 20.

Carregue os reagentes no instrumento de sequenciamento de próxima geração e execute uma extremidade emparelhada, execução de sequenciamento de dois por 150 ciclos de acordo com as instruções do fabricante. Por fim, analise os dados de sequenciamento usando o software de bioinformática complementar. Um total de 90 amostras podem ser processadas em uma única execução de NGS usando um sequenciador de bancada.

Para o conjunto de dados mostrado, as amostras incluíram linhagem celular, parafina clínica residual e fixa incorporada, ou FFPE, e DNA molde sintético e resultaram em sequenciamento de alta profundidade e cobertura uniforme. Os outliers foram compostos por nenhum controle modelo, uma série de diluição de um DNA de linha celular com uma amplificação de grande número de cópias e um DNA FFPE que foi sinalizado para inibição de PCR pelo ensaio de controle de qualidade pré-analítico baseado em qPCR. A uniformidade de cobertura entre os 46 amplicons foi mantida usando três operadores diferentes e para diferentes amostras de DNA FFPE de baixa qualidade.

Na mistura de controle de DNA tumoral FFPE composta por uma mutação conhecida de 5% BRAF V600E foi relatada como tendo a mutação BRAF alvo em uma abundância média de 5,2 mais ou menos 1,3 por cento por três operadores usando uma entrada de 400 cópias amplificáveis. Diluições de amostras de DNA de linhagem celular e FFPE com amplificações do número de cópias demonstraram dependência para amplificação de EGFR e KRAS. Importante, a entrada de DNA FFPE pode ser reduzida para apenas 50 cópias amplificáveis ou 1,2 nanogramas de DNA em massa.

Preservando a detecção de mutações conhecidas sem chamadas de falso positivo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 11 horas com cerca de três horas e meia de tempo prático para um tamanho de lote de 24 amostras por vez, se for executada corretamente.