Name: Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a detectar mutações acionáveis em tumores sólidos e hematológicos usando sequenciamento de nova geração. Este método permite identificar alterações genéticas para guiar terapias direcionadas em oncologia de precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostariam de agradecer a ajuda de Daniel selvagem para a leitura do manuscrito e assistência na produção.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

<html> Como os dois testes NGS descritos neste manuscrito são oferecidos clinicamente, a consideração prática mais importante é o controle de qualidade. Especificamente, perto consideração deve ser dada à qualidade e quantidade de DNA extraído. Isto é especialmente importante para as amostras FFPE que são muitas vezes altamente degradada com um rendimento de ADN variável. Um método de precipitação com isopropanol foi desenvolvido a fim de maximizar o rendimento de ADN a partir de amostras de FFPE como métodos baseados em colunas foram encontrados para levar, por vezes, a tosquia de ADN com volumes de eluição limitados. Portanto, a maior parte do tempo quando uma amostra produz muito baixa concentração ou é muito degradada para o ensaio, isto é provavelmente devido ao tamanho do tecido, o tipo ou a fixação e não o processo de extracção. Para amostras / da medula óssea do sangue, se houver uma falha de extracção, é geralmente devido a um hemodilute amostra a ser (ou seja, não tendo o número suficiente de células brancas do sangue ou tumores em que sorteio) ou quimio extirpadas. . Nt &quot;&gt; Durante a validação, pontos de corte para a aceitação da qualidade e quantidade de DNA deve ser estabelecida A entrada recomendada de 100-250 ng é muitas vezes usado no ensaio; no entanto, se a qualidade do DNA é boa, em seguida, mais baixos valores de entrada pode ser bem sucedido. Além disso, se a qualidade do DNA é deficiente (ou seja, a quantidade de ADN amplificável é menos de 100-250 ng), em seguida, quantidades de entrada mais elevadas podem melhorar a qualidade dos resultados da sequenciação (uma vez que a quantidade de ADN amplificável irá alcançar a entrada recomendada) . Métricas para a qualidade e quantidade de DNA deve ser aplicado a cada amostra antes de avançar o DNA em preparação biblioteca. Essas amostras em uma &quot;zona cinzenta&quot; (ver Figura 2) deve ser executado a critério do diretor do laboratório ou pessoa designada. Atualmente o melhor forma de prever se o ADN não será um bom desempenho durante a sequenciação é a realização de um ensaio à base de qPCR que permite a quantificação e a qualidade de avaliação de ADN de entrada. Esta abordagem elimina a bioavailability de diferentes fragmentos de tamanho na amostra, através da amplificação de diferentes fragmentos de tamanho (por exemplo, 100 pb, 150 pb, 200 pb e 300 pb) e comparação de rendimento. Actualmente, a preparação da biblioteca envolve um grande número de etapas manuais que um passo em falso em um dos vários momentos pode causar a biblioteca para falhar ou ser de má qualidade. A análise gel microfluídico é o único passo QC para verificar um problema de biblioteca de preparação antes de seqüenciamento. Consequentemente, existem diversos passos críticos onde atenção adicional pode aumentar a probabilidade de uma reacção bem sucedida. É imperativo para garantir a amostra correcta e banco de oligonucleótidos são utilizadas para cada espécime. Garantir e devidamente gravação que cada amostra contém uma das 96 combinações únicas de pares de primers de PCR de dupla indexado reduz a chance de um mix de amostra para cima. Além disso, é importante para garantir a placa de filtro (FPU) drena correctamente; se não drenar adequadamente esta pode causar o exteetapa nsion-ligadura da preparação biblioteca para executar subótima e levar a qualidade dos dados de sequenciamento pobres. Após biblioteca QC, é crítico para assegurar que os grânulos estejam totalmente LNB1 ressuspensas e que a solução LNB1 / LNA1 é bem misturado antes de adicionar as amostras como a concentração desta mistura é usada para determinar a molaridade da biblioteca. Finalmente, se o passo de eluição do grânulo leva a uma quantidade sub-óptima de biblioteca eluindo fora dos grânulos que irá diminuir a densidade de agrupamento e, eventualmente, causar a biblioteca para obter a cobertura não significativo adequada. Por outro lado, um excesso da biblioteca vai levar a uma qualidade lê. Portanto, é importante ser consistente na etapa de normalização baseadas em esferas para assegurar o agrupamento óptima e agrupamento das bibliotecas no sequenciador. Além disso a preparação da biblioteca, que é crítico para validar um oleoduto bioinformática que irá produzir as chamadas de mutações precisas, a partir dos arquivos fastq desmultiplexado em bruto. escolhendo umsolução personalizada pode ser demorado, pois há muitos alinhadores de código aberto e disponíveis comercialmente, os chamadores variantes, e pacotes de software NGS que seria preciso peneirar. algoritmos personalizados terá de ser concebido para obter estatísticas de desempenho essenciais, identificar mutações recorrentes únicas que escapado ferramentas de código mais abertos e determinar o status do número de cópias sobre cada um dos loci. Durante o processo de validação de um oleoduto bioinformática, é importante para determinar os pontos de corte reportados para as variantes que satisfazem ou excedem tanto uma profundidade mínima de cobertura depois da filtragem da qualidade (por exemplo, um mínimo de 250 leituras) e uma frequência de alelos mínimo (por exemplo, 4 %). Uma vez que este um ensaio baseado em amplicão multiplexados, é importante para determinar o comprimento médio mínimo da profundidade de cobertura (por exemplo, 1.000 vezes) que a biblioteca necessita para conseguir a ser capaz de obter o menor fragmento amplificado realizando a profundidade mínima de leituras. Além disso, a natureza multiplexada do ensaio faz Cause off efeitos alvo e estes &quot;artefatos&quot; terá de ser descoberto e totalmente controlados antes do lançamento. Outra limitação importante para o ensaio descrito é a necessidade de amostras para conter mais de 10% do tumor, a fim de atingir a frequência do alelo menos validado. A detecção de frequência baixa, 1%, inserções FLT3 é evidência de que a análise manual é ainda desejável neste processo. Mesmo com um corte de 5% freqüência do alelo, algumas mutações importantes talvez não atendidas e, assim, a revisão manual será essencial para determinar estas variantes. Para FLT3-ITD, inspeção visual do exão 14 é realizada para todos os pacientes com LMA para garantir um nível baixo ou grande inserção / duplicação não passa despercebido. Além disso, HER2 exão 20 inserções que são vulgarmente próxima à sequência de iniciador, necessitar de intervenção manual. Apesar de ter um pipeline de bioinformática robusta, algumas variantes poderia passar despercebida, que é apenas a natureza de ter um corte durooff para a maioria das estatísticas mencionadas acima. bioinformática melhores seriam necessários para ajudar a aliviar este problema, assim como as metodologias de preparação e / ou sequenciamento melhor biblioteca, porque é mais vantajoso ter dados de qualidade a cortes ainda mais baixas que contêm menos artefatos e falsos positivos. A detecção e a interpretação de frequências de alelos pode ser difícil devido à dificuldade na determinação de tumores e de polarização percentagem amplificação de algumas regiões do genoma. Além disso, as frequências de alelos mais de 50% pode ser detectada, como observado no caso 2. Isto é interpretado como uma perda de heterozigotia (LOH) evento, quer devido à perda do alelo normal, o que conduz ao aumento aparente de mutante lê, uma ganho do alelo mutante (por exemplo, 2 mutante e uma cópia normal) ou outros mecanismos. Estes mecanismos podem ser elucidadas pela utilização de matriz de hibridação comparativa genómico (aCGH 19) e / ou uma matriz de genotipagem de SNP. 20. As metodologias de enriquecimento alvo atuais contam com procedimentos de dia inteiro de qualquer das técnicas de PCR multiplexados captura híbrida ineficiente ou que resultam na necessidade de uma maior cobertura sequenciamento de uma única amostra e mais off sequenciamento alvo lê. Aplicações adicionais para oncologia molecular NGS esperadas no futuro próximo, irá incluir mais fáceis métodos de preparação de bibliotecas que podem ser completamente automatizável e ser capaz de processar as amostras com quantidades muito pequenas de ADN de entrada (ou seja, menos de 1 ng), bem como amostras com altamente degradada ADN. Para enfrentar esses desafios, a maioria dos métodos será presumivelmente, baseado na PCR, quer ser uma abordagem de PCR de várias etapas ou uma abordagem PCR singleplex massivamente paralelo. Além disso, o código de barras molecular de produtos de amplificação individuais foi demonstrado reduzir drasticamente fundo sequenciação ruído e irá permitir o teste das amostras com menores proporções de células de tumor para obter frequências alélicas inferiores e avançar para capturar circulating células tumorais. Detecção de mutações associadas à doença em amostras de cancro tem sido padrão de atendimento durante décadas. Historicamente, os genes foram frequentemente testadas sequencialmente, um gene / exão de cada vez, com a identificação de uma mutação que conduz ao fim da sequência de teste. O advento de NGS tem permitido uma abordagem menos tendencioso para sequenciar vários genes associados com muitos cancros em paralelo que conduzem à identificação de múltiplas mutações que estão associados com neoplasia. A utilidade clínica de NGS para a detecção de mutações somáticas no cancro é cada vez mais evidente. De fato, a análise baseada em NGS de amostras de tumor representa um novo paradigma que desafia os testes genéticos tradicional, único, mas a utilidade clínica é muito clara. Laboratórios clínicos têm hoje a oportunidade excitante para se casar com a validação do método cuidadoso e interpretação do teste com a aplicação desta poderosa tecnologia.

sequenciamento de próxima geração (NGS) de espécimes clínicos de oncologia tornou-se mais amplamente disponível ao longo dos últimos anos, como o crescimento pontos literatura científica para a importância de identificar as mudanças genéticas segmentáveis ​​e marcadores moleculares preditivos / prognósticos. Painel multi-gene análises e estudos de sequenciamento exome inteiras em ambos os epiteliais 1,2 e hematológica 3 malignidades ter solidificado o conceito de heterogeneidade do tumor e evolução clonal como a doença progride e recaídas. Além disso, ao contrário de tecnologias concorrentes como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou seqüenciamento Sanger, NGS pode detectar a maioria das alterações genômicas em todos os genes do cancro clinicamente relevantes em um único ensaio 4. O Centro de Diagnóstico personalizados inicialmente lançado com dois painéis clínicos NGS, um costume Painel hematológica (Heme-NGS Panel) e um off-the-shelf Cancer Panel para amostras FFPE (Solid-NGS painel) (veja <strong&gt; Figura 1). Estes painéis cobrir regiões de interesse clinicamente relevantes ou altas dos genes selecionados; nem todos os genes ou exons são totalmente cobertos. Amplicões são gerados por hibridação sonda seguido por extensão e ligação. As regiões-alvo são ainda mais amplificada utilizando PCR com primers universais duplas-indexados, permitindo que até 96 amostras a reunir para o sequenciamento. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> Figura 1:. Lista de Genes abordados nos painéis preparação Biblioteca é realizada usando o costume Painel hematológica (Painel Heme-NGS) de 33 genes ou o off-the-shelf Cancer Panel Amplicon (Solid-NGS) de 47 genes. Nem todos os genes ou exons são cobertos na totalidade, como alguns produtos de amplificação só pode cobrir certos hotspots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. &lt;</a>/ A&gt; O conteúdo do painel de heme-NGS foi derivado de várias fontes, mas gira em torno de 16 genes mutados na leucemia mielóide aguda (LMA), previamente descrito como demonstrando um elevado nível de utilidade clínica 5. O Painel Solid-NGS é produzido comercialmente com as regiões-alvo com base em genes comumente mutado no cancro como relatado no Catálogo de somáticas Mutações em Câncer (COSMIC) do banco de dados 6. Vários passos-chave caracterizar o fluxo de trabalho geral para NGS clínicos. Após o médico ordena o teste, um patologista determina a adequação do espécime após a análise da percentagem de tumor e volume da amostra. Em nossa instituição, exigimos pelo menos 10% do tumor devido à taxa de fundo de sequenciação de erro ( &quot;ruído&quot;) da tecnologia e da eficiência da abordagem específica. Se o tecido é adequada para o teste, o ADN genómico é extraído. Este ADN é então sujeito a um controlo de qualidade múltipla (QC) etapas. Se o DNA passa QC, uma biblioteca de fragmento amplificado é gerado e sequenciado. Os dados resultantes são analisadas através de um gasoduto de bioinformática in-house. Após a análise bioinformática, as variantes são manualmente revisto e interpretado por patogenicidade antes da incorporação um relatório clínico. Abaixo descrevemos dois casos que passaram por esta rigorosa do fluxo de trabalho e, finalmente, levou a mudanças no manejo clínico. Caso 1 - Leucemia Mielóide Aguda A biópsia de medula óssea do doente A era de diagnóstico para a AML, sem maturação. Os estudos citogenéticos foram enviados sobre o espécime de medula óssea e demonstraram um cariótipo feminina normal. Houve 95% de blastos circulantes presentes, por isso, uma amostra de sangue periférico foi enviado para testes de diagnóstico personalizado no Painel de Heme-NGS. A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença maligna hematológica da linhagem mielóide de células brancas do sangue. a detecçãode mutações genéticas em AML tornou-se cada vez mais importante para o prognóstico e tratamento, com mutações genéticas recorrentes reconhecidos como importantes na patogênese e prognóstico 7. Mutações no NPM1 e CEBPA têm sido associados com um risco prognóstico favorável, enquanto duplicações em tandem internas (ITD) em FLT3 têm sido associados com um resultado menos favorável 8. Um crescente corpo de evidências suporta um papel patogênico para estas e outras mutações na AML 9. Caso 2 - Lung Adenocarcinoma A biópsia de uma massa supraclavicular esquerdo de paciente B demonstrou adenocarcinoma pulmonar. material de biópsia a partir da (FFPE) em massa do linfonodo embebidos em parafina e fixado em formalina foi enviada para o teste genómico (painel sólido-NGS) como rolos / cachos com tumores maiores do que 50%, para identificar se uma mutação estava presente para a intervenção terapêutica alvo. Lung cancer é a principal causa de mortalidade relacionada com o cancro nos Estados Unidos e é dividido em tipos principais, cancro dois pulmão de não pequenas células (NSCLC) e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). NSCLC pode ser ainda definido como qualquer um adenocarcinoma ou carcinoma de células escamosas, com base na histologia da lesão. Adenocarcinoma pulmonar é o subtipo mais comum de câncer de pulmão, visto em ambos os fumantes e não-fumantes, e é a forma mais comum de câncer de pulmão em não-fumantes 10. Estudos moleculares de adenocarcinomas do pulmão foram identificadas mutações em vários oncogenes 11. As mutações driver mais comuns identificados em fumantes são mutações no KRAS e BRAF. As mutações mais comuns em não-fumantes são mutações em EGFR, e rearranjos envolvendo os genes ALK, RET e ROS1. Tumores pulmonares foram descritos com um exão 20 de inserção em grelha no gene de ErbB2 (HER2 / neu). A anormalidade mais comum no HER2 / neu é uma amplificação de neste locus no cancro da mama para os quais uma terapia-alvo está disponível (trastuzumab: um anticorpo monoclonal humanizado contra HER2 / neu). O HER2 / neu exão 20 de inserção que é observado em 2-4% de pulmão adenocarcimomas 12 demonstrou uma resposta parcial ao tratamento com combinação de HER2 / neu e inibidores de mTOR (neratinib e temsirolímus, respectivamente) 13.

<table><tbody><tr><td>Tela de DNA genômico Fita</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de DNA genômico</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>Tela D1000 de alta sensibilidade</td> Tecnologia <td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes D1000 de alta sensibilidade</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise TapeStation</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>A.01.04 ou superior</td><td></td></tr><tr><td>Racks de Armazenamento de Tubos de 96 poços</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack de Tubos de 15/50 ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack de Placas de 96 poços</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, single-channel, 0.5&ndash; 2,5 &mu; l</td><td>Qualquer Pipeta de Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanal, 1&ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipeta de Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanal, 2&ndash; 20 &mu; l</td><td>Pipeta de Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanal, 10&ndash; 100 &mu; l</td><td>Pipeta de qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, canal único, 20&ndash; 200 &mu; l</td><td>Pipeta de Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, monocanal, 100&ndash; 1.000 &mu; l</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetador sorológico</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga (para tubos e tubos de tira)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer, -20 &deg; C</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Geladeira</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água ou Banho de Contas</td><td>Qualquer Incubadora de Fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(37 &deg; c)</td> Pipetas sorológicas <td>de qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1&nbsp; ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Pipetas Sorológicas, 5&nbsp; ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Pipetas Sorológicas, 10&nbsp; ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Pipetas Sorológicas, 25&nbsp; ml</td><td>Qualquer Vendedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Barbear Qualquer</td><td>Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 15 ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 50 ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de Papel</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol de 200 provas</td><td>Qualquer Vendedor</td><td></td><td>Loja em Armário Inflamável</td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Qualquer Loja Vendedora</td><td></td><td>em Armário Inflamável</td></tr><tr><td>Reservatórios de 25 ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, 8 canais, 1 &ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipeta de qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 canais, 10 &ndash; 100 &mu; l</td><td>Qualquer Pipeta de Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 canais, 20 &ndash; 300 &mu; l</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balde de Gelo</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de Água Esguicho</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de Álcool Esguicho</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de Limpeza de Lentes</td><td>Qualquer</td> Fornecedor Placas de Fornecedor<td></td><td></td></tr><tr><td>, 96-well PCR, Semi-Skirted</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo, 8-well, 0.2&nbsp; ml</td><td>Qualquer Fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ ou 3000-T elm</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Calibrador</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Calibrador</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>Calibrador (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Software</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filme de vedação de placa</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Folha de vedação de alumínio</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de água pura sem nuclease</td><td>EMD Centrífuga Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Rotadores de tubo e placa de 15 ml, de preferência uma centrífuga que pode ir até 2.500 x g.</td></tr><tr><td>Tubo Safe-Lock 1,5 ml, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 5 ml, Tubo DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Qualquer centrífuga rotadora de placas funcionará</td></tr><tr><td>Incubadora de Microamostras Hybex</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0,2 ml Bloco de Tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Amplicon TruSeq - Painel de câncer</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 reações</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon</td><td></td><td>Illumina PE-940-1011</td><td>96 reações</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 índices, 384 amostras</td></tr><tr><td>Kit de reagentes MiSeq v3, 500 ciclos</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes MiSeq v2, 300 ciclos</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Reagentes MiSeq v2, 500 Ciclos</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 ou superior</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 ou superior</td><td></td></tr><tr><td>Visualizador de Análise de Sequenciamento</td><td>Illumina</td><td>1.8 ou superior</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fixação e Colar de Placa de Índice TruSeq</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Placa de Filtro</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Índice Tampas de Substituição</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml Tubos</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit</td> <td>de Ensaio de Amplo AlcanceSuporte Magnético Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96, Saia Lateral</td> Sistema de PCR <td>GeneAmp Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>9700 (bloco de ouro/prata)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Sangue Gentra Puregene</td><td>Solução de</td> Desparafinização <td>Qiagen 158489</td><td></td></tr><tr><td>(16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Buffer ATL (4 x 50ml)</td><td>Solução</td> de Precipitação <td>de Proteína 939011</td><td></td>Qiagen</tr><tr><td>(50 ml)</td> Solução de Hidratação de DNA <td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>(100 ml)</td> Solução <td>de Glicogênio 158914</td><td></td> <td>Qiagen</td></tr><tr><td>(500&nbsp; &mu; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181; l pontas alongadas da pipeta do filtro em cremalheiras esterilizadas, 10 cremalheiras de 96 pontas (960 pontas).</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181; l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks, racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu; l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks, racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1,000 &mu; l pontas de pipeta de filtro XL naturais e graduadas nos</td><td>EUA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

próxima geração sequencing para detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

À medida que nossa compreensão das mutações condutoras necessárias para a iniciação e progressão dos cânceres melhora, obtemos informações críticas sobre como os perfis moleculares específicos de um tumor podem prever a capacidade de resposta a agentes terapêuticos ou fornecer conhecimento sobre o prognóstico. Em nossa instituição, um programa de genotipagem de tumores foi estabelecido como parte dos cuidados clínicos de rotina, rastreando tumores hematológicos e sólidos para um amplo espectro de mutações usando dois painéis de sequenciamento de próxima geração (NGS): um painel personalizado de 33 malignidades hematológicas de genes para uso com sangue periférico e medula óssea e um painel de tumor sólido produzido comercialmente para uso com tecido embebido em parafina fixado em formalina que tem como alvo 47 genes comumente mutados no câncer. Nosso fluxo de trabalho inclui uma revisão patologista da biópsia para garantir que haja uma quantidade adequada de tumor para o ensaio, seguida de extração de DNA personalizada no espécime. O controle de qualidade da amostra inclui etapas de quantidade, qualidade e integridade e somente após o DNA extraído passar por essas métricas, uma biblioteca de amplicon é gerada e sequenciada. Os dados resultantes são analisados por meio de um pipeline interno de bioinformática e as variantes são revisadas e interpretadas quanto à patogenicidade. Aqui, fornecemos um instantâneo da utilidade de cada painel usando dois casos clínicos para fornecer informações sobre como um fluxo de trabalho NGS bem projetado pode contribuir para otimizar os resultados clínicos.

Caso 1 - Heme-NGS Painel O DNA extraído a partir de sangue periférico leucémicas era de qualidade suficiente e quantidade (176 ng / mL) para o painel de heme-NGS. A profundidade média geral de cobertura foi de 4,933x (acima da profundidade média mínima de cobertura de 1.000x). Estatísticas adicionais de execução estão na Tabela 3. Dos 8 regiões abaixo cobertura 250x, 3 foram causadas por aparamento imprópria dos iniciadores (isto é, a sequência de iniciador não foi adequadamente removida devido a erros de sequenciação), um era um artefato conhecido do ensaio, e os outros 4 eram regiões parciais de exons de diferentes genes sem variantes reportáveis. Embora o nosso protocolo clínico inclui apenas relatando variantes cobertos por, pelo menos, 250 lê, todos os dados com pelo menos 100 leituras são importados para o banco de dados para análise. processamento de dados from do gasoduto bioinformática detectados três mutações reportáveis, associados à doença; uma mutação missense no FLT3, uma mutação missense no IDH2, e uma mutação frameshift em NPM1. As variantes exï¿½icas com suas freqüências alélicas estão descritos na Tabela 4. Uma mutação comum em FLT3 é a FLT3 -Internal duplicação tandem (ITD), que não é chamado automaticamente pelo nosso pipeline e requer uma inspecção visual do exão 14. Inspecção visual do exão 14 de FLT3 não mostrou inserção ou duplicação na amostra apresentados. A FLT3 I836del estava na freqüência do alelo 1% e não foi incluído no relatório final porque caiu abaixo da freqüência do alelo mínimo validado de 5%. Esta mutação não é na mesma molécula de ADN como a mudança de FLT3 D835Y (isto é, observada na mesma região amplicão, mas não em &quot;cis&quot;, em qualquer das sequenciação leituras) e apenas foi observada por avaliação manual da fi .bamles ao verificar a mudança p.D835Y. As frequências alélicas inferiores das duas mutações de FLT3 sugere que estas mutações podem representar heterogeneidade e / ou evolução clonal; No entanto, a diferença pode ser devido ao desempenho do ensaio para que amplicão ou um polimorfismo de um único nucleótido-(SNP), perto ou sobrepostas a sequência iniciadora que afectou a amplificação desse alelo. Os resultados do Painel Heme-NGS Para o caso 1 com mutações AML identificados em FLT3, IDH2 e NPM1, três genes comumente mutados em AML. As mutações em FLT3 são observados em ~ 25% dos pacientes adultos com leucemia mielóide aguda (banco de dados COSMIC 17) e são ou duplicações em tandem interna (ITD) ou mutações missense no domínio da tirosina quinase. Os FLT3-ITD é a mutação mais comum e está associado com má resposta à quimioterapia padrão, enquanto o significado prognóstico da FLT3 quinase dmutações pontuais omain, como visto neste paciente AML, tem um impacto claro sobre o prognóstico 14. Isocitrato desidrogenase 2 (NADP +), mitocondrial (IDH2) é um gene que codifica um modificador epigenética que é comumente mutado em AML. Mutações nos modificadores epigenética são relativamente comuns no LMA, com mutações em IDH1 e DNMT3A representam outras mutações nesta classe de genes que levam a desregulação do gene. As mutações no gene de nucleofosmina (NPM1) são uma das mutações mais comuns adquiridas em AML e são geralmente considerados a ser um bom factor de prognóstico (na ausência de um FLT3 - ITD). Co-mutações de NPM1 e o IDH2 têm sido descritos na literatura como um indicador de prognóstico favorável 5, com um 3-ano de sobrevivência global de 89%. Isto representa uma vantagem de sobrevida significativa quando comparada com a sobrevivência geral de 3 anos detipo selvagem NPM1 e IDH2 de 31%. Por exemplo, padrão de prática de cuidados inclui a análise de mutação para NPM 1 e mutações FLT3-ITD. Neste cenário, a detecção de apenas uma mutação NPM1 não seria suficiente para adequadamente paciente stratify para o risco, como as mutações secundárias pode ser favorável (por exemplo, IDH2) ou desfavorável (por exemplo, TET2), reduzindo a confiança para aliviar um transplante de medula óssea. Caso 2 - Painel de Solid-NGS ADN extraído a partir do tecido FFPE era de qualidade e em quantidade suficiente para o Solid-NGS painel, com uma concentração de 252 ng / mL e apenas 4% do ADN abaixo de 1.000 pares de bases (pb). Após a análise dos dados a profundidade média de cobertura foi de 9.167 lê (bem acima da nossa corte profundidade mínima de 1.000 leituras) sem regiões abaixo de 250 profundidade de leitura. métricas QC adicionais estão shoWN na Tabela 3. Dados processados ​​através do gasoduto bioinformática detectadas duas mutações associadas à doença: uma inserção em quadro no exão 20 de ErbB2 (Her2 / neu) e uma mutação missense no TP53. Todas as variantes exï¿½icas com suas freqüências alélicas estão representados na Tabela 5. A inserção no ERBB2 na verdade representa uma seqüência conjunto duplicado (Her2 / neu), como refletido na nomenclatura. Identificação e confirmação da revisão manual em quadro de inserção necessária do sequenciamento lê através IGV. A detecção das frequências de mutação de mais do que 50%, como pode ser visto, tanto para o gene TP53 e o Her2 / neu mutações é sugestivo de uma perda de heterozigotia (LOH) evento (ver discussão). Os-NGS sólidos resultados do Painel de Caso 2 com mutações adenocarcinoma de pulmão detectados in ERBB2 (HER2 / neu) e TP53, dois genes que normalmente não são testados como parte do padrão de cuidado atual para pacientes com câncer de pulmão. HER2 / neu codifica um receptor tirosina-quinase semelhante a outro gene comumente mutado no cancro do pulmão, EGFR . A activação de HER2 exão / neu 20 inserções são observados em 2 - 4% de adenocarcinomas do pulmão, são responsáveis ​​pela maioria das mutações de HER2 / neu observados no cancro do pulmão, e são tipicamente observados em tumores sem mutações em outros genes do controlador, tais como EGFR e ALK 12 . Existem várias linhas de evidência mostrando potencial para várias opções de tratamento para pacientes com ativação de inserções HER2 / neu, incluindo resposta parcial a terapia de combinação com HER2 / neu e inibidores de mTOR 13 e controle de doenças significativa com o anticorpo monoclonal Trastuzumab em conjunto com quimioterapia 15. Descobrir uma mudança TP53 não é uncoMMON no cancro, mas neste momento não há terapias viáveis. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Caso 1 </td><td> caso 2 </td></tr><tr><td> Iniciando total Lê </td><td> 2.215.926 </td><td> 2.129.110 </td></tr><tr><td> Percentagem de Lê Mapping </td><td> 98,42% </td><td> 98,29% </td></tr><tr><td> Percentagem de Lê no alvo </td><td> 99,01% </td><td> 97,29% </td></tr><tr><td> Percentagem de Lê no alvo Depois de Filtro </td><td> 97,60% </td><td> 95,45% </td></tr><tr><td> Percentagem de utilizável Lê </td><td> 94,87% </td><td> 91,79% </td></tr><tr><td> Percentagem de Bases acima Cobertura 250x </td><td> 98,40% </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Percentagem de Bases umabove 1000x Cobertura </td><td> 95.90% </td><td> 99,70% </td></tr><tr><td> Cobertura Abaixo 250x - Amplicon Número </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabela 3:. Sequencing Run QC Metrics Este é um resumo das estatísticas de execução mais importantes, não incluindo a cobertura média, que são utilizados para a avaliação de dados para determinar se uma amostra biblioteca prep passou QC. Todo o processo é bem sucedido se todas as percentagens são acima de 90%, mas é possível, com a transição de SW1 ou UB1 no passo de lavagem FPU ou cross-talk iniciador, ter inferior »por cento no alvo&quot; na gama de 80 - 90%. Se o &quot;Percentagem mapeada&quot; é demasiado baixo, que poderia indicar uma contaminação de bactérias ou outro DNA, como todas as amostras devem estar alinhadas para humano. Quando qualquer uma destas especificações estão abaixo de 80%, a amostra é apanhado em nova revisão para ajudar a determinar a forma de proceed e melhorar o processo. <img alt="tabela 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> Tabela 4:.. Caso 1 Resultados detectado patogênicas, doença associada, variantes de significado desconhecido (USV), e variantes exï¿½icas provavelmente benignos acima dos critérios de relatórios de freqüência do alelo 5% estão relacionados <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a> <img alt="tabela 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> Tabela 5:.. Caso 2 Resultados detectado patogénica, doença associada, a variante de significado desconhecido (USV), e as variantes exï¿½icas provavelmente benignos acima dos critérios de relatórios de freqüência do alelo 5% estão listados <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esta tabela</a>. Suplementar Figura 1: Um exemplo de uma base SampleSheet.csv-amplicão. Esta folha transmite para o sequenciador de que a química de correr (neste caso do amplicon), o fluxo de trabalho (por exemplo, GenerateFastq), o que a aplicação e o ensaio (por exemplo, FastqOnly), quantas bases (ou lê) em sequência (neste caso 186 pb x 186 pb), e por último o que as amostras estão associadas com certos índices (neste caso duplo de indexação). As peças que estão destacadas em amarelo pode ser mudada ao que o pesquisador quer, mas neste caso o laboratório usa esses parâmetros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar este valor.</a>

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

O objetivo geral deste ensaio de amplicon direcionado de sequenciamento de próxima geração é detectar mutações patogênicas em tumores de pacientes para uso terapêutico, incluindo diagnóstico, prognóstico e resposta à terapia direcionada. Este método responde a perguntas fundamentais, como se um paciente possui uma mutação em um gene que pode se beneficiar de uma terapia direcionada ou alternativa. A principal vantagem desta técnica é que mutações acionáveis, comuns e raras, em diversos genes, podem ser detectadas em qualquer tecido tumoral utilizando um único ensaio.Como as técnicas e a tecnologia são tão complexas e os passos são tão difíceis de aprender, é fundamental demonstrar este método visualmente. Este é um momento decisivo no avanço da Oncologia Médica. Com a adoção do sequenciamento de nova geração na clínica, teremos tratamentos para o câncer mais numerosos e melhores para nossos pacientes.Nossos tecnólogos do CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy e Joe Grubb, demonstrarão este procedimento. Também ajudarei neste processo para mostrar as partes mais complexas do ensaio. Após extrair o DNA genômico de acordo com o protocolo descrito no texto, seguindo as instruções do fabricante, analise dois microlitros do DNA extraído em um fluorímetro para obter a concentração de trabalho da amostra.Para criar uma Biblioteca de Amplicons, em uma placa de 96 poços semicuberta chamada Placa Hyb, adicione o volume necessário de TE com baixo teor de EDTA, cinco microlitros do Tubo de Oligo do painel e adicione de 100 a 250 nanogramas de DNA genômico a cada poço correspondente. Este é o passo único mais vital, pois qualquer erro aqui terá consequências graves. Após a adição do Reagente 1 de Hibridização de Oligo para Sequenciamento e após centrifugar de acordo com o protocolo descrito, incube a Placa Hyb no incubador de hibridização pré-aquecido a 95 graus Celsius por um minuto.Após resfriar lentamente a estufa a 40 graus Celsius, remova a placa da estufa e transfira todo o volume de cada amostra da Placa de Hibridização para o centro da unidade de placa de filtro previamente preparada e pré-lavada correspondente, ou FPU. Tampe a FPU e centrifugue a 2.250 vezes G e 20 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione 45 microlitros de SW1 e centrifugue novamente.Após uma segunda lavagem com SW1 e uma lavagem com UB1, adicione 45 microlitros da Mistura de Extensão e Ligação 3 a cada poço da amostra e pipeteie para cima e para baixo três vezes para homogeneizar. Utilize folha de alumínio adesiva para selar a placa e incube todo o conjunto FPU em uma incubadora pré-aquecida a 37 graus Celsius por 45 minutos. Para indexar a Amplificação por PCR, organize os primers na Placa de Amplificação de Indexação ou suporte IAP, distribua os indexadores utilizados nos poços correspondentes da placa, adicione então 22 microlitros da Mistura Mestra de PCR, 2E12, e pipeteie para cima e para baixo três vezes.Após centrifugar a reação de ligação com extensão de 45 minutos conforme o protocolo descrito no texto, adicione 25 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolar a cada poço da placa FPU e pipete para cima e para baixo pelo menos seis vezes, garantindo que a ponta da pipeta entre em contato com a membrana. Em seguida, com a placa ligeiramente inclinada e uma pipeta multicanal ajustada para 20 microlitros, pipete o hidróxido de sódio na placa FPU para cima e para baixo pelo menos seis vezes. Transfira o eluato da FPU para a coluna correspondente da IAP.Pipete cuidadosamente para cima e para baixo a fim de combinar completamente o DNA com a Mistura Mestra de PCR antes de executar o programa de PCR descrito no protocolo textual. Após verificar o rendimento da biblioteca e incubar as amostras com as Perlas de Purificação Magnética conforme descrito no protocolo textual, adicione 30 microlitros de EBT a cada poço das perlas lavadas. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para garantir que as perlas se soltem das paredes do tubo.Após a incubação da placa com agitação e, em seguida, sem agitação, coloque a placa no suporte magnético e transfira 20 microlitros do sobrenadante para uma nova placa inteira denominada Placa de Normalização de Biblioteca, ou LNP. Após a preparação da mistura de normalização, com inversões intermitentes e vortexamento da solução, adicione 45 microlitros a cada amostra da LNP. Em seguida, use filme adesivo transparente para selar a placa e agite a 1.800 RPM por 30 minutos.Após lavar as microesferas, retire o LNP do suporte magnético e, para eluir a amostra, adicione 30 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 normal fresco a cada poço. Em seguida, agite o LNP a 1.800 RPM por cinco minutos. Coloque o LNP de volta no suporte magnético e, após o sobrenadante ter ficado límpido, transfira 30 microlitros do eluato para o Buffer de Armazenamento de Normalização de Biblioteca 1 previamente preparado na Placa de Armazenamento.Curve a placa, depois adicione cinco microlitros de cada amostra a ser sequenciada a um tubo de 1,5 mililitro rotulado como Biblioteca de Amplicons Agrupados, ou PAL. Dependendo da química de sequenciamento utilizada, adicione de quatro a dez microlitros do PAL a 590 a 596 microlitros de Tampão HT1. Limpe e carregue a Célula de Fluxo.Carregue os reagentes. E, siga as instruções na tela para iniciar a execução do sequenciamento. Após a conclusão da execução do sequenciamento, execute o Pipeline de Bioinformática.Analise as estatísticas da corrida para garantir que a biblioteca sequenciada tenha atendido aos critérios de controle de qualidade determinados pelo laboratório. Por fim, em um Visualizador de Dados Genômicos, revise manualmente cada variante visualizando os arquivos BAM. Este é um resumo das estatísticas de corrida mais importantes, excluindo a cobertura média, utilizadas para determinar se uma amostra de preparação de biblioteca passou pelo controle de qualidade. Como visto aqui para o Caso Um, a Bioinformática detectou quatro mutações associadas à LMA passíveis de relato.Uma mutação de sentido trocado em FLT3, uma mutação de sentido trocado em IDH2 e uma mutação de desvio do quadro de leitura em NPM1. As mutações em FLT3 são observadas em cerca de 25% dos pacientes adultos com LMA. O significado prognóstico das mutações pontuais no domínio tirosina quinase de FLT3, como observado neste paciente com LMA, tem um impacto pouco claro sobre o prognóstico.A desidrogenase isocitrato 2, ou IDH2, codifica um modificador epigenético que comumente apresenta mutações na LMA. As mutações no gene da nucleofosmina, ou NPM1, são uma das mutações adquiridas mais frequentes na LMA. Esta tabela lista todas as variantes exônicas para o Caso Dois.Duas mutações associadas à doença foram detectadas. Uma inserção em-frame no Éxon 20 de ERBB2 e uma mutação de sentido trocado em TP53. HER2/neu, ou ERBB2, codifica um receptor de tirosina quinase.As inserções ativadoras no éxon 20 de HER2/neu são observadas em dois a 4% dos adenocarcinomas pulmonares e correspondem à maioria das mutações de HER2/neu observadas no câncer de pulmão. Alterações no TP53 também são comuns em câncer. É essencial prestar muita atenção à qualidade e à quantidade do DNA extraído.Isso é especialmente importante para amostras FFPE, que frequentemente apresentam alto grau de degradação e uma quantidade variável de DNA recuperada. Durante o processo de validação do ensaio clínico, devem ser estabelecidas métricas para qualidade e quantidade de DNA em cada amostra antes de prosseguir com a preparação da biblioteca.Além da preparação da biblioteca, é fundamental validar um Plano Espião Bioinformático, determinando valores de corte para a corrida de sequenciamento, estatísticas de controle de qualidade, estatísticas de preparação da biblioteca, profundidade de cobertura de um Amplicon e a frequência alélica mínima relatável. Uma vez dominada, a preparação da biblioteca pode ser realizada em um dia de trabalho. No entanto, o fluxo de trabalho geral do ensaio exige mais tempo para extração de DNA, sequenciamento, processamento de dados e revisão de variantes.Este procedimento é projetado para analisar apenas as mutações no DNA genômico em determinados pontos-chave críticos. Outras análises que utilizam RNA podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como a expressão diferencial de genes, a associação com tumores de risco e os rearranjos estruturais. Avanços significativos estão no horizonte.A adoção da automação e a incorporação de uma barcodificação molecular única permitirão que os laboratórios reduzam o tempo de análise, utilizem menos amostra de entrada e detectem variantes em frequência alélica muito baixa. A detecção de mutações associadas a doenças em espécimes de câncer é padrão de cuidado há décadas. O sequenciamento de nova geração (NGS) é uma abordagem menos tendenciosa para sequenciar múltiplos genes associados a diversos tipos de câncer em paralelo, levando à identificação de múltiplas mutações e a tratamentos melhores para os pacientes.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

next-generation-sequencing-for-detection-actionable-mutations-solid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

Detecção de ácido ribonucleico (cRNA) do sangue que circula é uma necessidade insatisfeita em diagnósticos clínicos. Aqui descrevemos os métodos que caracterizam cRNA de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células usando a reação em cadeia da polimerase digital sensível e específico. Os testes de requisitos de projeto para detectar variantes de fusão dentro de 72 horas.

Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

Este artigo detalha o uso de um kit de preparação de biblioteca com base em reação em cadeia do polymerase multiplex seguido de sequenciamento de próxima geração para avaliar as fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos clínicos. As etapas de análise de dados e de bancada úmida são descritas.

Detecção de fusão gênica oncogênica usando a reação em cadeia de polimerase multiplex ancorada seguida por sequenciamento da próxima geração

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.

Sequenciamento de última geração baseado em amplicon ultrarrápido em câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração automatizado e credenciado pela ISO15189 para detectar alterações genômicas direcionáveis em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Detecção de alterações direcionáveis no câncer de pulmão de células não pequenas usando sequenciamento de última geração

Aprenda a detectar mutações acionáveis em tumores sólidos e hematológicos usando sequenciamento de nova geração. Este método permite identificar alterações genéticas para guiar terapias direcionadas em oncologia de precisão.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Explorar mais vídeos