Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

O objetivo geral deste ensaio de amplicon direcionado ao sequenciamento de próxima geração é detectar mutações patogênicas em tumores de pacientes para uso terapêutico, incluindo diagnóstico, prognóstico e resposta à terapia direcionada. Este método responde a questões-chave, como se um paciente tem uma mutação em um gene que pode se beneficiar de uma terapia direcionada ou alternativa. A principal vantagem dessa técnica é que mutações acionáveis, comuns e raras, em muitos genes podem ser detectadas em qualquer tecido tumoral usando um único ensaio.

Como as técnicas e a tecnologia são tão complexas e as etapas são tão difíceis de aprender, é fundamental demonstrar esse método visualmente. Este é um momento decisivo no avanço da Oncologia Médica. Com a adoção do sequenciamento de próxima geração na clínica, teremos mais e melhores tratamentos de câncer para nossos pacientes.

Nossos tecnólogos de CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy e Joe Grubb demonstrarão esse procedimento. Também ajudarei nesse processo para mostrar as partes mais complexas do ensaio. Depois de extrair o DNA genômico de acordo com o protocolo de texto, seguindo o protocolo do fabricante, execute dois microlitros do DNA extraído em um fluorômetro para obter a concentração de trabalho da amostra.

Para criar uma Biblioteca de Amplicon, em uma placa semi-contornada de 96 poços chamada Hyb Plate, adicione o volume necessário de baixo EDTA TE, cinco mircolitros do Oligo Tube do painel, adicione 100 a 250 nanogramas de DNA genômico a cada poço correspondente. Este é o passo mais importante, pois qualquer confusão aqui terá consequências graves. Após a adição da Oligo Hibridização para Reagente de Sequenciamento 1 e girando de acordo com o protocolo de texto, incube a Hyb Plate na incubadora de hibridização pré-aquecida a 95 graus Celsius por um minuto.

Depois de resfriar lentamente a incubadora a 40 graus Celsius, remova a placa da incubadora e transfira todo o volume de cada sample da Hyb Plate para o centro da unidade de placa filtrante pré-lavada correspondente previamente preparada, ou FPU. Cubra a FPU e centrifugue a 2.250 vezes G e 20 graus Celsius de três minutos. Em seguida, adicione 45 microlitros de SW1 e centrifugue novamente.

Após uma segunda lavagem com SW1 e uma lavagem com UB1, adicione 45 microlitros de Extension Ligation Mix 3 a cada poço de amostra e canalize para cima e para baixo três vezes para misturar. Use papel alumínio adesivo para selar a placa e incube todo o conjunto FPU em uma incubadora pré-aquecida a 37 graus Celsius por 45 minutos. Para indexar a amplificação de PCR, organize os primers na placa de amplificação de índice, ou acessório IAP, e alíquota dos índices que estão sendo usados nos poços correspondentes na placa, em seguida, adicione 22 microlitros do PCR Master Mix, 2E12, e canalize-o para cima e para baixo três vezes.

Em seguida, depois de girar a reação de ligação de extensão de 45 minutos de acordo com o protocolo de texto, adicione 25 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares a cada poço de amostra da FPU e canalize-o para cima e para baixo pelo menos seis vezes, garantindo que a ponta da pipeta entre em contato com a membrana. Em seguida, com a placa ligeiramente inclinada e uma pipeta multicanal ajustada para 20 microlitros, pipete o hidróxido de sódio na placa FPU para cima e para baixo pelo menos seis vezes. Transfira a eluição da FPU para a coluna correspondente do IAP.

Pipete suavemente para cima e para baixo para combinar completamente o DNA com o PCR Master Mix antes de executar o programa de PCR descrito no protocolo de texto. Depois de verificar o rendimento da biblioteca e incubar as amostras com grânulos de purificação magnética de acordo com o protocolo de texto, adicione 30 microlitros de EBT a cada poço de grânulos lavados. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para garantir que as contas saiam da lateral do tubo.

Uma vez que a placa tenha sido incubada com e sem agitação, coloque a placa no suporte magnético e transfira 20 microlitros do sobrenadante para uma placa totalmente nova chamada Placa de Normalização de Biblioteca, ou LNP. Após a preparação da mistura de normalização, com inversão intermitente e vórtice da solução, adicionar 45 microlitros a cada amostra do LNP. Em seguida, use filme adesivo transparente para selar a placa e agite a 1.800 RPM por 30 minutos.

Depois de lavar as contas, remova o LNP do suporte magnético e, para eluir a amostra, adicione 30 microlitros de hidróxido de sódio normal 0,1 fresco a cada poço. Em seguida, agite o LNP a 1.800 RMP por cinco minutos. Coloque o LNP de volta no suporte magnético e, após a limpeza do sobrenadante, transfira 30 microlitros da eluição para o Buffer de Armazenamento de Normalização de Biblioteca 1 previamente preparado na Placa de Armazenamento.

Dobre a placa e adicione cinco microlitros de cada amostra a ser sequenciada a um tubo de 1,5 mililitro rotulado como Pooled Amplicon Library, ou PAL. Dependendo de qual química de sequenciamento está sendo usada, adicione quatro a 10 microlitros do PAL a 590 a 596 microlitros de tampão HT1. Limpe e carregue a célula de fluxo.

Carregue os reagentes. E siga as instruções na tela para iniciar a execução do sequenciamento. Após a conclusão da execução do sequenciamento, execute o Pipeline de Bioinfomática.

Analise as estatísticas de execução para garantir que a biblioteca sequenciada tenha passado pelas métricas de controle de qualidade determinadas pelo laboratório. Por fim, em um Visualizador de dados genômicos, revise manualmente cada variante exibindo os arquivos BAM. Este é um resumo das estatísticas de execução mais importantes, sem incluir a cobertura média, usada para determinar se uma amostra de preparação de biblioteca passou QC.As visto aqui para o Caso Um, a Bioinformática detectou quatro mutações associadas à LMA relatáveis.

Uma mutação missense em FLT3, uma mutação missense em IDH2 e uma mutação frameshift em NPM1. Mutações no FLT3 são observadas em cerca de 25% dos pacientes adultos com LMA. O significado prognóstico das mutações pontuais do domínio FLT3 quinase, como visto neste paciente com LMA, tem um impacto incerto no prognóstico.

A isocitrato desidrogenase 2, ou IDH2, codifica um modificador epigenético que é comumente mutado na LMA. Mutações no gene da nucleofosmina, ou NPM1, são uma das mutações mais comumente adquiridas na LMA. Esta tabela lista todas as variantes exônicas para o Caso Dois.

Duas mutações associadas à doença foram detectadas. Uma inserção no quadro no Exon 20 de ERBB2 e uma mutação missense em TP53. HER2 / neu, ou ERBB2, codifica um receptor de tirosina quinase.

As inserções ativadoras do HER2/neu Exon 20 são observadas em dois a 4% dos adenocarcinomas de pulmão e são responsáveis pela maioria das mutações HER2/neu observadas no câncer de pulmão. As alterações do TP53 também são comuns no câncer. É necessário prestar muita atenção à qualidade e à quantidade de DNA extraído.

Isso é especialmente importante para amostras FFPE. Tentamos muitas vezes altamente degradado com uma variável o rendimento do DNA. Durante o processo de validação do ensaio clínico, métricas de qualidade e quantidade de DNA devem ser estabelecidas para cada amostra antes de avançar o DNA para a preparação da biblioteca.

Além da preparação da biblioteca, é fundamental validar um Plano de Espionagem Bioinfomática, determinando valores de corte para a execução do sequenciamento, estatísticas de controle de qualidade, estatísticas de preparação da biblioteca, profundidade de coragem de um Amplicon e a frequência mínima de alelos relatáveis. Uma vez dominada, a preparação da biblioteca pode ser realizada em um dia útil. Mas, o fluxo de trabalho geral do ensaio requer mais tempo para extração de DNA, sequenciamento, processamento de dados e revisão de variantes.

Este procedimento é projetado para examinar apenas as mutações do DNA genômico em determinados pontos quentes importantes. Outras massas que usam RNA podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como uma expressão diferencial de genes, associar os tumores de risco e os rearranjos estruturais. Grandes avanços estão no horizonte.

A adoção da automação e a incorporação de um código de barras molecular exclusivo permitirão que os laboratórios diminuam o tempo de resposta, usem menos entrada de amostra e detectem variantes em uma frequência de alelos muito baixa. A detecção de mutações associadas a doenças em amostras de câncer tem sido o padrão de tratamento há décadas. O NGS é uma abordagem menos tendenciosa para sequenciar vários genes associados a muitos cânceres em paralelo, levando à identificação de múltiplas mutações e melhores tratamentos para os pacientes.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.