Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Focamos no desenvolvimento de métodos de isolamento e análise de CTC de alto desempenho para avançar a oncologia de precisão por meio de biópsias líquidas. As plataformas comerciais atuais de isolamento de CTC têm baixo débito e eficiência. Eles também são incompatíveis com plataformas de análise a jusante, o que limita a recuperação de informações biológicas.

Este estudo utiliza uma plataforma de isolamento microfluídico de CTC para melhorar significativamente as taxas de detecção. Também aplicamos um chip de sequenciamento de célula única de célula rara para análise mais profunda de biópsias líquidas. Para começar, uma pipete de 25 microlitros de estreptavidina lavada e ressuspensa modificou as esferas magnéticas em um tubo contendo um micrograma de anticorpo EpCAM biotinilado.

Incube a mistura em temperatura ambiente enquanto gira a 20 rotações por minuto por 40 minutos para preparar as esferas imunomagnéticas. Usando um suporte magnético, separe as contas do sobrenadante. Após remover o sobrenadante, ressuspenda as esferas em 25 microlitros de buffer de isolamento.

Pipete 20 microlitros da suspensão com esferas magnéticas em um a dois segundos, garantindo que não haja bolhas de ar. Imediatamente coloque o chip verticalmente sobre um ímã e deixe as esferas se depositarem por cinco minutos sem ser perturbadas. Reúna quatro mililitros da amostra de sangue em uma seringa, garantindo que as bolhas de ar sejam removidas.

Sele a entrada e saída do chip com líquido para eliminar bolhas de ar, depois insira os tubos de entrada e saída da amostra no chip. Usando uma bomba de seringa, injete a amostra a uma vazão de 1,5 mililitros por hora. Após carregar a amostra, injete 60 microlitros de DPBS no chip HB a uma vazão de 0,2 mililitros por hora para lavar as células não ligadas.

Remova o ímã e injete manualmente 1,5 mililitro de 5%BSA para lavar o chip e liberar as células tumorais capturadas. Prepare uma solução de 10% de MPTS em etanol. Introduza imediatamente 20 microlitros da solução no chip HB e incube em temperatura ambiente por uma hora.

Enxágue o chip de HB uma vez com etanol anidro, depois seque a 100 graus Celsius por uma hora. Em seguida, prepare a solução GMBS em etanol a uma concentração de 0,5 miligrama por mililitro. Após resfriar o chip a 37 graus Celsius, introduza a solução GMBS e incube.

Enxágue o chips de HB duas vezes com água destilada em dobro, seguido de dois enxágues com DPBS. Adicione imediatamente 15 microgramas por mililitro de estreptavidina no chip de HB e incube em temperatura ambiente por uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, enxágue o chip de HB duas vezes com soro de DPBS.

Agora prepare o tampão de anticorpos CD45 adicionando 0,2% de BSA e 20 microgramas por mililitro de anticorpo biotinilado CD45 ao DPBS e ajuste para o volume final. Injete 20 microlitros do tampão de anticorpos CD45 no chip HB para seleção negativa dos glóbulos brancos. Após uma incubação de uma hora em temperatura ambiente, enxágue o chips com DPBS.

Adicione uma solução bloqueante contendo 3% BSA e 0,05% Tween 20 no chip HB. Aspire a amostra preparada em uma seringa, garantindo que não haja bolhas de ar. Depois, vede a entrada e saída do chip com líquido e conecte os tubos de entrada e saída ao chip.

Usando uma bomba de seringa, injete a amostra a uma vazão de 0,6 mililitros por hora. Colete células tumorais purificadas na tomada do chip para contagem e sequenciamento de células individuais. Pipete 200 microlitros de solução 0,5% F-68 preparados em DPBS na entrada do chip.

Realize a sonicação em banho-maria enquanto segura o chip. Quando as bolhas estiverem visíveis na região microporosa, continue a sonicação por 30 segundos para remover bolhas dos poços duplos. Em seguida, injete 200 microlitros de suspensão de células tumorais no chip contendo 60.000 poços duplos.

Pipete suavemente a suspensão da célula no chip para cima e para baixo duas vezes. Depois, coloque novamente em um shaker descolorizante por cinco minutos para resuspender as células não capturadas e permitir que se depositem novamente. Agora adicione 200 microlitros de DPBS e solução 0,5%F-68 pela entrada e aspire pela saída.

Após resuspender a suspensão com talão com código de barras, injete imediatamente 200 microlitros de suspensão na entrada do chip e agite a 10 rotações por minuto por 20 segundos. Pipete suavemente a suspensão com esferas duas vezes antes de colocá-la de volta no shaker. Agora retire a suspensão de esferas com código de barras da saída, depois pipete 200 microlitros de 20X Tris-EDTA e solução de ditiotreitol 50 milimolares.

Retire líquido da saída. Para lise celular e captura de MRNA, adicione lentamente 200 microlitros de buffer de lise celular na entrada do chip. Adicione imediatamente 200 microlitros de óleo mineral para vedar os poços duplos.

Remova a solução que flui da saída do chip para o reservatório de resíduos. Depois, coloque o chipo na horizontal e deixe descansar em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione lentamente 200 microlitros de solução 6X de citrato de sódio com solução fisiológica na entrada.

Remova o líquido residual e aspire a solução restante da saída do chip. Adicione lentamente 200 microlitros de citrato de sódio 6X salino para encher o chip. Segure um ímã perto da superfície do chip e mova-o lentamente da entrada até a tomada para coletar as esferas com código de barras.

Aspire rapidamente a solução e faça esferas em um tubo centrífuga contendo 6X citrato de sódio de soro fisiológico. Lave as esferas codificadas três vezes com 200 microlitros de citrato de sódio 6X de soro salino, seguido de uma vez com buffer de transcrição reversa. Foi observada uma distribuição uniforme de esferas imunomagnéticas sob um campo magnético, enquanto contas residuais mínimas após remoção magnética confirmaram liberação bem-sucedida.

O chip de isolamento CTC capturou eficientemente células tumorais tanto de amostras de 1 mililitro quanto de 10 mililitros. A adição do chip de purificação aumentou ainda mais a pureza das células tumorais. Em amostras de sangue periféricas com células LNCaP mínimas, o sistema de classificação CTC manteve alta eficiência e pureza de captura.

O chip de código de barras de célula única alcançou uma taxa de ocupação de 85,6% de células e 95,7% de bolas com código de barras, resultando em uma taxa de pareamento de 81,9%. Aumentar o número de células carregadas melhorou a taxa de ocupação de micropoços sem reduzir a eficiência da captura. O fluxo de trabalho integrado de isolamento CTC e sequenciamento de célula única produziu células tumorais altamente puras e manteve com precisão as proporções originais de células tumorais. A análise TSNE separou distintamente as células PC3, LNCaP e Jurkat em três clusters, cada um caracterizado por expressão única de marcadores.

O grupo de células de Jurkat foi identificado pela forte expressão de TRBC1, IGLL1, CD1E e CD3D, confirmada pelo enriquecimento de vias para ativação de células T. Os clusters PC3 e LNCaP foram distinguidos por genes expressos diferencialmente, com PC3 mostrando alta expressão de microsemiproteínas e LNCaP expressando NEDD4.