A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

O objetivo geral deste procedimento é examinar a influência dos nervos na pele normal e patológica. Este método pode ser usado para responder a questões-chave na biologia normal da pele, como se os nervos cutâneos afetam a homeostase e a doença. A principal vantagem dessa técnica é que você pode comparar amostras de pele intacta e desnervada, do mesmo animal.

A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois os nervos podem ser difíceis de reconhecer e remover com danos mínimos aos tecidos circundantes. Primeiro, anestesie o mouse e verifique se ele atingiu o plano adequado de sedação com uma pitada no dedo do pé. Além disso, confirme se o mouse exibe respiração e batimentos cardíacos normais.

Agora coloque o animal em uma almofada de aquecimento em uma área cirúrgica asséptica. Usando um aparador elétrico, remova cuidadosamente o cabelo do lado dorsal onde a biópsia será feita. Em seguida, limpe a área depilada com Betadyne e lenços umedecidos com álcool.

Certifique-se de que todas as aparas de cabelo sejam removidas do local. Agora delineie o local da biópsia usando um marcador preto. Para obter cortes longitudinais dos folículos pilosos, a borda mais longa da biópsia deve ocorrer na direção anterior para posterior, parasetidal à linha média dorsal.

Usando um bisturi, faça uma excisão de espessura total sem danificar a fáscia muscular subjacente. O sangramento geralmente é mínimo. A amostra de biópsia deve incluir a epiderme, derme, gordura subcutânea e panículo carnoso.

Alise a amostra de pele excisada em uma toalha de papel seca, com a derme voltada para baixo. Corte o excesso de papel toalha e guarde a amostra em TBS fria por até uma hora se outras amostras precisarem ser coletadas. Voltando ao camundongo, suture o local da biópsia usando 60 suturas de náilon com cerca de três milímetros de distância.

Em seguida, monitore o mouse em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência. Use analgésicos de acordo com os cuidados institucionais designados para animais e siga suas orientações se o camundongo parecer angustiado. Dentro de sete a 10 dias após a cirurgia, remova as suturas.

Prossiga com o processamento das biópsias para histologia ou coloração de montagem total. Anestesie o animal, raspe toda a pele dorsal e limpe a área semelhante ao procedimento de biópsia. Agora faça uma incisão usando um bisturi estéril ao longo da linha média dorsal da base do pescoço até cerca de meio centímetro acima da cauda.

Usando uma pinça romba estéril, retraia suavemente a pele do lado esquerdo para longe do flanco para visualizar o tecido subjacente das almofadas de gordura escapular perto do pescoço até logo acima do membro posterior. Agora identifique o nervo cutâneo dorsal sob um microscópio óptico de dissecação. Estes aparecem como fios brancos que viajam caudalmente através da fáscia translúcida da parede do tronco antes de fazer curvas acentuadas e entrar no tecido conjuntivo solto sob a pele.

Em seguida, usando uma pinça ultrafina, remova o nervo exclusivamente do lado esquerdo do animal localizado nos sítios anatômicos T3 a T12, arrancando-os de onde seus segmentos se dobram na parede do tronco até seus locais de entrada na pele. Oriente a pinça verticalmente e segure os nervos cerca de meio centímetro abaixo de seus locais de curvatura. Uma vez agarrado, puxe para cima para fazer com que os nervos se estiquem e se separem do tecido circundante para removê-los.

Evite danificar os vasos sanguíneos adjacentes. Certifique-se de manter o tecido úmido durante todo o procedimento, aplicando periodicamente gotas de solução salina a 0,9%. Continue removendo todos os nervos que se estendem da parede do tronco até a pele, mas não interrompa os nervos dentro da fáscia densa da parede do tronco.

Em seguida, remova todos os nervos do retalho de pele exposto. Essas fibras compreendem os ramos distais do nervo cutâneo dorsal e aparecem como fios brancos ramificados localizados esporadicamente dentro do tecido conjuntivo no lado dérmico do retalho cutâneo. Para remover esses ramos finos, posicione a pinça aproximadamente paralela à superfície dérmica, segure o nervo e puxe para cima.

Remova todos os nervos visíveis dessa maneira. Não perfure os vasos sanguíneos e a pele. Durante esta etapa, é importante evitar a ruptura dos vasos sanguíneos vizinhos.

Se você encontrar um nervo com um vaso sanguíneo adjacente, siga-o eventualmente até uma área onde não haja vaso adjacente e remova-o arrancando. Agora, afrouxe a pele do lado direito da incisão da linha média dorsal, mas não remova nenhum nervo. Isso servirá como controle operatório simulado contralateral.

Por fim, suture o animal e monitore no pós-operatório como antes. Mais tarde, para confirmar a perda estável de nervos, semanas após a cirurgia, pique suavemente a área desnervada, usando uma agulha hipodérmica estéril. Observe se o animal responde, normalmente estremecendo ou virando a cabeça.

Se a área da pele tiver sido desnervada de forma estável, o animal exibirá pouca ou nenhuma resposta. Colete biópsias de pele da área sem resposta e do lado simulado contralateral para amostras experimentais e de controle correspondentes. A partir das biópsias, é importante amostrar várias seções histológicas para identificar possíveis diferenças na abundância ou morfologia da cúpula de toque entre os espécimes simulados e desnervados.

A cepa de camundongo glebe one cree ERT2 permite o direcionamento da recombinação genética induzida por tamoxifeno para áreas da pele que exibem alta atividade da via hedgehog, como o epitélio da cúpula de toque. Esses camundongos foram cruzados para induzir camundongos repórteres abolaxi a visualizar o epitélio da cúpula de toque. Os nós são cruciais para manter as cúpulas de toque normais, bem como suas células de Merkel associadas.

Isso é demonstrado experimentalmente pela perda gradual da morfologia normal da cúpula de toque, bem como pela perda de oito células depositadas de queratina após a desnervação. Os nervos também são cruciais para promover a sinalização de ouriço na cúpula de toque, conforme monitorado pelas expressões Glebe one cree ERE2 e coloração coletiva beta de montagem doméstica de pele simulada e desnervada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ablação cirúrgica dos nervos cutâneos dorsais para testar se esses nervos estão envolvidos na função normal da pele ou se modulam a doença.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada de forma rotineira e confiável, com o mínimo de estresse para o animal. Após este procedimento, métodos como a coloração aminofluorescente podem ser usados para confirmar se os nervos estão totalmente ablacionados da pele e se a expressão gênica está sendo afetada.