Name: Protocolo experimental para Produção de Biodiesel com Isolamento de Alkenones como subprodutos da Commercial Isochrysis Algas Biomassa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a produzir biodiesel a partir de biomassa de Isochrysis com isolamento de alkenones como subproduto valioso. Este método utiliza extração Soxhlet e transesterificação para obter rendimentos superiores a 90%.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (CHE-1151492), o Noroeste Avançada Renewables Alliance (comunhão com J. Wilson-Peltier), e através de uma doação privada de amigos de WHOI. Agradecemos a Kevin R. Steidley e Kim ASCHERL (USDA / ARS / NCAUR) para excelente assistência técnica.

1. As microalgas e Biomassa Preparação Nota: O fuzileiro microalga Isochrysis sp. &quot;T-iso&quot; utilizado no presente estudo pode ser comprado (veja Lista de Materiais). Quantidades multi-quilograma de Isochrysis pode ser comprado como uma pasta molhada congelada (Iso -paste) contendo aproximadamente 80% de água e 20% de biomassa, e é verde escuro / perto de cor preta com um cheiro odor pungente do mar. Isochrysis também pode ser comprado como um seco (95% seco) de pó castanho-amarelado (Iso -Pó) com um odor semelhante. <ol><li> A fim de secar a pasta Isochrysis, abrir um pacote de 1 kg por corte de 1 - buraco de 2 polegadas no canto da embalagem de plástico com uma tesoura. </li><li> Espremer aproximadamente 300 g destes Isochrysis colar através do buraco em um 150 milímetros x 75 milímetros cristalização prato para criar uma camada fina (cerca de 20 mm). </li><li> Deixe a pasta secar ao ar à temperatura ambiente até que se torne seca e escamosa (tipicamente, 48 -96 h). Nota: Os tempos de secagem podem variar e dependem da temperatura. No entanto, nenhuma diferença foi observada nos rendimentos ou qualidade do produto com o tempo de secagem ainda mais longos (até duas semanas). O processo de secagem pode também ser feita mais uniforme e / ou acelerada colocando o prato de cristalização em uma placa quente (30 - 40 ° C). </li><li> Raspe a biomassa seca do prato cristalizando utilizando uma espátula e recolher em uma extração de celulose dedal (Comprimento: 123 mm, de 43 mm de diâmetro). Registar o peso da biomassa Isochrysis seco. </li></ol> 2. Extracção Soxhlet de biomassa seca Isochrysis <ol><li> Carregar um Isochrysis -Contendo cone de extracção de celulose (tipicamente 50 - 60 g de biomassa seca) em um aparelho de extracção Soxhlet. </li><li> Encher o balão de Soxhlet, com hexanos (400 mL), ligar a fonte de água do condensador e calor, e permitir que o Soxhlet com ciclo de 24 - 48 horas (até a cor do solvente passou de verde escuro para umadesmaio amarelo). </li><li> Desligue o fogo e deixe o aparelho arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida, retirar o balão do extractor Soxhlet. </li><li> Remover os hexanos utilizando um evaporador rotativo e registrar o peso do material de hexanos-extractáveis ​​( &quot;óleo de algas hexano&quot; (h-AO)). </li></ol> 3. A saponificação do óleo de algas e separação de ácidos graxos e lipídios neutros <ol><li> Redissolve-se o h-AO no mesmo balão de fundo redondo a partir do Passo 2.4 acima, com metanol: diclorometano (2: 1, volume = 10 x massa de óleo de algas). </li><li> Adicionar uma barra de agitação e anexar um condensador de refluxo (bobina: 500 mm de comprimento). </li><li> Adicionar H2O (volume = 2,67 x massa de óleo de algas) e KOH (50% w / w óleo de algas) e aquecer o conteúdo com agitação até 60 ° C durante 3 h. </li><li> Após arrefecimento até à temperatura ambiente, remover os solventes orgânicos (metanol e diclorometano) num evaporador rotativo. </li><li> Transferir a mistura aquosa restante vertendo-a em um 1-L funil de separação. Adicionar hexanos (equivalentes em volume à solução aquosa), agitar a ampola de decantação, e permitir que as camadas se separem. </li><li> Escorra a camada aquosa inferior é colocada num Erlenmeyer e deitar fora a fase orgânica superior em um Erlenmeyer separado. </li><li> Repita os passos 3.5 e 3.6 até que a camada orgânica é incolores (tipicamente 1-2 vezes mais). </li><li> Concentra-se os extractos orgânicos reunidos num evaporador rotativo para isolar os lípidos neutros como um sólido esverdeado (p.f. ≈ 60 -. 70 ° C). </li><li> Acidifica-se a fase aquosa com HCl (6 M, atpH ~ 2 tal como indicado por papel de pH). </li><li> Extrai-se a ácidos gordos livres (AGL) a partir da fase aquosa acidificou-se com hexanos (Equivolume para a fase aquosa), utilizando um funil de separação de 1 L como descrito nos passos 3.5 e 3.6. </li><li> Remover os hexanos num evaporador rotativo para se obter os FFAs como um resíduo verde escuro quase preto oleoso (líquido a temperaturas&gt; 30 ° C). </li></ol> 4.Catalisada por ácido de esterificação de ácidos graxos livres e Produção de Biodiesel Verde <ol><li> Transferir os FFAs utilizando metanol: clorofórmio (1: 1, 6 x o volume de óleo de algas) para dissolver primeiro os FFAs e, em seguida, vertendo-a em um balão de reacção de alta pressão de paredes grossas equipado com uma barra de agitação. </li><li> Adicionar H 2 SO 4 concentrado (20% w / w óleo de algas), selar o frasco, e aquecer a mistura a 90 ° C enquanto se agitava durante 1 hora. </li><li> Após arrefecimento até à temperatura ambiente, transferir a mistura vertendo-a em uma ampola de decantação. </li><li> Adicionar H2O (2 x volume de óleo de algas), agitar a ampola de decantação, e permitir que as fases se separem. </li><li> Drenar a camada de fundo para um balão de fundo redondo pré-pesaram-se e concentra-se num evaporador rotativo. Registar a massa do biodiesel resultante. </li><li> Analisar o perfil de ácidos graxos por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID) 28 (cromatógrafo a gás equipado com um DB-88 [(88% cyanopropyl) methylarylpolysiloxane] em coluna (30 mx 0,25 milímetros de espessura x 0,20 uM ID película). Nota: ésteres metílicos de ácidos gordos comuns são verificados por comparação do tempo de retenção com amostras autênticas obtidas comercialmente. Além disso, cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS; cromatógrafo de gás acoplado a um detector selectivo de massa) é realizada sob condições idênticas de programa de temperatura e coluna para analisar os componentes, tais como C18: 4 para os quais não há padrões autênticos estão disponíveis com os resultados aplicado para GC quantificação. </li></ol> 5. Biodiesel Descoloração <ol><li> Aqueça o biodiesel de cor verde-escuro a 60 ° C num balão de fundo redondo equipado com uma barra de agitação. </li><li> Adicionar montmorilonite K 10 (MK10) em pó (10-20% w / w do biodiesel) e agita-se durante 1 h. </li><li> Remover o fundo redondo a partir do calor e deixar a solução arrefecer até à temperatura ambiente. </li><li> Prepara-se uma aparelho de filtração constituído por um balão de fundo redondo e divertido filtroNel contendo um papel de filtro de celulose (Ash 0,007%). </li><li> Verter o biodiesel descorada arrefecida através do funil de filtro, utilizando uma quantidade mínima de hexanos para enxaguar o balão de fundo redondo. </li><li> Desligue o funil de filtração do balão de fundo redondo (este agora contém uma solução de hexano do biodiesel descorada) e remover os hexanos com um evaporador rotativo para se obter um / biodiesel laranja vermelha. </li><li> Armazenar as amostras a 4 ° C tempo durante o qual (~ 10% w / w) irá ocorrer alguma deposição de material insolúvel. </li><li> Remover o material insolúvel por decantação ou filtração, tal como descrito no passo 5.4 e 5.5 para produzir um biodiesel homogénea clara para análise. </li></ol> 6. Isolamento e purificação de Alkenones dos lípidos neutros <ol><li> Dissolve-se os lípidos neutros (do passo 3.8) em uma quantidade mínima de diclorometano (cerca de 50 ml para 10 gramas de lípidos neutros) e adicionar a solução com uma pipeta para o topo de uma coluna de cromatografia (O.D de 60 mm, ID de 55 mm, comprimento de 18 &quot;) contendo gel de sílica (230-400 mesh, 100 g). </li><li> Elui-se a solução através de sílica com pressão (~ 5 psi) utilizando diclorometano (aproximadamente 150 ml) como solvente e recolher o eluente no balão de 250 ml de fundo redondo. </li><li> Remover o diclorometano com um evaporador rotativo para dar um sólido cor de laranja. </li><li> Recristaliza-se o sólido utilizando hexanos, adicionando cerca de 100 ml de hexanos em ebulição, seguido por incrementais de quantidades adicionais de hexanos em ebulição, até a solução ficar homogénea (volume total de ~ 150 mL). Em seguida, arrefecer lentamente a solução até à temperatura ambiente para promover a cristalização. </li><li> Recolher os alkenones cristalizados usando um aparelho de filtração, tal como descrito no passo 5.4 utilizando uma pequena quantidade de (0 ° C) de hexanos frios para enxaguar o balão. </li></ol>

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<li>Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R., Protein Núñez-Cebrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein%2C+carbohydrate%2C+lipid+and+chlorophyll+a+content+in+Isochrysis+aff.+galbana+%28clone+T-Iso%29+cultured+with+a+low+cost+alternative+to+the+f%2F2+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Eng%22%5BJournal%5D)">Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana (clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium.</a> Aquacult. Eng. 25, 207-216 (2002).</li>
<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente para fins de fornecimento de informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.

Isochrysis é uma de apenas um número restrito de espécies de algas cultivadas industrialmente, colhidos como um componente principal de alimentação de marisco, e, portanto, representativas da escala necessária para a produção de biocombustíveis. A disponibilidade das algas utilizadas e métodos convencionais empregados neste estudo, fazer o protocolo apresentado amplamente acessível a outros grupos para novas investigações. As etapas críticas incluem-ar de secagem a algas (em oposição a liofilização 33), extracções de solvente, saponif icação, e esterificação. Através destas operações pode-se examinar os rendimentos de lipídios e outros co-produtos provenientes dos diversos Isochrysis disponíveis 30. Prevê-se que estes podem diferir como resultado de diferentes estirpes e métodos de cultura, 31 e pode também ser influenciado pela natureza do produto e qualquer processamento adicional (por exemplo, de secagem ou de congelação) utilizada pelo fornecedor. Como demonstramos aqui, o protocolo de desenvolverEd pode ser aplicado com sucesso para diferentes tipos de produtos Isochrysis, que varia a partir de uma pasta molhada com a forma de um pó moído seco. Os rendimentos foram de biodiesel no entanto inferior a partir da biomassa em pó (7% w / w vs biomassa seca de 12% w / w da pasta seca), o qual corresponde com menores quantidades de óleo de algas (H-AO) extraída. Isto pode sugerir que um protocolo de extracção alternativa 32 que não seja um aparelho de Soxhlet podem ser mais adequados para produtos em pó secos Isochrysis. O pó Isochrysis utilizado neste estudo é anunciado como contendo 23-25% de lipídios, que semelhante ao que temos experimentalmente obtidos a partir de pasta de Isochrysis seca 33,34,26. Apesar das diferentes cores da biomassa seca de partida, a Iso- paste-Hao e Iso -Pó-Hao eram essencialmente indistinguíveis, tanto verde escuro / near sólidos pretos com pontos de fusão de aproximadamente 50 ° C. Curiosamente, a proporção de FFAs ao lábio neutroids dentro dos dois extractos de hexano foi diferente. Após saponificação e separação dos lípidos neutros, obteve-se 60% ​​(w / w) FFAs e 40% (w / w) de lípidos neutros da Iso--paste HAO. O pó Iso--Hao produziu, em média, 46% (w / w) FFAs e 54% (w / w) lípidos neutros. Os resultados sugerem que tanto a biomassa em pó de partida podem conter quantidades mais elevadas de lípidos neutros em relação aos derivados de FA do que a pasta de Isochrysis, ou que de Soxhlet de extracção de Isochrysis em pó é mais selectiva para lípidos neutros. Não só os rendimentos dos produtos obtidos a partir dos dois Isochrysis comercial biomassas diferente, mas também os perfis de ácidos gordos do biodiesel resultante. Isso é importante, como as propriedades de combustível de um biodiesel são directamente dependentes da natureza e conteúdo do EMAGs individuais. 35 a ser comercializado, todo o biodiesel deve estar em conformidade com as normas descritas na ASTM documentosD6751 ou EN 14214 em os EUA ou na Europa, respectivamente. As especificações incluem intervalos para lubrificação e viscosidade cinemática, e valores mínimos para o índice de cetano e estabilidade oxidativa. Outras recomendações importantes estão relacionados com propriedades de fluxo a frio, sob a forma de um ponto de nuvem (CP) ou ponto de entupimento do filtro a frio (CFPP). Temos relatado anteriormente os resultados do teste de combustível abrangente de biodiesel preparado a partir de pasta de Iso-. 36 Uma vez que o perfil FAME de biodiesel produzido a partir da -Pó Iso neste estudo é similar aos previamente testado, podemos prever certas propriedades do combustível a ser semelhante para ambos os combustíveis de biodiesel. Por exemplo, os ácidos gordos poli-insaturados (PuFAMEs, mais do que duas ligações duplas) são responsáveis ​​por aproximadamente 40% de ambas as misturas de FAME (35,2% e 39,9%, Tabela 2). Isto irá resultar em estabilidade oxidativa fraca e do fluxo a frio favorável. 35 Há, no entanto, as ligeiras diferenças nos perfis fama dos dois biodiecombustíveis sel. O biodiesel produzido a partir do pó Isochrysis continham quantidades mais elevadas de 14: 0 (19,4 mg / g versus 16,4 mg / g), 18: 3 (13,5 mg / g versus 8,5 mg / g), e 22: 6 (11,0 mg / g vs 6,9 mg / g) FAMEs, ainda quantidades menores de 18: 4 (10,4 mg / g versus 19,8 mg / g). A extensão do impacto dessas diferenças sobre as várias propriedades do combustível contidas nas normas ASTM continua a ser investigado. O biodiesel inicial obtido a partir de ambos comercial Isochrysis algas foram igualmente de cor verde escuro que pode ser explicado pela presença de clorofilas. 36 clorofila e seus derivados têm sido referidos como tendo um efeito negativo sobre a estabilidade dos óleos vegetais e seus combustíveis de biodiesel correspondentes. 36,29 com base no método de Issariyakul e Dalai para descolorante óleo de canola greenseed em conexão com a produção de biodiesel, 29 de agitação a biodiesel verde mais de 10% (w / w) MK10 a 60 ° C durante 1 h resultou numa dramáticaredução em teor de pigmento por inspecção visual (ref. Figura 2). recuperações de massa do processo de descoloração foram em média 90%. Rendimentos de alkenones purificadas de Iso- paste-Hao e lipídios neutros pó-Hao iso eram comparáveis ​​a 40% e 46% w / w, respectivamente (Tabela 1). Desde lipídios neutros representam uma proporção maior de material contido no Iso- pó-Hao (54% w / w vs. 40% w / w), alkenone rendimento do Iso- pó-Hao excede o rendimento Iso- alkenone paste-Hao em cerca de 10% (25% w / w vs 16% w / w). No entanto, considerando que os rendimentos da própria Iso- pó-Hao foram inferiores Iso- colar-Hao (15% vs 20% w / w), os rendimentos globais de alkenones de ambas as biomassas Isochrysis secos são mais semelhantes (0,2 x 0,4 x 0,4 = 3,2% w / w de pasta seca Isochrysis e 0,15 x 0,54 x 0,46 = 3,7% de Isochrysis pó).

Recentemente, tem havido um grande ressurgimento do interesse em biocombustíveis a partir de algas, especialmente para a produção de combustíveis líquidos como o biodiesel 1 e outros óleos derivados da biomassa. 2 benefícios propostas incluem a prevenção de certos alimentos versus combustíveis controvérsias 3 e produtividades supostamente mais elevados e capacidades de CO 2 de mitigação do que as culturas agrícolas tradicionais. 4 Isto segue a quase 20 anos do Departamento de Espécies Programa Aquático de Energia (ASP) dos Estados Unidos começou em 1978 com a finalidade de investigar combustível de transporte a partir de algas. Conforme descrito no relatório do Sheehan, 5 o programa terminou em 1996, principalmente porque os custos projetados não eram competitivos com o petróleo bruto na época ($ 18,46 por barril (159 L)). Enquanto o custo do petróleo tem aumentado dramaticamente desde então ($ 87,39 por barril em 2014) 6, que está ligado ao renascimento na pesquisa em biocombustíveis de algas, alguns hav argumentou que, no entanto, os biocombustíveis de algas irá revelar-se demasiado dispendiosa. 7 Como uma estratégia para compensar os custos de produção de biocombustíveis, a noção de co-produtos de valor agregado surgiu entre ambos os críticos e defensores 7,8 9,10 e características como uma das principais razões para perseguir os biocombustíveis de algas no Departamento de Energia dos EUA (DOE) &quot;Technology Roadmap de algas biocombustíveis Nacional&quot;. 11 Descrevemos aqui um método para a co-produção de duas correntes separadas de combustível a partir de microalgas Isochrysis comercial. Temos nos concentrado em Isochrysis em parte porque ele já é produzido industrialmente, colhido para fins de maricultura, e também porque Isochrysis é um dos apenas algumas espécies de algas que, além de lipídios tradicionais (ou seja, ácidos graxos) biossintetizam uma única classe de compostos conhecidos como alkenones de cadeia longa poli-insaturados. 12 Alkenone estruturas são caracterizadas por muito L<html> cadeias de hidrocarbonetos ong (36-40 átomos de carbono), de duas a quatro não de metileno interrompidas ligações duplas trans, e uma cetona ou metil etil (Figura 1). Alkenone insaturação é sensível à temperatura de cultivo de algas, 13,14 de tal forma que a proporção do di-insaturado alkenone metil C37 (o chamado &quot;índice de insaturação&quot;) pode ser usado como um substituto para as temperaturas da superfície do mar no passado. 15 - 20 são Alkenones pensado para residir em corpos lipídicos citoplasmáticos e pode ser mais abundantes do que os triglicéridos (tags). 21,22 Sob azoto ou limitação de fósforo, de até 10-20% de carbono de células em fase estacionária é acumulada como alkenones 23,24. de uma ponto de vista evolutivo, alkenones pode ter sido favorecido em detrimento de TAGs porque a sua trans geometria vínculo -duplo fornece uma forma mais estável de armazenamento de energia. 21 189fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Estruturas de poli-insaturados de cadeia longa alkenones alkenone comum de metilo. 37: 3 isoladas a partir de Isochrysis exemplificando comprimentos de cadeia longa de hidrocarboneto (36 - 40 átomos de carbono), não de metileno interrompidas ligações duplas trans, e que termina num grupo metilo ou etil-cetona. Nomenclatura é similar aos ácidos graxos onde #: # se refere a número de carbonos:. Número de ligações duplas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Argumentamos que alkenones representam uma matéria-prima renovável de carbono promissor de uma alga comum com a história do cultivo industrial. 25 Biodiesel produzido directamente a partir do extrato de lipídeos totais de Isochrysis contém uma quantidade significativa (10-15% w / w) de alkenones e contaminação por estes compostos de alto ponto de fusão resulta em má propriedades do combustível de fluxo frio. No entanto, usando tele técnicas de saponificação / extracção descritos aqui, alkenones pode ser removido e recuperado melhorando assim a qualidade de biodiesel, produzindo uma corrente de produto secundário. Recentemente, demonstrou a conversão de alkenones para um combustível líquido por metátese cruzada com 2-buteno (butenolysis). 26 A reacção butenolysis emprega um ruténio comercial metátese-iniciador, ocorre rapidamente a baixa temperatura, e de forma limpa proporciona uma mistura previsível de combustível de jacto hidrocarbonetos alcance. Esta reacção é realizada em paralelo com a síntese de biodiesel a partir de ácidos gordos, que representa os primeiros passos para uma abordagem &quot;biorrefinaria&quot; 27 para a produção de biocombustíveis Isochrysis comercialmente viável.

<table><tbody><tr><td>Isochrysis</td><td>Reed Mariculture</td><td>Iso, cru, não processado, 20%dw</td><td>Pasta de cultura viva, 20% p/p de biomassa</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis (liofilizado)</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>ACS Certified</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Chemical</td><td>D37-4</td> Aparelho Soxhlet <td>Certificado/Estabilizado</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>Extração</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; Funil chner Chemglass</td><td></td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de Reação de Alta Pressão</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de Filtro Whatman</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>Grau 42, Cinzas 0,007%, círculo, 42,5 mm</td></tr><tr><td>Biodiesel (B100)</td><td>Bellingham Shell</td><td></td><td>O biodiesel (B100) em <forte>Figura 3</forte> foi comprado em um posto de gasolina local: Bellingham Shell, Bellingham, WA 98226</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Aquacave</td><td></td><td>Além de Reed e Necton, Isochrysis também pode ser adquirido na Aquacave (Gurnee, IL) em: www.aquacave.com (acessado em 30 de setembro de 2015).</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Isochrysis também pode ser comprado na Brine Shrimp Direct (Ogden, UT) em: www.brineshrimpdirect.com (acessado em 30 de setembro de 2015).</td></tr></tbody></table>

protocolo experimental para produção de biodiesel com isolamento de alkenones como subprodutos da commercial<em&gt; isochrysis</em&gt; algas biomassa

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

A necessidade de substituir combustíveis derivados do petróleo com alternativas de fontes ambientalmente sustentáveis ​​renováveis ​​e mais é de importância crescente. biocombustíveis derivados de biomassa ganharam uma atenção considerável a este respeito, no entanto primeira geração de biocombustíveis a partir de culturas alimentícias, como o etanol de milho ou biodiesel de soja, em geral, caído em desuso. Existe assim um grande interesse no desenvolvimento de métodos para a produção de combustíveis líquidos a partir de fontes não comestíveis domésticos e de qualidade superior. Aqui descrevemos um procedimento pormenorizado para a produção de um biodiesel purificado a partir do Isochrysis microalgas marinhas. Além disso, um conjunto único de lipídios conhecido como alkenones poliinsaturados de cadeia longa são isolados em paralelo como co-produtos potencialmente valiosos para compensar o custo de produção de biodiesel. Quantidades multi-quilograma de Isochrysis são comprados a partir de duas fontes comerciais, um como um colar húmida (80% de água) que é primeiro secas antes do processamento e do ot-lhe um pó moído seco (95% seco). Os lípidos são extraídos com hexano, num aparelho de Soxhlet para produzir um óleo de algas ( &quot;óleo hexano algas&quot;) contendo ambas as gorduras tradicionais (isto é, triglicéridos, 46-60% w / w) e alkenones (16-25% w / w). A saponif icação dos triglicéridos no óleo de algas permite a separação dos ácidos gordos livres resultantes (FFAs) de lípidos neutros contendo alkenone. FFAs são, em seguida, convertido em biodiesel (isto é, ésteres metílicos de ácidos gordos, FAMEs) por esterificação catalisada por ácido enquanto alkenones são isoladas e purificadas a partir dos lípidos neutros por cristalização. Nós demonstramos que o biodiesel a partir de ambas as biomassas Isochrysis comerciais têm perfis FAME semelhantes, mas não idênticas, caracterizado por o conteúdo de ácidos gordos poli-insaturados elevados (cerca de 40% w / w). Os rendimentos de biodiesel foram consistentemente mais elevados quando se inicia a partir da pasta molhada Isochrysis (12% w / w vs 7% w / w), que podem ser rastreados para reduzir quantidades de oi hexano algasl obtido a partir do produto Isochrysis em pó.

<html> Antes do processamento, a pasta Isochrysis (pasta Iso-) foi seco em primeiro lugar. Isto foi convenientemente realizado em maior escala por adição do -paste ISO para um grande prato de cristalização e permitindo que o material a secar ao ar à temperatura ambiente. Durante a secagem, algumas formas de água reunidas (geralmente de cor avermelhada) que pode ser removido por decantação ou pipetagem de acelerar o processo de secagem. Após cerca de 48-96 horas, a Isochrysis agora seca pode ser raspada para fora do prato de cristalização e obtido como um material floculento branco / verde com um cheiro algas semelhante (Figura 2). Os rendimentos de biomassa seca era geralmente de 20% w / w da pasta como anunciado. Em contraste, o produto em pó Isochrysis (pó Iso-) foi um amarelo-castanho, finamente moído, pó seco (95% seco) que foi utilizado directamente sem mais processamento (Figura 2). gura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54189 / 54189fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Comparação de pasta de Isochrysis. Isochrysis comercial (80% de humidade) é espalhado ao longo da parte inferior de um prato de cristalização e deixado a secar ao ar à temperatura ambiente durante 48-96 horas antes do processamento. O Isochrysis seca resultante é obtido como um material escamosa de cor escura (à direita), que é diferente na aparência do que o pó seco comercial Isochrysis (esquerda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Extracção, quer do Iso pó -paste ou Iso- seco por Soxhlet com hexano deu origem, após a remoção dos hexanos, óleos de algas (H-ao) que eram semelhantes na aparência como / quase preto sólidos (p.f. verde-escuro. ~ 50 -60 ° C). Rendimentos de h-AO quando se inicia a partir da pasta ( &quot;Iso- paste-Hao&quot;) Foram tipicamente de 20% w / w da biomassa seca Isochrysis, consistente com os nossos resultados anteriores, 26 ao passo que o rendimento de H-AO Soxhlet por extracção do Isochrysis em pó comercial (&quot; Iso- pó-Hao &quot;) foram de 15% w / W (Tabela 1). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Produto (g) </td><td> Iso -paste </td><td> Iso-1 -Pó </td><td> Iso-2 -Pó </td></tr><tr><td> biomassa seca </td><td> 30 </td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Hexano algas Oil </td><td> 5,86 </td><td> 2,87 </td><td> 3.11 </td></tr><tr><td> FFAs </td><td> 3,52 </td><td> 1,34 </td><td> 1,38 </td></tr><tr><td> lípidos neutros </td><td> 2,34 </td><td> 1,38 </td><td> 1,61 </td></tr><tr><td> Alkenones </td><td> 0,94 </td><td> 0,63 </td><td> 0,74 </td></tr><tr><td colspan="4"> Notas: Iso-pó-1 e Iso-pó-2 representam os resultados de duas amostras de Isochrysis em pó que foram processados ​​em paralelo. Para outros relatórios com os rendimentos destes produtos de Iso-paste ver referências 26, 32 e 33. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Rendimentos de produto a partir da biomassa Isochrysis comercial. Acilgliceróis do h-AO foram convertidos nos sais de carboxilato solúveis em água correspondentes (isto é, sabões) após a adição de KOH aquoso em metanol / CH 2 Cl 2. lípidos neutros incluindo alkenones foram, em seguida, extraiu-se a partir desta mistura aquosa por partição selectiva com hexanos. Após a remoção dos lípidos neutros, reacidification dos sabões em seguida produziu os ácidos gordos livres correspondentes (FFAs) que podem ser extraídos de modo semelhante a partir do aqfase ueous com hexanos. As recuperações de massa globais para FFAs combinados e lipídios neutros a partir de qualquer Iso- paste-Hao ou Iso -Pó-Hao foram consistentemente perto quantitativa. No entanto, a proporção de produtos (isto é, lípidos neutros + FFAs) foi diferente. A partir da pasta Iso--Hao obteve-se 60% ​​(w / w) FFAs e 40% (w / w) lípidos neutros (Tabela 1). Por outro lado, iso- pó-Hao provou enriquecido em lipídios neutros (média = 54% de lipídios neutros + 46% FFAs), conforme descrito na Tabela 1. A esterificação dos FFAs com H 2 SO 4 e, em seguida, o metanol produzido ésteres de ácido gordo de metilo (FAMEs, ou seja, biodiesel) como um verde escuro perto líquido oleoso preto com um rendimento de 90% maior que (Figura 3). Descoloração por aquecimento ao longo Montmorillonita K10 29 (MK10) argila, em seguida, deu um produto amarelo / laranja, similar na aparência ao outro bi comercialcombustíveis odiesel (veja Lista de Materiais) (Figura 3). Os resultados da análise FAME de combustíveis de biodiesel Isochrysis descorada estão apresentados na Tabela 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" /> Figura 3. Comparação de Isochrysis e soja combustíveis biodiesel. Verde Isochrysis biodiesel (meio) é produzido por esterificação de ácidos gordos livres extraído e purificado. Descoloração produz um produto (à direita) com propriedades semelhantes ao biodiesel comercial (esquerda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> FAME A </td><td> Iso -paste </td><td> Iso -Pó </td></tr><tr><td> 14:00 </td><td> 16,4 </td&gt; <td> 19,4 </td></tr><tr><td> 14:01 </td><td> - </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 15:00 </td><td> vestígio </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 16:00 </td><td> 10.1 </td><td> 8,8 </td></tr><tr><td> 16: 1 Δ9 </td><td> 7.6 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> 16:02 </td><td> ND </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 16:03 </td><td> ND </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 18:00 </td><td> Vestígio </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> 18: 1 B </td><td> 12.1 </td><td> 14.3 </td></tr><tr><td> 18:02 </td><td> 8.1 </td><td> 7.1 </td></tr><tr><td> 18: 3 C </td><td> 8,5 </td><td> 13,5 </td></tr><tr><td> 18:04 </td><td> 19.8 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 18:05 </td><td> ND </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 20:05 </td><td> ND </td><td> - </td></tr><tr><td> 22:05 </td><td> ND </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 22:06 </td><td> 6.9 </td&gt; <td> 11 </td></tr><tr><td> Σ D </td><td> 89,8 </td><td> 96,2 </td></tr><tr><td colspan="3"> Notas: A nomenclatura ácido graxo é #carbons:. # Cis ligações duplas B Combinado 18: 1 Δ9 + 18:.. 1 Δ11 C Combinada Δ6,9,12 e Δ9,12,15 isômeros D O restante do material é cerca de 50 : 50 outros EMAGs e componentes não-fama (total ~ 95% FAME). ND = Não detectado. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Composição FAME de biodiesel produzido a partir de -past Iso comercial e Iso -Pó biomassa Isochrysis. Lípidos neutros foram obtidos como uma mistura sólida esverdeada a 40% w / w da Iso--paste Hao e 54% (AVG.) A partir do pó-Hao Iso- (Tabela 1). Filtrar os lipídios neutros dissolvidos através de sílica, utilizandoDCM deu após a remoção do solvente, um avermelhado / sólido cor de laranja que pode ser recristalizado com hexano para se obter alkenones analiticamente puro como um sólido branco. Este procedimento resultou em 16% (w / w) rendimento isolado da alkenones de Iso- paste-Hao e rendimento de 25% a partir de Iso -Pó-Hao (Tabela 1).

Métodos pormenorizados são apresentados para a produção de biodiesel, juntamente com o co-isolamento de alkenones como co-produtos valiosos a partir de microalgas Isochrysis comercial.

Protocolo experimental para Produção de Biodiesel com Isolamento de Alkenones como subprodutos da Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algas Biomassa

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir biodiesel a partir de Isochyrsis Algal comercialmente disponível, ao mesmo tempo em que permite o co-isolamento de alquenonas de cadeia longa como subproduto valioso. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de energia renovável, como, por exemplo, se nossos biocombustíveis derivados de algas são alternativas viáveis aos combustíveis derivados de petróleo.A principal vantagem desta técnica é que a alga que utilizamos já é cultivada industrialmente e pode ser adquirida em quantidades de vários quilogramas junto a diversos fornecedores comerciais. Além disso, essas algas específicas biossintetizam um tipo exclusivo de lipídios conhecido como alquenonas de cadeia longa, que podem ser isoladas como um subproduto. O procedimento será demonstrado por John Williams, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para preparar a pasta comercialmente disponível de isocrysis úmida, corte um pequeno orifício em uma embalagem de um quilograma e esprema aproximadamente 300 gramas sobre um recipiente de cristalização de 150 por 75 milímetros. A pasta possui cerca de 80% de água, é verde-escura, quase preta, e tem um odor forte. Seque a pasta ao ar para criar uma camada com cerca de 20 milímetros de espessura.Retire a biomassa seca para o cartucho de extração de celulose de massa conhecida. Em seguida, registre o peso da biomassa de isocrixis. Transfira cerca de 50 a 60 gramas de isocrixis seca para um aparelho de extração Soxhlet.Em seguida, encha o frasco de soxhlet com 400 mililitros de hexanos. Ligue a água do condensador e a fonte de aquecimento e deixe o soxhlet cíclico por um a dois dias. Quando a cor do solvente passar de verde escuro a um amarelo pálido, a extração estará concluída.Resfrie até a temperatura ambiente e use um evaporador rotativo para remover os hexanos. Por fim, pese o óleo algal de hexano. Comece dissolvendo o óleo algal de hexano no seu frasco com 10 volumes de metanol-diclorometano na proporção dois para um.A seguir, adicione uma barra de agitação e duas partes e dois terços de água em comparação ao volume do óleo, e adicione uma massa de hidróxido de potássio equivalente à metade do peso do óleo. Agora, acople o frasco a um condensador de refluxo com 500 milímetros de comprimento. Aqueça a mistura sob agitação a 60 graus Celsius por três horas em uma capela de exaustão.Após resfriar a reação, remova os solventes orgânicos em um evaporador rotativo. Em seguida, despeje a mistura aquosa remanescente em um funil de separação de um litro e adicione um volume igual de hexanos. Enxágue o frasco com os hexanos para garantir que todo o material seja transferido para o funil.Agite o funil e deixe as camadas separarem. Em seguida, transfira a camada aquosa inferior para um frasco e despeje a camada orgânica superior em um segundo frasco. Mantenha ambas as camadas.Repita a extração com hexano até que a camada orgânica fique levemente amarelo-esverdeada. Em seguida, combine os extratos orgânicos coletados e concentre-os em um evaporador rotativo para isolar os lipídios neutros. Esses lipídios aparecem como um sólido esverdeado e têm um ponto de fusão entre 60 e 70 graus Celsius.Em seguida, acidifique a fase aquosa até um pH de dois usando ácido clorídrico seis molar. Depois, extraia os ácidos graxos livres da fase aquosa acidificada utilizando hexanos e um funil de separação, como anteriormente. Por fim, remova os hexanos dos extratos orgânicos combinados em um evaporador rotativo para obter ácidos graxos livres purificados.Um resíduo oleoso verde escuro, próximo ao preto, que derrete logo acima de 30 graus Celsius. Dissolva os ácidos graxos utilizando seis volumes de clorofórmio metanólico e, em seguida, despeje a solução em um frasco de reação de alta pressão com fundo espesso e um bastão de agitação, fazendo uma lavagem para garantir a transferência completa dos ácidos graxos para o frasco de reação. Em seguida, sob capela, adicione ácido sulfúrico concentrado.Feche o frasco hermeticamente e aqueça a mistura a 90 graus Celsius sob agitação por uma hora. Após resfriar a reação até a temperatura ambiente, despeje-a em um funil de separação e adicione dois volumes de água. Agite então o funil de separação, deixe as fases se separarem e drene a camada inferior para um frasco de fundo redondo previamente pesado.Em seguida, concentre a solução em um evaporador rotativo e registre a massa do biodiesel resultante; a substância pode agora ser analisada por meio de cromatografia gasosa. Os lipídios neutros podem ser raspados do fundo redondo, pesados e transferidos para um frasco para purificação. Inicie dissolvendo os lipídios neutros em uma quantidade mínima de diclorometano.Em seguida, aplique cuidadosamente a solução em uma coluna de cromatografia contendo 100 gramas de gel de sílica. Depois, utilize pressão leve para eluir a solução através da sílica com cerca de 150 mililitros de diclorometano. Uma fina camada de areia é adicionada ao topo da coluna para evitar que a sílica seja perturbada ao encher com o solvente.Colete o extrato bruto em um balão de fundo redondo de 250 mililitros. Em seguida, remova o diclorometano com um evaporador rotativo. O resultado deve ser um sólido de cor laranja.Recristalize os sólidos em hexanos ferventes. Primeiro, adicione inicialmente 100 mililitros e, em seguida, continue adicionando hexanos ferventes até que a solução fique homogênea. Agora, resfrie lentamente a solução até a temperatura ambiente para promover a cristalização e colete as alcenonas cristalizadas utilizando um aparato de filtração.Utilize um pequeno volume de hexanos gelados para enxaguar o frasco. Antes do processamento, a pasta de isocrisis foi primeiramente seca para obter um material preto-esverdeado e escamoso, com cheiro semelhante ao de algas marinhas. Em contraste, a isocrisis em pó era um pó seco, marrom-amarelado e finamente moído, utilizado sem processamento adicional.A extração de qualquer material por soxhlet com hexanos forneceu óleos algais com rendimentos substancialmente mais altos a partir da pasta do que do pó. Os acilgliceróis no óleo algal foram convertidos em carboxilato solúvel em água, do qual lipídios neutros e ácidos graxos livres foram extraídos em volume quase quantitativo a partir de qualquer material de partida. No entanto, a proporção dos produtos foi diferente.A esterificação produziu ésteres metílicos de ácidos graxos. Também conhecido como biodiesel, um líquido oleoso verde escuro, quase preto. O rendimento excedeu 90%. O produto foi descolorido conforme descrito no protocolo do texto.A análise de MEAG dos combustíveis biodiesel purificados mostrou perfis semelhantes, mas não idênticos, a partir dos dois materiais iniciais. A filtração dos lipídios neutros dissolvidos por meio de sílica utilizando DCM fornece um sólido alaranjado avermelhado que foi recristalizado com hexanos para obter alquenonas puras para análise. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como processar a Isochrysis disponível comercialmente em biodiesel, com o isolamento de alquenonas puras como coproduto.Uma vez dominada, esta técnica pode gerar consistentemente quantidades significativas de biodiesel de algas e alquenonas para estudos posteriores. Com seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que possamos examinar criticamente as propriedades do combustível do biodiesel de algas, fornecendo quantidades suficientes para realizar os diversos testes de combustível, em vez de depender de previsões ou simulações. Não se esqueça de que trabalhar com ácidos ou bases fortes e aquecer o conteúdo dentro de um recipiente fechado pode ser extremamente perigoso.Certifique-se de usar equipamento de proteção individual adequado e trabalhe em uma capela de exaustão ao realizar esses passos.

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Fonte: Ginies, C., et al. Identificação de ácidos graxos em Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o processo de preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) a partir de amostras bacterianas, tratando a biomassa com uma solução alcalina, seguida de separação de fases e evaporação do solvente para análise a jusante.

Preparação de Ésteres Metílicos de Ácidos Graxos (FAMEs) a partir de Biomassa Bacteriana

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Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

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Protocolo experimental para Produção de Biodiesel com Isolamento de Alkenones como subprodutos da Commercial Isochrysis Algas Biomassa (Vídeo) | JoVE Journal

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