Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

O objetivo geral dessas técnicas de caracterização mecânica é medir as propriedades viscoelásticas de tecidos biológicos em diferentes escalas de comprimento e taxas de carregamento. Esses métodos podem ser usados para responder perguntas fundamentais na engenharia biológica. Por exemplo, como o cérebro se deforma sob taxas muito altas de carregamento, ou como doenças como esclerose múltipla ou autismo afetam as propriedades mecânicas do tecido cerebral.

A principal vantagem dessas técnicas reside no fato de que, para materiais com rigidez muito baixa e alta hidratação, como um tecido biológico, é possível realizar testes sob uma ampla gama de condições de carregamento, bem como em uma ampla faixa de volumes de material, desde o nível de uma única célula até o de um cérebro inteiro. As implicações dessas técnicas estendem-se à modelagem da resposta do cérebro durante lesões, o que é importante para o desenvolvimento de estratégias protetivas. Embora este método possa fornecer informações sobre as propriedades mecânicas do cérebro, ele também pode ser aplicado a outros tecidos biológicos compliantes, como o coração e o fígado.

Durante a caracterização mecânica de tecidos compliantes, estabelecer um contato apropriado entre a sonda de medição e o tecido é crucial. Carregue cuidadosamente uma sonda de AFM com uma constante elástica nominal de 0,03 newtons por metro e uma esfera de borossilicato de 20 micrômetros de diâmetro no suporte da sonda. Coloque uma fatia de cérebro montada em uma placa de Petri sobre um aquecedor acoplado à platina de AFM que tenha sido pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione cerca de dois mililitros de meio pré-aquecido. Depois, adicione cuidadosamente uma gota de meio sobre a ponta do AFM para protegê-la de quebrar devido à tensão superficial quando for abaixada no meio que envolve a fatia cerebral. Então, reposicione a cabeça do AFM sobre a platina e comece a abaixar a cabeça até que ela esteja submersa no meio.

Usando o microscópio óptico, mova a platina para que a região de interesse fique abaixo da ponta AFM calibrada e, em seguida, abaixe a ponta AFM para estabelecer contato com a superfície do tecido. Para realizar os experimentos de fluência, construa uma função de força aplicada no editor de funções do software. A função consiste em uma rampa de 0,1 segundo até um ponto definido de 5 nanonewton, mantido por 20 segundos, seguido por uma rampa de um segundo até zero nanonewton.

O software registrará dados sobre a penetração da sonda de AFM no tecido durante a função de força aplicada. Após realizar o experimento de fluência, conduza experimentos de relaxação de força criando uma função de penetração aplicada no software. Execute esta função enquanto o software coleta dados sobre a força sofrida pela sonda de AFM à medida que ela penetra no tecido.

Para iniciar os testes de indentação por impacto, acople uma ponta esférica deslizando-a sobre o pêndulo utilizando pinças. Em seguida, fixe o suporte da amostra de quartzo fundido na placa e parafuse a placa no estágio translacional. Para permitir experimentos dinâmicos de impacto em tecidos cerebrais hidratados, realize primeiro a calibração da célula líquida.

Acesse o menu Calibração no software, selecione Célula Líquida e siga as instruções do software para estabelecer contato com a amostra de quartzo fundido. Em seguida, selecione Normal para o Tipo de Indentador e utilize o valor padrão de 0,05 milinewtons para a Carga do Indentador. Então, clique em continuar para realizar a calibração da configuração normal do indentador.

Agora, mova o estágio da amostra para trás em pelo menos cinco milímetros e monte o braço de alavanca. Repita a calibração da célula líquida na nova configuração selecionando Célula Líquida para o tipo de indentador. Clique em Continuar para obter o fator de calibração da célula líquida.

Em seguida, aumente o espaçamento entre as placas do capacitor. Aumentar o espaçamento entre as placas do capacitor elevará a profundidade máxima mensurável, o que é necessário ao testar materiais altamente complacentes. Com uma chave inglesa, gire os três porcas que controlam o espaçamento entre as placas do capacitor no sentido horário em pequenos incrementos.

Após cada volta completa no sentido horário, selecione Ajuste da Caixa da Ponte no menu Manutenção e realize um bom teste de pêndulo. Continue ajustando lentamente as porcas até que a Calibração Aproximada de Profundidade indique um valor de 70.000 nanômetros por volt ou superior.

Em seguida, posicione um novo limitador na parte inferior do pêndulo que possa ser ligado e desligado por meio de uma fonte de alimentação. Retraia o limitador original situado atrás do pêndulo para remover uma possível obstrução ao movimento do pêndulo e permitir maiores velocidades de impacto, bem como maiores profundidades de penetração em amostras conformáveis. Ligue a fonte de alimentação para o solenoide e ajuste-a para 10 volts.

Em seguida, vá ao menu Experimento e selecione Impacto e Ajuste de Deslocamento de Impulso. Siga as instruções do software para calibrar a distância de balanço do pêndulo. Quando a configuração de indentação por impacto estiver completamente concluída, aspire o meio e seque o corte cerebral.

Em seguida, utilize uma fina camada de adesivo de cianoacrilato para fixar o cérebro seccionado ao pino de amostra de alumínio. Depois, deslize a célula líquida sobre a segunda junta O no pino de amostra e preencha a célula líquida com cinco mililitros de meio independente de dióxido de carbono para imergir completamente o tecido. Mova o banho na direção negativa do eixo X até que a ponta no braço da alavanca esteja adequadamente posicionada acima do banho.

Em seguida, mova-se na direção positiva de Z até que a ponta esteja totalmente submersa na solução e posicionada diante da amostra. Utilizando a janela de Controle do Estágio da Amostra, faça contato cuidadosamente e, em seguida, afaste o estágio da superfície da amostra em cerca de 30 micrômetros. No menu Experimento, clique em Impacto e configure um experimento de impacto.

Escolha uma carga de impulso específica que se relacione diretamente com a velocidade de impacto resultante com base na calibração da distância de oscilação. Em seguida, execute o experimento programado. Quando o pêndulo oscilar de volta e a superfície da amostra continuar se movendo em direção ao plano de medição, desligue o interruptor de limite inferior.

O deslocamento da sonda em função do tempo será registrado pelo software. Fixe uma folha de lixa ao sensor de medição com diâmetro de 25 milímetros. Em seguida, conecte o sistema térmico e instale a sonda.

Por fim, fixe outro pedaço de lixa na placa inferior, alinhado com a placa superior. Calibre o reômetro conforme as instruções do fabricante. Primeiro, zere a força no sensor.

Em segundo lugar, estabeleça o contato entre a sonda e a placa inferior. Em seguida, meça a inércia da sonda. Por fim, realize um ajuste do motor.

Em seguida, abaixe lentamente a placa de medição. Quando a placa estiver a menos de um milímetro do tecido, abaixe-a em incrementos de 0,1 milímetro até que a placa esteja totalmente em contato com a superfície superior do tecido e a força normal medida atinja o valor desejado. Adicione um pequeno volume de meio nas bordas da amostra para manter a hidratação durante o procedimento.

Abra a tampa térmica. Em seguida, clique em Arquivo, Novo e, na guia Gel, selecione Varredura de Frequência. Depois, clique na medição da janela uma varredura de frequência e dê um duplo clique na caixa de oscilação.

Insira a faixa de frequência, a deformação e o número de pontos. Por fim, selecione OK e clique em Iniciar para iniciar a varredura de frequência. Abaixo estão respostas representativas de indentação e força versus tempo para experimentos de fluência e relaxação de força.

Usando esses dados e a geometria do sistema, é possível calcular os módulos de fluência e de relaxação de força para diferentes regiões do cérebro. A indentação por impacto mede as propriedades mecânicas do tecido em altas taxas de carregamento espacial e temporalmente concentrado. Os parâmetros resultantes da resposta ao impacto podem ser quantificados em diferentes velocidades de impacto, o que fornece um meio para estudar as propriedades dependentes da taxa do tecido.

A reologia mede as propriedades viscoelásticas dependentes da frequência de tecidos em massa em termos dos módulos de armazenamento e de perda. O módulo de armazenamento é quase uma ordem de grandeza maior que o módulo de perda em baixas frequências, indicando que as propriedades elásticas dominam o comportamento do tecido cerebral. Ao realizar este procedimento, é importante manter o tecido adequadamente hidratado ou imerso em um fluido que ajude o tecido a manter sua estrutura adequada.

O desenvolvimento dessas técnicas demonstradas abriu caminho para que pesquisadores de materiais projetem e otimizem géis sintéticos capazes de imitar a resposta mecânica do cérebro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a microscopia de força atômica com indentação, indentação por impacto e reologia são utilizadas para caracterizar as propriedades mecânicas viscoelásticas de tecidos. Ao interpretar os dados coletados, lembre-se da suposição subjacente de que o volume deformado do tecido é estruturalmente homogêneo e elasticamente isotrópico.

Isso não é necessariamente verdadeiro para todos os tecidos biológicos. À medida que suas perguntas sobre a mecânica de tecidos biológicos forem ficando mais bem definidas, você poderá escolher um ou mais desses experimentos mecânicos para responder à pergunta na escala de comprimento ou na escala de tempo apropriada.