Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

O objetivo geral dessas técnicas de caracterização mecânica é medir as propriedades viscoelásticas do tecido biológico em diferentes escalas de comprimento e taxas de carga. Esses métodos podem ser usados para responder a questões-chave em engenharia biológica. Por exemplo, como o cérebro se deforma sob taxas muito altas de carga, ou como doenças como esclerose múltipla ou autismo afetam as propriedades mecânicas do tecido cerebral.

A principal vantagem dessas técnicas é que, para materiais de rigidez muito baixa e hidratação muito alta, como um tecido biológico, você pode testar em uma ampla gama de condições de carga e também pode testar em uma ampla gama de volumes de material, até o nível de uma única célula e até o nível de um cérebro inteiro. As implicações dessas técnicas se estendem à modelagem da resposta do cérebro durante a lesão, o que é importante para a engenharia de estratégias de proteção. Embora esse método possa fornecer informações sobre as propriedades mecânicas do cérebro, ele também pode ser aplicado a outros tecidos biológicos compatíveis, como coração e fígado.

Durante a caracterização mecânica de tecidos complacentes, é crucial estabelecer o contato apropriado entre a sonda de medição e o tecido. Carregue cuidadosamente uma sonda AFM com uma constante de mola nominal de 0,03 newtons por metro e um cordão de borosilicato de 20 micrômetros de diâmetro no suporte da sonda. Coloque uma fatia de cérebro montada em uma placa de Petri em um aquecedor montado em estágio AFM que tenha sido pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione cerca de dois mililitros de meio pré-aquecido. Em seguida, adicione cuidadosamente uma gota de meio na sonda AFM para protegê-la de quebrar devido à tensão superficial quando for abaixada no meio ao redor da fatia do cérebro. Em seguida, reposicione a cabeça do AFM no palco e comece a abaixar a cabeça até que esteja submersa no meio.

Usando o microscópio óptico, mova o estágio para que a região de interesse fique abaixo da sonda AFM calibrada e, em seguida, abaixe a sonda AFM para fazer contato com a superfície do tecido. Para conduzir os experimentos de conformidade de fluência, construa uma função de força aplicada no editor de funções do software. A função consiste em uma rampa de 0,1 segundo para um ponto de ajuste de 5 nanonewtons, que é mantida por 20 segundos, seguida por uma rampa de um segundo até zero nanonewton.

O software registrará dados sobre o recuo da ponta de prova do AFM no tecido durante a função aplicada da força. Depois de executar o experimento de conformidade de fluência, conduza experimentos de relaxamento de força criando uma função de recuo aplicada no software. Execute esta função enquanto o software coleta dados sobre a força experimentada pela sonda AFM à medida que ela se recorta no tecido.

Para iniciar os testes de indentação de impacto, combine uma sonda esférica deslizando-a sobre o pêndulo usando uma pinça. Em seguida, prenda o poste de amostra de quartzo fundido na placa e aparafuse a placa no estágio de translação. Para permitir experimentos de impacto dinâmico em tecidos cerebrais hidratados, primeiro execute a calibração da célula líquida.

Vá para o menu Calibração no software, selecione Célula Líquida e siga as instruções do software para fazer contato com a amostra de quartzo fundido. Em seguida, selecione Normal para o Tipo de penetrador e use o valor padrão de 0,05 milinewtons para a Carga de penetrador. Em seguida, clique em continuar para realizar a calibração para a configuração normal do penetrador.

Agora mova o sample stage para trás em pelo menos cinco milímetros e monte o braço de alavanca. Repita a calibração da célula líquida na nova configuração selecionando Célula líquida para o tipo de penetrador. Clique em Continuar para obter o fator de calibração da célula líquida.

Em seguida, aumente o espaçamento da placa do capacitor. Aumentar o espaçamento da placa do capacitor aumentará a profundidade máxima mensurável necessária ao testar materiais altamente compatíveis. Com uma chave inglesa, gire as três porcas que controlam o espaçamento da placa do capacitor no sentido horário em pequenos incrementos.

Após cada volta completa no sentido horário, selecione Ajuste da caixa da ponte no menu Manutenção e obtenha um bom teste de pêndulo. Continue a ajustar lentamente as porcas até que o Aprox. Calibração de profundidade lê um valor de 70.000 nanômetros por volt ou superior.

Em seguida, posicione um novo batente de limite na parte inferior do pêndulo que pode ser ligado e desligado por meio de uma fonte de alimentação. Retraia o batente de limite original atrás do pêndulo para remover uma obstrução potencial do movimento do pêndulo e permitir velocidades de impacto mais altas, bem como profundidades de penetração mais altas em amostras compatíveis. Ligue a fonte de alimentação do solenóide e defina-a para 10 volts.

Em seguida, vá para o menu Experimento e selecione Impacto e ajuste o deslocamento do impulso. Siga as instruções do software para calibrar a distância de oscilação do pêndulo. Quando a configuração de indentação de impacto estiver totalmente completa, aspire o meio e seque a fatia de cérebro.

Em seguida, use uma fina camada de adesivo de cianoacrilato para prender o cérebro fatiado ao poste de amostra de alumínio. Em seguida, deslize a célula líquida sobre o segundo O-ring no poste de amostra e encha a célula líquida com cinco mililitros de meio independente de dióxido de carbono para imergir totalmente o tecido. Mova o banho na direção X negativa até que a ponta do braço da alavanca esteja corretamente localizada acima do banho.

Em seguida, mova na direção Z positiva até que a ponta esteja totalmente submersa no banho e esteja na frente da amostra. Usando a janela Controle do estágio de amostra, faça contato com cuidado e, em seguida, afaste o estágio da superfície da amostra em cerca de 30 micrômetros. No menu Experimento, clique em Impacto e configure um experimento de impacto.

Escolha uma carga de impulso específica que se relacione diretamente com a velocidade de impacto resultante com base na calibração da distância de oscilação. Em seguida, execute o experimento agendado. Quando o pêndulo oscilar para trás e a superfície da amostra continuar a se mover para o plano de medição, desligue o interruptor de limite inferior.

O deslocamento da sonda em função do tempo será registrado pelo software. Anexe a lixa à sonda de medição de 25 milímetros de diâmetro. Em seguida, conecte o sistema térmico e monte a sonda.

Por fim, prenda outro pedaço de lixa na placa inferior alinhada com a placa superior. Calibre o reômetro de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, zere a força na sonda.

Em segundo lugar, estabeleça contato entre a sonda e a placa inferior. Em seguida, meça a inércia da sonda. Por fim, execute um ajuste motor.

Em seguida, abaixe lentamente a placa de medição. Quando a placa estiver a um milímetro do tecido, abaixe-a em incrementos de 0,1 milímetro até que a placa esteja totalmente em contato com a superfície superior do tecido e a força normal medida seja do valor desejado. Canalize um pequeno volume de meio nas bordas da amostra para manter a hidratação durante o procedimento.

Abaixe a coifa térmica. Em seguida, clique em Arquivo, Novo e, na guia Gel, selecione Varredura de frequência. Em seguida, clique na janela de medição de uma varredura de frequência e clique duas vezes na caixa de oscilação.

Insira a faixa de frequência, a deformação e o número de pontos. Por fim, selecione OK e clique em Iniciar para iniciar a varredura de frequência. Aqui estão as respostas representativas de recuo e força versus tempo para experimentos de conformidade de fluência e relaxamento de força.

Usando esses dados e a geometria do sistema, a conformidade de fluência e os módulos de relaxamento de força podem ser calculados para diferentes regiões do cérebro. A indentação de impacto mede as propriedades mecânicas do tecido em altas taxas de carga espacial e temporalmente concentrada. Os parâmetros de resposta ao impacto resultantes podem ser quantificados em diferentes velocidades de impacto, o que fornece um meio de estudar as propriedades dependentes da taxa do tecido.

A reologia mede as propriedades viscoelásticas dependentes da frequência do tecido a granel em termos de módulos de armazenamento e perda. O módulo de armazenamento é quase uma ordem de magnitude maior do que o módulo de perda em baixas frequências, indicando que as propriedades elásticas dominam o comportamento do tecido cerebral. Ao tentar este procedimento, é importante manter o tecido adequadamente hidratado ou imerso em um fluido que ajude o tecido a manter sua estrutura adequada.

O desenvolvimento dessas técnicas demonstradas abriu caminho para os pesquisadores de materiais projetarem e otimizarem géis sintéticos que possam imitar a resposta mecânica do cérebro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o microscópio de força atômica permitiu indentação, indentação de impacto e reologia são usados para caracterizar as propriedades mecânicas viscoelásticas do tecido. Ao interpretar os dados coletados, lembre-se da suposição subjacente de que o volume deformado do tecido é estruturalmente homogêneo e elasticamente isotrópico.

Isso não é necessariamente verdade para todos os tecidos biológicos. À medida que suas perguntas sobre a mecânica dos tecidos biológicos se tornam mais bem definidas, você pode escolher um ou mais desses experimentos mecânicos para responder à pergunta na escala de comprimento ou escala de tempo apropriada de interesse.