Name: Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a analisar a morfologia mitocondrial em tecido cerebral de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura por bloco serial. Esta técnica automatizada permite reconstrução 3D detalhada para estudos em neurobiologia.

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Agradecemos a Sidney Walker por fornecer ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado em parte por uma doação do Instituto Nacional de Saúde (1R01EY024712-01A1).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) na Virginia Tech. Cuidado: precauções extremas devem ser tomados no manuseio e descarte vários componentes utilizados neste protocolo. Antes do uso, o diretrizes institucionais e práticas de saúde e segurança local deve ser estabelecido e seguido, particularmente para tetróxido de ósmio, que é volátil e extremamente venenoso, acetato de uranilo, que é tanto um metal pesado e uma fonte de radioatividade, e nitrato de chumbo, que é um veneno heavy metal. Thiocarbohydrazide (TCH) pode decompor-se para produzir gases explosivos e tóxicos, se manuseados incorretamente. Muitas instituições irá ter uma opção de núcleo EM em que esses reagentes são rotineiramente utilizados e podem fornecer assistência. 1. Preparação do Tecido Cerebral e SBFSEM Imagiologia <ol><li> Anestesiar um jovem (~ 2 - 4 meses de idade) C57 rato preto (C57BL / estirpe 6J) usando 4-5% isoflurane seguindo as diretrizes institucionais. Confirmar anesthetization monitorando a perda do tônus ​​muscular, falta de movimentos voluntários e respostas a estímulos aversivos, como uma pitada cauda. </li><li> Pin o mouse sobre uma bandeja de dissecação e fazer uma incisão na pele ao longo da linha média ventral. Adicione mais incisões na pele para expor a caixa torácica do rato. Inciso o diafragma, e cuidadosamente dissecar a cavidade torácica longo da periferia para expor o coração batendo, em seguida, fazer uma incisão no átrio direito. </li><li> Utilizando uma cânula borboleta, canular o ventrículo esquerdo. Perfundir o rato transcardialmente usando 10 - 20 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS) pH 7,2, até exsanguinação é confirmada por uma alteração na cor do fígado. Nota: Uma mudança na cor do fígado é utilizado como um guia para determinar a extensão da exsanguinação. Confirmar que a cor fígado muda de marrom avermelhado a rosa pálido. </li><li> Perfundir o rato transcardialmente usando 10 - 20 ml de 2% de glutaraldeído e paraformaldeído a 4% feita em tampão de cacodilato 0,10 M (pH 7,2), para fixar o tecido do cérebro rapidamente a partir de dentro. A fixação é monitorizado através da observação da rigidez da cauda. Nota: Preparar tampão de cacodilato 0,10 M (pH 7,2) por dissolução de 2,14 g de cacodilato de sódio em 80 ml de água, adiciona-se ácido clorídrico para ajustar o pH, e perfazer o volume a 100 ml com água. </li><li> Após perfusão, decapitar o rato, dissecar o cérebro, seguido por fixação em tampão de cacodilato de sódio 0,10 M (pH 7,2) contendo 2% de glutaraldeído e paraformaldeído a 4% durante 48 horas a 4 o C. </li><li> Após 48 h a 400 uM fazer cortes coronais utilizando um vibratomo e, em seguida, cuidadosamente dissecar a região de interesse no cérebro (por exemplo, no hipocampo) sob o microscópio de dissecação 42. Cuidadosamente cortar o tecido e tirar uma fotografia para a preservação de orientação. Nota: Os métodos de pós-processamento de coloração de tecidos em SBFSEM combina uma variedade de métodos de coloração de metais pesados ​​ema fim de melhorar a resolução e baseiam-se no método anteriormente desenvolvido pelo Deerinck 40 et al. </li><li> Lavar os tecidos fixados com glutaraldeído, 3 vezes 5 minutos cada em tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,2). </li><li> Preparar uma solução de ácido tânico 0,1% por dissolução do ácido tânico em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2). Agitar até à dissolução e filtra-se através de 0,45 um filtro se necessário. </li><li> Sufixo os tecidos com cacodilato tamponada com 0,1% de ácido tânico, por incubação em 1 ml de reagente de 30 - 60 min à temperatura ambiente. Nota: O tempo de incubação é dependente do tamanho do tecido, mas 30 min funciona melhor para a maioria dos tecidos. </li><li> Lavar os tecidos 3 vezes, 5 minutos cada em tampão de cacodilato (pH 7.2). </li><li> Dissolve-se 0,3 g de ferrocianeto de potássio e 0,86 g de cacodilato de sódio em 10 ml de H2O destilada (dH2O). Manter a solução ferrocianeto de potássio em gelo. Imediatamente antes da utilização, adicionar 10 ml de 4% tetróxido de ósmio (OsO 4). </li><li> Manchar os tecidos com 2% OSsolução mio-ferrocianeto durante 90 min, em gelo. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O. </li><li> Prepare 1% solução (TCH) thiocarbohydrazide por dissolução de 0,1 g TCH em 10 ml dH2O Dissolve-se a 60 ° C por agitação cada 10 minutos até ficar completamente dissolvida. Observar as precauções de segurança durante o manuseio TCH, especialmente tomar cuidado para evitar o uso de metais, aquecimento a altas temperaturas, ou permitir que solução para secar. </li><li> Tratar as amostras recém-preparado com um TCH% durante 20 min à TA. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O. </li><li> Diluir 4% OsO4 a 2% com dH2O, tecidos mancha com 2% de tetróxido de ósmio aquoso por incubação durante 1 h. Lavar tecidos 3 vezes, 5 min cada um com dH 2 O. </li><li> Incubar as amostras S / N em 1% de acetato de uranilo em dH 2 O a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução de aspartato a vantagem da Walton (como descrito por Deerinck et al 40). <ol><li> Dissolve-se 0,998 g de L-aspartato em 250 ml de dH2Oe, em seguida, adicionam-se 10 N de hidróxido de potássio (KOH) de uma forma gota a gota até o pH atingir 5,5. Após ajuste do pH, adicionar 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 mL de ácido aspártico estoque e aquecer a 60 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Lavar tecidos em dH 2 O e incubar com mancha aspartato vantagem de Walton durante 30 min numa estufa a 60 ° C. Lavar 3 vezes, 5 min cada um em dH 2 O. </li><li> Desidratar as amostras através de uma série graduada de soluções de álcool usando refrigerada de 20%, 50%, 75%, 85% e 95% de etanol durante 5 min cada, seguido de 100% de etanol 3 vezes, 10 min cada. Nota: Use 100% de etanol a partir de garrafa recém-aberta, como o etanol abriu absorve a água do ar e causar a incorporação falhar. incubações mais longas são necessárias com amostras de tecido maiores. </li><li> Lavar as amostras 2 vezes, 15 min cada em óxido de propileno. </li><li> Adicione resina plástica incorporação usando 25 ml de resina, 10,5 ml DDSA (dodecenilo anidrido succínico), 15,5 ml NMA (anidrido nádico de metilo) e 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Misturar a resina por agitação. Rotação e permitir que a resina em repouso até bolhas determinação. Nota: Esta é a receita de dureza média padrão. Podem ser utilizados outros tipos de microscopia de resina plástica de electrões (EM), mas deve ser testado com uma amostra de controlo não-essencial antecedência como todas as resinas não funcionar para SBFSEM. </li><li> Incubar os tecidos o / n em um 50: 50 mistura de óxido de propileno e resina de incorporação, num frasco que é tapado inicialmente, em seguida, destapado após 2 horas de modo a que o óxido de propileno evapora durante o período de cerca de 8-10 h. </li><li> Transferir os tecidos a resina fresca de incorporação de 100% em frascos limpos durante 2 h. </li><li> amostras incorporadas em resina incorporação fresco, em moldes plano que contém as etiquetas de papel impresso, e curá-las num forno a 60 ° C durante 48 h. Após cerca de 1 hora, verifique a colocação do tecido e alinhamento novamente, e ajustar, se necessário. </li><li> Apare amostras para a área de interesse e montar sobre um pino de alumínio usando Gelling supercola cianoacrilato ou uma resina epóxi condutora, em seguida, revestir com prata coloidal colar em torno dos lados do bloco para proporcionar um trajecto condutor para o pino de alumínio. </li><li> Analisar amostras de tecido usando um sistema de microscópio eletrônico de varredura equipado com um estágio ultramicrotome na câmara e baixa kV detector de elétrons retroespalhados 32. Nota: Obtenha-local que treina instrument- e em microscopia eletrônica de varredura (SEM) usar e se tornar um usuário autorizado. Alternativamente, a colaboração com uma facilidade pesquisador ou do núcleo para pequenos projectos pode ser possível. formação de radiação também pode ser necessária como SEMs gerar raios-x. </li><li> À imagem das amostras, use as seguintes configurações: 2.25 kV, em 5-10 nm / pixels de resolução, com tamanhos de campo entre 80-250 mm em x, y (tamanhos possíveis outro campo), e espessura fatia de 50 - 100 nm, com um total de 250 - 600 um em fatias 16 - período de tempo de 20 h. Observação: As configurações variam consideravelmente entre diferentes microscópios, indiamostras indivi- e resolução desejada. Estas definições devem produzir imagens que são facilmente interpretável para muitas amostras. </li></ol> 2. Analisando o conjunto de dados de imagem Nota: O software Image J / Fiji é usado para analisar o conjunto de dados e depende do plugin TrakEM2. etapas de pré-processamento podem ser realizados utilizando uma variedade de software, e pode ser grande ou pequena, dependendo do nível de experiência e as pilhas obtidas. As principais transformações que usam o software de código aberto (ImageJ ver 1.50b, FIJI baixar 01 de outubro de 2015) são descritos aqui. <ol><li> Converter imagens para o formato TIFF de 8 bits a partir das imagens de 16 bits proprietárias originais abrindo no software e selecionar itens do menu Imagem → Tipo → 8 bit. <ol><li> Se a conversão automática de contraste / luminosidade durante este passo não é ideal para imagens, reabrir as imagens de 16 bits, e prima Imagem → Ajuste → Brilho / Contraste. Selecione um intervalo que funciona para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, execute cONVERSÃO. Nota: Em alguns SEMs, este passo pode exigir software fabricante de microscópio. </li><li> Se necessário, devido ao movimento de imagem inaceitável entre fatias (eg. Deriva devido à cobrança), cadastre-se / alinhar as pilhas de imagens (itens de menu Plugins → Registro → Linear StackAlignmentWithSIFT). Na maioria dos softwares de registro, definido para o modo de &quot;tradução-only&quot; em vez de &quot;corpo rígido&quot;. Nota: Muitas abordagens e software pode funcionar: as obras de plug-in de registro SIFT para muitas aplicações e há uma versão pilha virtual. <ol><li> Se necessário, ampliar o tamanho da tela antes do registro (Imagem → Ajuste → canvassize) ou reduzi-la a uma área de interesse (Imagem → Cultura). Nota: Alguns deriva ou splaying pode ocorrer, e tentar outros plugins ou softwares pode produzir melhores resultados. Opções manuais também estão disponíveis (por exemplo. ImageJ / FIJI, Plugins → Registro → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Se desired, imagens em escala de tamanho menor, mais manejável (ex. 25%) usando ImageJ (Imagem → Scale). </li></ol></li><li> O lançamento do software, selecione Arquivo → importação → sequência de imagens e selecione os arquivos de tiff. </li><li> Inicie o plug-in selecionando Arquivo → nova → TrakEM2 (em branco). Duas janelas abrirá; um gerencia o projeto e area_lists eo outro administra o rastreamento, e é referida como a &quot;tela&quot;. </li><li> Carregue a pilha de imagem para o plug-in, fazendo um clique com o botão direito sobre a importação de lona. Escolha de importação e clique na pilha de importação. Nas opções de pop-up, marque a caixa de pilhas virtuais. Nota: Embora as pilhas de imagens já estão abertas no software, eles também devem ser abertas no plugin. O computador pode correr mais suavemente se a caixa de pilhas virtuais está marcada. </li><li> Após os mipmaps são criadas e a pilha é carregado, clique direito de nomear o projeto sob a janela do plugin. clique direito em &#39;novo projeto&#39; no colo templateUMN, e selecione &quot;adicionar novo filho &#39;para esse projeto. Botão direito do mouse novamente para selecionar &#39;area_list&#39;. </li><li> Defina a escala do eixo Z do projeto de acordo com as configurações originais micrografia eletrônica com o botão direito na tela, clique em tela e selecione a calibragem. Além disso, definir a escala Z, selecionando todas as camadas na janela do plug-in, clique direito para selecionar Z escala e espessura. </li><li> Clique e arraste o «projecto» e todas as &#39;crianças&#39; seção para criar as &quot;listas da área &#39;no separador&#39; espaço Z &#39;na janela de lona no projeto objetos. </li><li> Selecione a opção &quot;lista de área&quot; e clique direito para selecionar e definir uma cor. Agora, use a ferramenta pincel para rastrear objetos, tais como mitocôndrias, nas imagens micrografia eletrônica. Use &#39;Shift + clique&#39; para preencher um círculo fechado, &quot;Ctrl + rolar &#39;para zoom in e out, e&#39; Alt + clique para converter pintura cursor do pincel em uma borracha. </li><li> Escolha duas áreas de ~ 10 - 15 uMpor 10 - 15 mm no canto superior esquerdo e canto inferior direito da imagem e identificar todas as mitocôndrias dentro dessas áreas para permitir a amostragem imparcial das mitocôndrias em cada conjunto de dados. </li><li> Na &quot;tela&quot;, observar e rastrear mitocôndrias em todas as seções. Nota: As mitocôndrias são bastante escuro / organelas densas que aparecem, de tamanho similar de diâmetro e vagamente cilíndricas. O cristas única formada pela membrana interna são facilmente distinguíveis dentro dessa organela. </li><li> Quando terminar com o rastreamento, clique direito sobre o area_list na guia espaço Z, selecione &quot;Mostrar em 3D &#39;. Isto irá lançar o plugin visualizador 3D para visualizar uma reconstrução 3D da imagem traçada. <ol><li> Para realizar medições de volume mitocondrial, selecione objeto no visualizador 3D, clique na guia &quot;Editar&quot; e selecione &quot;Propriedades do objeto &#39;. A estimativa do volume mitocondrial é listado juntamente com várias outras medições. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Emily K Benson é funcionária remunerada da Renovo Neural Inc., e Grahame J Kidd atua como Diretor Científico da 3DEM na Renovo Neural Inc., que é uma fornecedora comercial de serviços e análises de SEM de face de bloco serial.

A complexidade do sistema nervoso apresenta um desafio significativo na reconstrução de grandes volumes de tecido e análise da morfologia e distribuição dos organelos tais como as mitocôndrias com resolução adequada. Várias células, incluindo neurônios, oligodendrócitos e astrócitos com numerosos processos estendidos em três dimensões interagem dentro do tecido cerebral 43. Desde mitocôndrias reside tanto na soma das células e dos processos distantes, morfologia mitocondrial é extremamente pleomorfo no sistem...

As mitocôndrias são organelos dinâmicos que alteram a sua forma e localização de acordo com as pistas e necessidades celulares, em interacção com apertado citoesqueleto celular, e em resposta a eventos celulares, tais como correntes de cálcio em neurónios 1. Mitocôndrias também interagir com outros organelos celulares, por exemplo, retículo endoplasmático, que por sua vez regula a sua dinâmica e metabolismo 2. Morfologia mitocondrial mostra heterogeneidade em diferentes tipos de células ou seja. a forma do organelo varia de tubulares para que consiste em folhas, sacos e ovais 3. Tem sido demonstrado que a fusão e fissão proteínas do ciclo mitocondriais pode regular a localização, tamanho, forma e distribuição das mitocôndrias 4. Além disso, alterações na forma mitocondrial estão associadas com a neurodegeneração, a plasticidade neuronal, atrofia muscular, a sinalização de cálcio, a geração de espécies de oxigénio reactivo, bem como tempo de vida e a morte celular implicando THAmorfologia mitocondrial especifica para a célula T é crítica para a manutenção da função celular normal de 5-11. Uma das principais funções bioenergética da mitocôndria é a geração de trifosfato de adenosina (ATP) através da execução de uma série de reacções metabólicas que envolvem degradação completa de nutrientes (ou seja glucose, ácidos gordos ou aminoácidos) através do ciclo do TCA e OXPHOS vias 12. O cérebro humano constitui apenas 2% do peso corporal no entanto, consome cerca de 20% da energia total produzida tornando-se extremamente energia exigindo órgão 13. É, por conseguinte, não é surpreendente que a disfunção mitocondrial em seres humanos conduz a um grande número de manifestações neurológicas 14-17. As mutações genéticas em componentes OXPHOS que prejudicam leads geração de ATP para doenças mitocondriais 17,18, que são clinicamente grupo heterogêneo de doenças com uma prevalência de ~ 1: 5.000 indivíduos, e uma das causas mais comum de mdistúrbios etabolic em crianças e adultos. Déficit de ATP derivado de mitocôndrias afeta vários sistemas do órgão com os órgãos que exigem alta energia, como o cérebro, coração e músculos esqueléticos sendo influenciados principalmente nesses pacientes 14,17,18. Nos últimos anos, vários estudos têm fornecido evidências para disfunção mitocondrial em ambas as desordens do desenvolvimento neurológico e neurodegenerativas 15-17,19,20. Desde mitocôndrias é essencial e crítico para o desenvolvimento e funcionamento do cérebro, é imperativo desenvolver protocolos que podem analisar as mudanças no cérebro mitocondrial morfologia, estrutura, tamanho, número e distribuição sob ambos os estados saudáveis ​​e doentes. Modelos de rato com mitocôndrias-alvo a proteína fluorescente verde (GFP) foram produzidos para visualizar movimentos mitocondriais e localização no cérebro 21,22. Embora esta seja uma ferramenta extremamente útil para analisar a motilidade mitocondrial e distribuição geral, existem algumas desvantagens que inclue limitada resolução e sensibilidade da microscopia de fluorescência. Estes atributos tornam difícil acompanhar os relativamente pequenos mitocôndrias porte. Da mesma forma, microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para visualizar mitocôndrias sináptica 23, mas este método é muito demorado. Morfologia mitocondrial é conhecida por ser altamente dinâmicos uma vez que passam por ciclos contínuos de fissão e de fusão, e na maioria das células mitocôndrias manter uma rede altamente ligado 24-26. Os neurônios são altamente células com vários dendritos e axônios estendidos, e as mitocôndrias que formam uma rede reticular conectado no corpo da célula polarizada pode ter que separar como eles fazem seu caminho através destes neurites (Figura 1). Isso faz com que as mitocôndrias do cérebro extremamente variadas em tamanho e forma. Por exemplo, usando microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) técnica, observamos anteriormente que a diferença no volume ou tamanho do mitochondr extrasynapticIA para mitocôndrias presentes nos terminais do nervo pode ser tanto quanto 27 dezasseis vezes. Existem várias abordagens para a realização de volume analisa 28, que inclui de série seção TEM 29, fita automatizada coleta ultramicrotome SEM 30, com foco Ion Beam SEM 31 e SBFSEM 32. A análise SBFSEM tem vantagens na medida em que tem a resolução de fornecer dados quantitativos sobre os morfológica forma, tamanho, número e distribuição dos organelos tais como a mitocôndria em áreas de até 1 mm do cérebro. A operação técnica é também o menos exigente, com aquisição de dados e análise dentro das capacidades de muitos laboratórios biológicos que não têm experiência EM anterior. O advento de instrumentos comerciais para gerar imagens de seção do tipo de série tem feito exame ultra-estrutural em 3D de tecidos de uma técnica de rotina, o que permite ainda uma análise volumétrica imparcial de uma forma rápida e repetível 28 </sup&gt;. O SBFSEM foi descrita pela primeira vez e usado no campo da neurobiologia em 2004 32, baseado em uma idéia introduzida por Leighton em 1981 33. Vários estudos desde então estabeleceram esta técnica como uma ferramenta importante na análise de reconstrução do circuito neuronal 34. Além disso, para muitos projectos de menor escala, ele fornece uma análise de reconstrução para identificar organelas celulares 27,35-39. Uma vez que, as imagens obtidas são derivados de baixa tensão elétrons volta de dispersão, novos protocolos de coloração que combinam diferentes técnicas conhecidas de coloração de metais pesados ​​foram desenvolvidos para aumentar a resolução 40. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para a utilização de 3D ​​imagens de microscopia eletrônica e análise volumétrica das mitocôndrias do cérebro com base em métodos que foram usados ​​previamente por nós e outros 38,39,41. Os métodos de tecido pós-processamento utilizadas foram como anteriormente descrito por Deerinck et al40.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6J Laboratório</td><td>Jackson&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone, nome comercial Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de dissecação</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly canula</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino Filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>(0,45 mícron)</td> <td>EMD Microscópio</td><td>de</td> dissecção NC0813356 <td></td>Millipore</tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de seccionamento de vibratomo</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sódio</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Tânico</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianeto de Potássio</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio Solução a 4%</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Chumbo</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 KIT DE INCORPORAÇÃO</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contém resina Embed 812, DDSA, NMA e DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldeído 25% EM Grau</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Molde de incorporação</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Pino de amostra de alumínio</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Prata coloidal Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Lojas de hardware/artesanato carregam este item</td></tr><tr><td>Epóxi condutor</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>microscópio eletrônico de varredura</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>em câmara ultramicrótomo para SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Pode ser projetado para outros SEMs</td></tr><tr><td>Microscópio de corte para preparação de pinos</td><td>Gatan Inc.</td><td>fornecido como parte do sistema 3View Detector</td><td></td>de</tr><tr><td>elétrons retroespalhados de baixo kV</td><td>Gatan Inc.</td><td>Pacote de processamento 3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fiji&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download 1 de outubro de 2015<</td><td>a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

análise do cérebro mitocôndrias usando serial block-cara scanning electron microscopy



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

O cérebro humano é um órgão alta consumindo energia que depende principalmente da glicose como fonte de combustível. A glicose é catabolizada pela mitocôndria do cérebro através de vias de glicólise, ácido tri-carboxílico (TCA) ciclo e fosforilação oxidativa (FOX) para produzir a energia celular na forma de trifosfato de adenosina (ATP). Comprometimento da produção de ATP mitocondrial provoca doenças mitocondriais, que apresentam clinicamente com sintomas neurológicos e miopáticos proeminentes. Defeitos mitocondriais também estão presentes em desordens do desenvolvimento neurológico (por exemplo, transtorno do espectro do autismo) e doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e Parkinson). Assim, há um aumento do interesse na área para a realização de análise 3D da mitocondrial morfologia, estrutura e distribuição em ambos os estados saudáveis ​​e doentes. A morfologia mitocondrial cérebro é extremamente diverso, com algumas mitocôndrias especialmente aqueles ema região sináptica estar na gama de &lt;200 nm de diâmetro, que é inferior ao limite de resolução de microscopia óptica tradicional. Expressando uma proteína mitocondrial-alvo verde fluorescente (GFP) no cérebro aumenta significativamente a detecção organelar por microscopia confocal. No entanto, ele não superar os constrangimentos sobre a sensibilidade de detecção de pequenas relativamente mitocôndrias porte sem supersaturação as imagens de grande porte mitocôndrias. Enquanto microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para caracterizar mitocôndrias na sinapse neuronal, esta técnica é extremamente demorada, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A técnica de microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) envolve um processo automatizado de corte, blocos de imagem de tecido e aquisição de dados. Aqui, nós fornecemos um protocolo para realizar SBFSEM de uma região definida a partir de cérebro de roedores para reconstruir rapidamente e visualizar a morfologia mitocondrial. esta tecnologianique também poderia ser utilizado para fornecer informação precisa sobre o número de mitocôndrias, de volume, de tamanho e distribuição na região do cérebro definido. Desde a resolução da imagem obtida é alta (tipicamente abaixo de 10 nm) quaisquer defeitos morfológicos mitocondriais brutas também pode ser detectado.

Nós demonstramos que a morfologia mitocondrial cérebro e tamanho é heterogênea em diferentes sub-compartimentos neuronais. A microscopia confocal na densidade culturas neuronais baixos transduzidas com lentivírus expressando a proteína fluorescente verde mitocôndrias-alvo mostraram que as mitocôndrias que residem na soma neuronal formar uma rede reticular, ao passo que aqueles que residem em neurites distais apresentam uma morfologia alongada discreto (Figura 1 AB). Usan...

A visualização e análise mitocondrial do tecido cerebral de mamíferos é uma tarefa desafiadora. Aqui, descrevemos como a análise de reconstrução tridimensional (3D) da microscopia eletrônica de varredura serial (SBFSEM) pode ser usada para obter insights sobre a análise morfológica e volumétrica dessa organela geradora de energia crítica.

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

O objetivo geral da técnica de microscopia eletrônica de varredura de corte em bloco em série é analisar a morfologia, estrutura, distribuição, volume e número de mitocôndrias em uma região definida do cérebro de camundongo. Este método pode ajudar a responder muitas questões fundamentais em neurobiologia, como se alterações na estrutura, número e distribuição das mitocôndrias cerebrais contribuem significativamente para distúrbios neurodegenerativos e neurodesenvolvimentais. A principal vantagem desta técnica é que ela automatiza o processo de obtenção de imagens de cortes em série ao incorporar um ultramicrotomo personalizado integrado à câmara de vácuo reduzido do microscópio eletrônico de varredura.Para iniciar o experimento, lave os tecidos previamente preparados e fixados com glutaraldeído três vezes, por cinco minutos cada, em tampão cacodilato 0,1 molar. Pós-fixe os tecidos com 1 mililitro de ácido tánico 0,1% tamponado com cacodilato por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a pós-fixação, lave os tecidos em tampão cacodilato.Dissolva 0,3 gramas de ferrocianeto de potássio e 0,86 gramas de cacodilato de sódio em 10 mililitros de água destilada. Imediatamente antes do uso, adicione 10 mililitros de tetróxido de ósmio a 4% e cora os tecidos com solução de ferrocianeto de ósmio a 2% durante 90 minutos em gelo. Após a coloração, lave o tecido em água destilada.Trate as amostras com solução fresca de tiocarboidrazida (TCH) a 1% por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as amostras. Depois, cora os tecidos com tetróxido de ósmio aquoso a 2% por uma hora.Após a coloração, lave os tecidos com água destilada. Incube as amostras durante a noite em 1% de acetato de uranila em água destilada a 4 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue os tecidos em água destilada e incube-os com a coloração de aspartato de chumbo de Welton em uma estufa.Obter as colorações teciduais mais adequadas é essencial para a obtenção de imagens, pois uma coloração inadequada resulta em um fenômeno de carregamento na amostra que dificulta ou impossibilita a aquisição de imagens. Lave o tecido em água destilada. Desidrate as amostras por meio de uma série graduada de álcool utilizando soluções frias de etanol por cinco minutos cada, seguida por desidratação com etanol a 100% três vezes, por 10 minutos cada.Lave as amostras duas vezes, por 15 minutos cada, em óxido de propileno. Coloque os tecidos em uma mistura 1:1 de resina de inclusão e óxido de propileno, tampe o frasco e incube os tecidos durante a noite. Destampe o frasco após duas horas para que o óxido de propileno evapore ao longo do período de nove horas.Transfira os tecidos para resina de inclusão fresca a 100% em frascos limpos durante duas horas. Inclua as amostras em resina de inclusão fresca em moldes planos contendo rótulos impressos em papel e polimerize-as em estufa. Após uma hora, verifique o posicionamento e o alinhamento do tecido e ajuste, se necessário.Recorte as amostras para a área de interesse e monte-as em um pino de alumínio utilizando cola super cianoacrilato em gel. Em seguida, recubra a amostra com pasta de prata coloidal ao redor das laterais do bloco para fornecer um caminho condutivo até o pino de alumínio. Examine os espécimes de tecido usando um sistema de microscopia eletrônica de varredura equipado com estágio de ultramicrótomo na câmara e detector de elétrons retroespalhados de baixa quilovoltagem.Imagem as amostras com essas configurações. Inicie a análise selecionando Imagem, Tipo e, em seguida, 8 bits para converter as imagens para o formato TIFF de 8 bits a partir do formato proprietário original de 16 bits. Se a conversão automática de contraste e/ou brilho durante esta etapa não for ideal para as imagens, reabra as imagens de 16 bits e pressione Imagem, Ajustar, Brilho/Contraste.Selecione uma faixa que funcione para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, realize a conversão. Se houver movimento de imagem inaceitável entre as fatias, alinhe as pilhas de imagens selecionando Plugins, Registration e Linear Stack Alignment com SIFT e configure o alinhamento no modo somente translação, em vez do modo corpo rígido.Aumente o tamanho da tela antes do registro selecionando Imagem, Ajustar, Tamanho da Tela. Alternativamente, reduza a imagem a uma área de interesse selecionando a região desejada e, em seguida, recortando-a. Se necessário, redimensione as imagens para um tamanho menor e mais prático usando o ImageJ, depois selecione Imagem e Escala.A microscopia confocal em culturas neuronais de baixa densidade mostrou que as mitocôndrias localizadas no corpo celular neuronal formam uma rede reticular, enquanto aquelas localizadas em neuritos distais exibem uma morfologia alongada e discreta. Utilizando a técnica de microscopia eletrônica de varredura de corte em bloco em série, ou SBFSEM, as mitocôndrias, dendritos e varicosidades axonais foram claramente observadas no cérebro de camundongo. Reconstruções de três dias das mitocôndrias nos neuritos do tecido cerebral de camundongo exibiram uma diferença de tamanho entre as mitocôndrias dendríticas e axonais.Dados extraídos de uma imagem representativa de SBFSEM 2-D revelaram que o volume ou tamanho das mitocôndrias localizadas nas pré-sinapses neuronais era significativamente menor do que o das mitocôndrias localizadas na região extrassináptica. As imagens obtidas pela análise de SBFSEM proporcionam resolução aumentada para visualizar as características ultraestruturais de mitocôndrias individuais. É possível classificar o compartimento celular das mitocôndrias determinando sua proximidade com estruturas prontamente identificáveis, como mitocôndrias somáticas não sinápticas e mitocôndrias pré-sinápticas.Essa técnica pode ser realizada em cerca de sete dias, o que inclui três dias de coloração, dois dias para cura da resina, um dia de imageamento para produzir uma pilha adequada para esta análise, e cerca de duas a quatro horas para o pós-processamento das imagens em preparação para a análise. Este procedimento também pode ser usado em conjunto com outros métodos de imageamento de mitocôndrias, como imageamento em tempo real com mitocôndrias marcadas geneticamente, para responder perguntas sobre o tráfego mitocondrial e a dinâmica de sua fissão e fusão.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Mukherjee, K., et. al. análise de mitocôndrias cerebrais usando microscopia eletrônica de varredura serial de face de bloco. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a preparação, imagem e análise de tecido cerebral de camundongo usando um microscópio eletrônico de varredura serial (SBFSEM) para visualizar a ultraestrutura mitocondrial, permitindo o mapeamento preciso de sua morfologia e distribuição espacial nos compartimentos neuronais axonais e dendríticos.

 Imagem de mitocôndrias neuronais usando um microscópio eletrônico de varredura serial de face de bloco

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

A rede mitocondrial é extremamente complexa, tornando-a muito difícil de analisar. Uma nova ferramenta MATLAB analisa mitocôndrias confocais ao vivo em imagens de timelapse, mas resulta em um grande volume de saída que requer atenção manual individual. Para resolver esse problema, uma otimização de rotina foi desenvolvida, permitindo uma análise rápida dos arquivos.

Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

Este estudo apresenta um método para analisar a morfologia das mitocôndrias baseado em imunomarcação e análise de imagens em tecido cerebral de camundongos in situ. Também descreve como isso permite detectar alterações na morfologia mitocondrial induzidas pela agregação de proteínas em modelos da doença de Parkinson.

Exame histológico da morfologia mitocondrial em modelo de doença de Parkinson

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para imagens da morfologia mitocondrial em múltiplos tecidos de C. elegans durante o envelhecimento.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Neste estudo, descrevemos um protocolo passo a passo e enfatizamos os principais detalhes para determinar as características morfológicas das mitocôndrias em células vivas, incluindo preparação de amostras, aquisição de imagens e análise de dados. Este método é comumente usado para examinar a morfologia mitocondrial para estudar várias condições.

Determinação da morfologia mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal

Aprenda a analisar a morfologia mitocondrial em tecido cerebral de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura por bloco serial. Esta técnica automatizada permite reconstrução 3D detalhada para estudos em neurobiologia.

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

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