Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

O objetivo geral da técnica de microscopia eletrônica de varredura serial é analisar a morfologia, estrutura, distribuição, volume e número mitocondrial em uma região definida do cérebro do camundongo. Este método pode ajudar a responder a muitas questões-chave em neurobiologia, como se as mudanças na estrutura, número e distribuição das mitocôndrias cerebrais contribuem substancialmente para distúrbios neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela automatiza o processo de geração de imagens de seções seriais, incorporando um ultramicrótomo personalizado embutido na câmara do microscópio eletrônico de varredura de baixo vácuo.

Para iniciar o experimento, lave os tecidos fixados com glutaraldeído previamente preparados três vezes por cinco minutos cada em tampão de cacodilato 0,1 molar. Pós-fixar os tecidos com 1 mililitro de ácido tânico a 0,1% tamponado com cacodilato por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a pós-fixação, lave os tecidos em tampão cacodilato.

Dissolva 0,3 gramas de ferrocianeto de potássio e 0,86 gramas de cacodilato de sódio em 10 mililitros de água destilada. Pouco antes de usar, adicione 10 mililitros de tetróxido de ósmio a 4% e core os tecidos com solução de ferrocianeto de ósmio a 2% por 90 minutos no gelo. Após a coloração, lave o tecido em água destilada.

Trate as amostras com solução de tiocarbohidrazida a 1% ou TCH recém-preparada por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as amostras. Em seguida, core os tecidos com tetróxido de ósmio aquoso a 2% por uma hora.

Após a coloração, lave os tecidos com água destilada. Incubar as amostras durante a noite em acetato de uranilo a 1% em água destilada a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave os tecidos em água destilada e incuba-os com a mancha de aspartato de chumbo de Welton em um forno.

Obter as melhores colorações possíveis de tecidos é fundamental para a geração de imagens, pois a coloração ruim resulta em um fenômeno de carga na amostra que dificulta ou impossibilita a imagem. Lave o lenço em água destilada. Desidratar as amostras através de uma série graduada de álcool usando soluções resfriadas de etanol por cinco minutos cada, seguido por uma desidratação de etanol a 100% três vezes por 10 minutos cada.

Lavar as amostras duas vezes durante 15 minutos cada em óxido de propileno. Coloque os tecidos em uma mistura 1:1 de resina de incorporação e óxido de propileno, tampe o frasco e incube os tecidos durante a noite. Destampe o frasco para injetáveis após duas horas para que o óxido de propileno evapore durante o período de nove horas.

Transfira os lenços para 100% de resina de incorporação fresca em frascos limpos por duas horas. Incorpore as amostras em resina fresca de incorporação em moldes planos contendo etiquetas de papel impressas e cure-as em um forno. Após uma hora, verifique a colocação e o alinhamento do tecido e ajuste, se necessário.

Apare as amostras na área de interesse e monte-as em um pino de alumínio usando supercola de cianoacrilato gelificante. Em seguida, cubra a amostra com pasta de prata coloidal nas laterais do bloco para fornecer um caminho condutor para o pino de alumínio. Examine as amostras de tecido usando um sistema de microscópio eletrônico de varredura equipado com um estágio de ultramicrótomo na câmara e um detector de elétrons retroespalhados de baixo quilovolt.

Crie imagens das amostras com essas configurações. Comece a análise selecionando Imagem, Tipo e 8 bits para converter as imagens para o formato TIFF de 8 bits do proprietário original de 16 bits. Se a conversão automática de contraste e/ou brilho durante esta etapa não for ideal para imagens, reabra as imagens de 16 bits e pressione Imagem, Ajustar, Brilho/Contraste.

Selecione um intervalo que funcione para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, execute a conversão. Se houver movimento de imagem inaceitável entre as fatias, alinhe as pilhas de imagens selecionando Plug-ins, Registro e Alinhamento de pilha linear com SIFT e defina o alinhamento para o modo somente de conversão em vez de corpo rígido.

Aumente o tamanho da tela antes do registro selecionando Imagem, Ajustar, Tamanho da tela. Como alternativa, reduza a imagem a uma área de interesse selecionando a região desejada e cortando-a. Se necessário, dimensione as imagens para um tamanho menor e mais gerenciável usando ImageJ e, em seguida, selecionando Imagem e Escala.

A microscopia confocal em culturas neuronais de baixa densidade mostrou que as mitocôndrias que residem no soma neuronal formam uma rede reticular, enquanto aquelas que residem em neuritos distais exibem uma morfologia alongada discreta. Usando a microscopia eletrônica de varredura serial de face de bloco, ou técnica SBFSEM, as mitocôndrias, dendritos e varicosidades axonais foram claramente observadas no cérebro do camundongo. Reconstruções de três dias de mitocôndrias nos neuritos do tecido cerebral de camundongos mostraram uma diferença de tamanho entre as mitocôndrias dendríticas e axonais.

Os dados extraídos de uma imagem 2-D representativa do SBFSEM revelaram que o volume ou tamanho das mitocôndrias que residem nas pré-sinapses neuronais era significativamente menor do que aquelas que residem na região extra-sináptica. As imagens adquiridas pela análise SBFSEM fornecem maior resolução para visualizar as características ultraestruturais das mitocôndrias individuais. É possível classificar o compartimento celular das mitocôndrias determinando sua proximidade com estruturas facilmente identificáveis, como mitocôndrias somáticas não sinápticas e mitocôndrias pré-sinápticas.

Essa técnica pode ser feita em cerca de sete dias, o que inclui três dias de coloração, dois dias para cura em resina, um dia de imagem para produzir uma pilha adequada para essa análise e cerca de duas a quatro horas para pós-processamento de imagem em preparação para a análise. Este procedimento também pode ser usado em conjunto com outros métodos de imagem de mitocôndrias, como imagens ao vivo com mitocôndrias geneticamente marcadas para responder a perguntas sobre o tráfego mitocondrial e a dinâmica de sua fissão e fusão.