High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

O objetivo geral dessa técnica de microarranjo de polímeros é identificar polímeros sintéticos capazes de modular a adesão de bactérias a superfícies abióticas. Este método pode ajudar a acelerar o progresso na descoberta de biomateriais simples e economicamente viáveis que inibam a adesão bacteriana a dispositivos médicos. A principal vantagem dessa técnica, em comparação com a pesquisa convencional de biomateriais que testa um material por vez, é a sua capacidade de triar centenas de polímeros simultaneamente em um único ensaio.

Para começar, prepare soluções poliméricas e adicione-as aos poços de uma placa de 384 poços, conforme o protocolo descrito. Crie uma rotina para imprimir os polímeros em quadruplicata, consistindo de 1536 pontos, organizados em 48 linhas e 32 colunas, imprimindo 32 soluções poliméricas por vez, de modo que a impressora possa ser interrompida após a impressão de cada seção para permitir a limpeza das ponteiras. Agora, posicione as lâminas revestidas com agarose sobre a plataforma e garanta um bom selamento a vácuo para manter as lâminas fixas em posição.

Para ajustar a cabeça de impressão de modo que todos os pinos estejam na mesma altura, abaixe manualmente a cabeça sobre uma lâmina de vidro e confirme que os pinos se movem para cima ao mesmo tempo. Coloque a placa de poços no suporte com o poço A1 no canto superior direito do suporte e certifique-se de que a placa de poços esteja firmemente fixada. Confirme que a lâmina e a placa de poços estão posicionadas quando solicitado.

Imprima uma seção por vez, permitindo a limpeza dos pinos entre as seções. Em seguida, use uma toalha de papel mergulhada em acetona para limpar completamente os pinos. Depois, utilize papel toalha seco para garantir que os pinos estejam totalmente secos.

Quando as microarranjos estiverem completamente impressos, coloque-os em um porta-lâminas e transfira-os para uma estufa a vácuo, ajustada a 40 graus celsius, para secagem, a fim de remover o N&P nos pontos de polímero. Em seguida, use luz UV para esterilizar as placas por 30 minutos. Antes de inocular as lâminas com bactérias, realize uma medição da fluorescência de fundo conforme descrito no protocolo.

Após o cultivo e a preparação dos inóculos para os microarranjos, conforme descrito no protocolo, coloque os microarranjos poliméricos esterilizados por UV em placas retangulares com quatro poços e adicione seis mililitros de culturas bacterianas mistas. Incube as placas a 37 graus celsius com agitação suave durante cinco dias. Após a incubação, use PBS para lavar suavemente os microarranjos duas vezes.

Em seguida, adicione um micrograma por mililitro de DAPI em PBS e incube por 30 minutos. Depois, transfira os microarranjos para uma placa fresca de quatro poços, cubra os microarranjos com PBS e agite suavemente. Em seguida, troque o PBS uma vez e repita a lavagem.

Após a lavagem, seque as micromatrizes sob fluxo de ar, aplique filme de vedação e fixe lamínulas de vidro aos lâminas de micromatrizes. Quando a cola estiver seca, use etanol 70% para esterilizar a superfície externa. Usando um microscópio de fluorescência, equipado com objetiva de 20x, capture imagens individuais para cada ponto de polímero nos canais de campo claro e strappy.

Para revestir lamínulas com polímeros, prepare soluções dos polímeros HIT em tetraidrofurano ou outro solvente apropriado. Utilizando um spin coater, realize o revestimento por centrifugação de lamínulas circulares de vidro de tamanho adequado com as soluções poliméricas a 2000 RPM durante dez segundos. Seque as lamínulas revestidas em uma estufa de convecção a 40 graus celsius durante a noite.

E utilize luz UV para esterilizar as lamínulas por 30 minutos antes de inoculá-las com bactérias. Coloque as lamínulas esterilizadas com UV em uma placa padrão de 12 ou 24 poços e incube com bactérias conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Após a incubação, use tampão cacodilato 0,1 molar para lavar as lamínulas recobertas duas vezes e, em seguida, fixe as amostras por duas horas com glutaraldeído a 2,5% peso por volume e tampão cacodilato 0,1 molar.

Pós-fixe as lamínulas com tetróxido de ósmio a 1% por uma hora em temperatura ambiente. Antes de desidratá-las em uma série de etanol por 30 minutos em cada concentração. Em seguida, recubra as amostras com um revestidor por pulverização catódica e uma mistura de liga ouro-platina na proporção de 60 a 40%, utilizando uma corrente de 30 miliampères e um vácuo de 0,75 torr.

Após obter imagens com MEV, compare visualmente as imagens dos lamínulas não revestidos e daqueles revestidos com agarose ou os polímeros HIT para confirmar a capacidade dos polímeros de ligar ou repelir bactérias. Para avaliar a compatibilidade de diversos solventes com a parte final do cateter, bem como sua capacidade de dissolver o polímero HIT, imerja os pedaços do cateter nos solventes e incube por 12 horas antes de avaliar visualmente a integridade do cateter e a clareza do solvente. Para analisar a adesão bacteriana em cateteres por MEV, prepare uma solução de polímero a 10% em acetona.

Pressione a ponta de uma micropipeta de 200 microlitros na porção mediana do pedaço cortado do cateter para segurá-lo e mergulhe o pedaço na solução polimérica por aproximadamente 30 segundos. Seque o pedaço revestido em condições ambientes por 30 minutos, então aplique um segundo revestimento mergulhando novamente o pedaço do cateter na solução polimérica e seque durante a noite em condições ambientes. Após incubação de pedaços de cateter revestidos e não revestidos em LB inoculado, de acordo com o protocolo descrito no texto, use um mililitro de PBS para lavar os cateteres.

Em seguida, utilize paraformaldeído a 10% em PBS para fixar as bactérias durante 30 minutos. Após uma lavagem com PBS, use DAPI para corar as bactérias nos fragmentos do cateter por 20 minutos. Antes de lavar com um mililitro de PBS.

Observe o arranjo das amostras na câmara. Usando as configurações a seguir, obtenha imagens confocais dos pedaços do cateter. Conclua a aquisição confocal por meio de z-stack com 50 imagens ao longo de um comprimento de 100 micrômetros do cateter.

Após o tratamento com UV e incubação com bactérias, utilize um mililitro de PBS para lavar as peças duas vezes e transfira-as para placas de 48 poços contendo formaldeído a 10% em PBS por 30 minutos. Após a fixação das amostras, realize outra lavagem com PBS e seque durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, monte-as em suportes com discos de carbono condutivo e utilize um sputter coater para metalização com ouro.

Antes da obtenção de imagens, utilizando um microscópio eletrônico de varredura. Esta figura mostra a adesão bacteriana a uma série de polímeros conforme determinado pela análise de micromatriz. Os pontos impressos sem polímero servem como controle negativo, já que a agarose resiste fortemente à ligação bacteriana e, portanto, a fluorescência é muito baixa.

Os polímeros exibidos apresentam ligação com ligas, embora na maioria dos casos as propriedades repelentes de um polímero variem significativamente entre as espécies bacterianas testadas. Isso reflete as grandes diferenças entre os mecanismos de adesão em diferentes espécies. Os polímeros de baixa ligação são facilmente identificados pela comparação com agarose.

Polímeros de alta ligação provavelmente serão identificados em uma matriz e podem ser usados como controles positivos para experimentos subsequentes. Para polímeros que não apresentam auto-fluorescência no canal DAPI, pode-se realizar visualmente uma comparação qualitativa das imagens dos pontos. Foram realizados experimentos em larga escala para testar o revestimento de superfícies maiores, a fim de confirmar as propriedades repelentes a bactérias de 22 polímeros apropriados identificados.

Mostrados aqui estão as amostras com melhor desempenho utilizadas para revestir lamínulas de vidro, conforme analisado por MEV. Essas figuras mostram cortes de cateter analisados por microscopia confocal e MEV. Ambos os métodos microscópicos têm a vantagem de permitir contagens diretas de células na superfície, fornecendo dados inequívocos, já que a redução na adesão celular é facilmente visível.

Após este procedimento, componentes do soro ou do sangue podem ser testados para determinar seu impacto na ligação bacteriana. Um modelo animal pode ser utilizado para avaliar o potencial dos revestimentos poliméricos para uso clínico. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos e organismos patogênicos pode ser perigoso.

E controles necessários devem ser adotados durante o manuseio e descarte para mitigar riscos pessoais e ambientais.