High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

O objetivo geral desta técnica de microarranjo polimérico é identificar polímeros sintéticos capazes de modular a ligação de bactérias a superfícies abióticas. Este método pode ajudar a acelerar o progresso na descoberta de biomateriais simples e econômicos que inibem a ligação bacteriana a dispositivos médicos. A principal vantagem dessa técnica em comparação com a pesquisa convencional de biomateriais de testar um material de cada vez é sua capacidade de rastrear centenas de polímeros simultaneamente em um único ativo.

Para começar, prepare soluções de polímero e adicione-as aos poços de uma placa de 384 poços, de acordo com o protocolo de texto. Crie uma rotina para imprimir polímeros em quadruplicado composto por 1536 pontos, dispostos em 48 linhas e 32 colunas, imprimindo 32 soluções de polímeros por vez para que a impressora possa ser parada após a impressão de cada seção para permitir a limpeza dos pinos. Agora coloque as corrediças revestidas de agarose na plataforma e garanta uma boa vedação a vácuo para manter as corrediças na posição.

Para ajustar o cabeçote de impressão para que todos os pinos fiquem na mesma altura, abaixe manualmente o cabeçote em uma lâmina de vidro e confirme se os pinos se movem para cima ao mesmo tempo. Coloque a placa do poço no suporte da placa com o poço A1 no canto superior direito do suporte e certifique-se de que a placa do poço esteja firmemente fixada. Confirme se a corrediça e a placa do poço estão na posição quando solicitado.

Imprima uma seção de cada vez, permitindo a limpeza dos pinos entre as seções. Em seguida, use uma toalha de papel embebida em acetona para limpar bem os pinos. Seguido de papel de seda seco para garantir que os pinos estejam totalmente secos.

Quando os microarrays estiverem completamente impressos, coloque-os em um suporte de lâminas e transfira-os para um forno a vácuo, ajustado a 40 graus Celsius para secar, para remover o N&P nas manchas de polímero. Em seguida, use luz ultravioleta para esterilizar as placas por 30 minutos. Antes de inocular lâminas com bactérias, faça uma medição da fluorescência de fundo de acordo com o protocolo de texto.

Após a cultura e preparação do inóculo para os microarrays, de acordo com o protocolo de texto, coloque os microarrays de polímero esterilizado UV em placas retangulares de quatro poços e adicione seis mililitros de culturas bacterianas mistas. Incubar as placas a 37 graus Celsius com agitação suave durante cinco dias. Após a incubação, use PBS para enxaguar suavemente os microarrays duas vezes.

Em seguida, adicione um micrograma por mililitro de DAPI em PBS e incube por 30 minutos. Em seguida, transfira os microarrays para uma nova placa de quatro poços, cubra os microarrays com PBS e gire suavemente. Em seguida, troque o PBS uma vez e repita a lavagem.

Após o enxágue, seque os microarrays sob um fluxo de ar, aplique o filme de vedação e afixe as lamínulas de vidro nas lâminas do microarray. Quando a cola estiver seca, use etanol 70% para esterilizar a superfície externa. Usando um microscópio de fluorescência, equipado com um subjetivo de 20x, capture imagens únicas para cada ponto de polímero em canais de campo claro e tiras.

Para revestir lamínulas com polímeros, preparar soluções de polímeros de HIT em tetra-hidrofurano ou outro solvente adequado. Utilizando um revestidor rotativo, revestir lamínulas circulares de vidro de dimensões adequadas com as soluções de polímero a 2000 RPM durante dez segundos. Seque as lamínulas revestidas em um forno de convecção a 40 graus Celsius durante a noite.

E use luz ultravioleta para esterilizar as lamínulas por 30 minutos antes de inocular com bactérias. Coloque as lamínulas esterilizadas por UV em uma placa padrão de 12 ou 24 poços e incube com bactérias, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Após a incubação, use tampão de cacodilato molar 0,1 para lavar as lamínulas revestidas duas vezes e, em seguida, com 2,5% de peso por volume de glutaraldeído e tampão de cacodilato molar 0,1, fixe as amostras por duas horas.

Fixe as lamínulas com tetróxido de ósmio a 1% por uma hora em temperatura ambiente. Antes de desidratá-los em uma série de etanol por 30 minutos em cada concentração. Em seguida, com um revestidor de pulverização catódica e uma mistura de 60 a 40% de ouro para liga de platina, cubra as amostras usando uma corrente de 30 miliamperes e um vácuo de 0,75 torr.

Depois de tirar imagens com SEM, compare visualmente as imagens das lamínulas não revestidas e aquelas revestidas com agarose ou polímeros HIT para confirmar a ligação bacteriana ou as habilidades de repelência dos polímeros. Para avaliar vários solventes quanto à compatibilidade com a parte do poço final do cateter, bem como sua capacidade de dissolver o polímero HIT, mergulhe as peças do cateter nos solventes e incube por 12 horas antes de avaliar visualmente a integridade do cateter e a clareza do solvente. Para analisar a fixação bacteriana em cateteres por MEV, prepare solução de polímero a 10% em acetona.

Pressione uma ponta de micropipeta de 200 microlitros na parte central da peça cortada do cateter para segurá-la e cole a peça na solução de polímero por aproximadamente 30 segundos. Seque a peça revestida em condições ambientais por 30 minutos e, em seguida, aplique uma segunda camada imergindo a peça do cateter novamente na solução de polímero e seque durante a noite em condições ambientais. Após incubar os cateteres revestidos e não revestidos no LB inoculado, de acordo com o protocolo de texto, usar um mililitro de PBS para lavar os cateteres.

Em seguida, use 10% de paraformaldeído em PBS para fixar as bactérias por 30 minutos. Após uma lavagem com PBS, use DAPI para corar as bactérias nas peças do cateter por 20 minutos. Antes de lavar com um mililitro de PBS.

Observe a disposição das amostras na câmara. Usando as configurações a seguir, tire imagens confocais das peças do cateter. Complete a imagem confocal empilhando 50 imagens em um comprimento de 100 micrômetros do cateter.

Após o tratamento UV e incubação com bactérias, use um mililitro de PBS para lavar as peças duas vezes e transfira-as para placas de 48 poços contendo 10% de formaldeído em PBS por 30 minutos. Depois de fixar as amostras, faça outra lavagem com PBS e seque durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, monte em pontas com discos de carbono condutores e use um revestidor de pulverização catódica para revestir de ouro.

Antes de obter imagens, usando um microscópio eletrônico de varredura. Esta figura mostra a ligação bacteriana a vários polímeros, conforme determinado pela análise de microarray. Os pontos impressos sem polímero atuam como controle negativo, pois a agarose resiste fortemente à ligação bacteriana e, portanto, a fluorescência é muito baixa.

Os polímeros exibidos são ligantes de liga, embora, na maioria dos casos, as propriedades repelentes de um polímero variem significativamente entre as espécies bacterianas testadas. Isso reflete as grandes diferenças entre os mecanismos de apego em diferentes espécies. Os polímeros de baixa ligação são facilmente identificados em comparação com a agarose.

É provável que polímeros de alta ligação sejam identificados em uma matriz e possam ser usados como controles positivos para experimentos subsequentes. Para polímeros que não apresentam autofluorescência no canal DAPI, a comparação qualitativa das imagens pontuais pode ser feita visualmente. Experimentos de aumento de escala para testar o revestimento de superfícies maiores foram realizados para confirmar as propriedades repelentes de bactérias de 22 polímeros apropriados identificados.

Aqui são mostradas as amostras de melhor desempenho usadas para revestir lamínulas de vidro, analisadas por MEV. Essas figuras mostram cortes de cateter analisados por microscopia confocal e MEV. Ambos os métodos microscópicos têm o benefício de permitir contagens diretas de células na superfície, fornecendo dados inequívocos, uma vez que a redução na fixação celular é facilmente visível.

Após este procedimento, o soro ou os componentes sanguíneos podem ser testados para determinar seu impacto na ligação bacteriana. Um modelo animal poderia ser usado para avaliar o potencial dos revestimentos poliméricos para uso clínico. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos e organismos patogênicos pode ser perigoso.

E os controles necessários devem estar em vigor durante o manuseio e descarte para mitigar os riscos pessoais e ambientais.