Antimicrobiana caracterização de materiais avançados para aplicações de bioengenharia

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de materiais, como propriedades antimicrobianas, que são muito desejáveis para muitas aplicações de bioengenharia. Essa técnica pode ser utilizada como um protocolo consistente em todos os laboratórios para ajudar pesquisadores menos experientes que precisam de procedimentos passo a passo detalhados para obter resultados precisos. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a procurar protocolos antimicrobianos e percebemos que não havia protocolos detalhados sobre isso na literatura.

Neste estudo, quatro materiais avançados com diferentes naturezas químicas e um material controle, serão testados quanto à atividade antimicrobiana. Prepare cada material cortando-o em discos de 10 mm de diâmetro. Em seguida, esterilize cada amostra por imersão em etanol a 70% por 10 minutos, seguido de radiação ultravioleta por uma hora de cada lado.

Três microrganismos diferentes serão usados para testar a atividade antimicrobiana dos materiais avançados. As bactérias gram-positivas, Staphylococcus aureus, as bactérias gram-negativas, Escherichia coli, e a levedura, Candida albicans. Usando um cotonete estéril, ressuspenda algumas colônias de cada microrganismo em 25 mL de caldo de soja tríptico, ou TSB, contido em um tubo de centrífuga estéril.

Vortex por um minuto para obter uma mistura uniforme. Medir a absorvência a 540 nm para cada cultura de microrganismos com um espectrofotómetro. Ajustar a concentração de cada microrganismo a um número adequado de unidades formadoras de colónias, ou UFC por mililitro.

Vortex a suspensão microbiana por cinco segundos para melhorar a dispersão do microrganismo e submerja brevemente um cotonete estéril nesta suspensão microbiana. Remova o excesso de líquido do cotonete pressionando o cotonete contra a parede do tubo que contém a cultura. Listre uniformemente cada suspensão de caldo microbiano com o cotonete estéril na superfície de um ágar de soja tríptico, ou placa TSA, em três planos para cobrir toda a superfície com o microrganismo.

Deixe as placas secarem por cinco minutos após a inoculação. Deixe as suspensões de caldo microbiano na bancada para uso posterior para verificar a concentração e a pureza da suspensão microbiana. Esterilize uma pinça mergulhando-a em um béquer com etanol a 96% e, em seguida, flamejando com um queimador de álcool.

Use a pinça estéril para colocar os discos de amostra a serem testados no centro das placas TSA. Incube as placas TSA em posição invertida a 37 graus Celsius por 24 horas. Para analisar os resultados do teste de difusão, meça o diâmetro da zona de inibição e o diâmetro do disco de amostra com um paquímetro digital ou tirando uma fotografia e usando um software de processamento de imagem adequado.

Este procedimento é necessário para verificar se as concentrações microbianas determinadas anteriormente estão corretas e garantir a ausência de contaminação microbiana ambiental. Usando uma micropipeta com pontas autoclavadas adequadas e condições assépticas, dispense o TSB estéril em tubos de microcentrífuga estéreis. Inclua uma amostra que será utilizada como controle negativo.

Realize seis diluições seriais decimais com as suspensões de caldo microbiano utilizadas anteriormente para estriar as placas TSA. Usando uma espátula Drigalski pré-esterilizada, espalhe 100 l de cada diluição selecionada em uma placa TSA. Espalhar 100 l de meio TSB sem microrganismo numa placa TSA como controlo negativo.

Incube as placas TSA a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, contar o número de colónias para verificar se a UFC por mililitro é semelhante à determinada anteriormente. Verifique a placa de controle negativo para confirmar que não há contaminação ambiental microbiana.

Comece este procedimento cultivando os diferentes microrganismos a serem testados em TSB, em um agitador orbital a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, medir a OD540 de cada cultura durante a noite e, em seguida, diluir cada cultura em 20 mL de TSB em um tubo de centrífuga pré-esterilizado de 50 mL até uma concentração de aproximadamente dez elevado à sexta UFC por mililitro. Coloque quatro discos de cada tipo de material e quatro discos de controle em poços separados de uma placa estéril de 48 poços.

Pipetar 150 l da suspensão microbiana em cada superfície do disco. Incube a placa na incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação da placa de 48 poços durante 24 horas, pipetar 850 l de PBS estéril sobre a superfície de cada um dos quatro discos de recolha de amostras e dos quatro discos de controlo e misturá-los com a suspensão microbiana.

Colete cada mistura de suspensão microbiana PBS e cada disco da placa de 48 poços e transfira para um tubo pré-esterilizado de 15 mL. Vortex as misturas e discos de suspensão microbiana PBS por um minuto. Sonicar a 50 Hz por cinco minutos e vórtice novamente por um minuto para garantir que nenhum microrganismo viável permaneça aderido à superfície do material.

Realizar diluições seriais decimais das culturas sonicadas e tubos de microcentrífuga estéreis contendo TSB. Espalhar 100 l de cada diluição numa placa TSA e incubar as placas aeróbicas a 37 graus Celsius durante 24 horas. Após 24 horas, contar o número de colónias e exprimir esse número em UFC por mililitro.

Os resultados do método de contato são então analisados conforme descrito no protocolo de texto. Os resultados dos testes de difusão em disco de ágar mostram atividade não antimicrobiana para o primeiro material, e aumento da atividade antibacteriana contra S. aureus e E.coli para os outros três materiais. Este gráfico mostra o halo normalizado para cada disco de material contra S. aureus e E.coli após 24 horas de incubação.

Os resultados do método de contato também indicam atividade não antimicrobiana para o primeiro material, e aumento da atividade antibacteriana contra bactérias gram positivas e gram negativas para os outros três materiais. C é a bactéria viável recuperada do disco de controle após 24 horas de incubação. Este gráfico mostra a porcentagem de perda de viabilidade para os quatro materiais contra S. aureus e E.coli nas superfícies dos materiais.

A amostra M1 não exibiu atividade antimicrobiana. Embora não seja mostrado aqui, nenhum dos quatro materiais é capaz de inibir o crescimento da levedura, Candida albicans, por outro método. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a atividade antimicrobiana por esses dois métodos complementares.