Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em Chlamydomonas reinhardtii

O objetivo geral do procedimento é usar robótica e ensaios padronizados para agilizar o isolamento de mutações letais sensíveis à temperatura em Chlamydomonas, a fim de determinar genes e vias essenciais neste organismo. Estamos interessados na conservação e divergência de funções celulares essenciais em eucariotos. E a maneira como gostamos de estudar isso é com mutações que interrompem genes essenciais nesses processos.

Para que isso funcione bem, você precisa de uma coleção realmente abrangente de mutantes e os métodos que você ouvirá são nossa maneira de gerar essa coleção. Estamos trabalhando com a alga verde Chlamydomonas reinhardtii como representante do reino vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que mutações letais sensíveis à temperatura provavelmente podem ser encontradas em todas as vias essenciais.

O método não requer conhecimento prévio ou mutagênese direcionada. Função molecular do gene mutado sugerida imediatamente a partir do fenótipo letal. Isso nos ajuda a selecionar mutações interessantes que interrompem diversas vias de siala além do controle do ciclo celular.

Para realizar a mutagênese UV, cultive células de Chlamydomonas até um OD 750 de 0,2 a 0,5 em 100 mililitros de Tris-acetato-fosfato, ou TAP, sob luz a 25 graus Celsius e agitando a 100 RPM. A mutagênese UV é realizada independentemente em dois fundos genéticos de acordo com o protocolo de texto. Verifique uma amostra de cada cultura ao microscópio para garantir que as células sejam viáveis e sem contaminação.

Em seguida, diluir a cultura para um OD 750 de 0,003 e, em seguida, embrulhar a garrafa com papel alumínio para garantir uma densidade homogênea, pois a cepa é modal e nada direcionalmente em resposta à luz. Depois de ajustar a densidade da suspensão de acordo com o protocolo de texto, conecte um pequeno de tubo que se encaixe em um dispensador de líquido e faça uma série de lavagens para esterilização, de acordo com as instruções do fabricante, para evitar contaminação. Usando um dispensador de líquido de oito seringas, dispense quatro por 96 gotas de dois microlitros cada de cultura em placas retangulares secas.

Bata suavemente na borda da placa para garantir a fusão de todas as gotas em uma fina folha de líquido e cubra imediatamente as placas para evitar a exposição à luz. Quando secas, coloque as placas sob uma lâmpada UV germicida por períodos de tempo determinados empiricamente para dar um rendimento ideal de ts mutantes entre os sobreviventes. Em seguida, transfira as placas para o escuro por oito a 24 horas em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque as placas em uma incubadora de 21 graus Celsius com iluminação. Após aproximadamente 10 dias, quando as colônias são cultivadas, mas não mescladas, carregue as placas na pilha relevante como fontes para a coleta robótica de colônias. Em seguida, escolha colônias para 384 matrizes em placas retangulares e cultive-as a 21 graus Celsius com iluminação por aproximadamente uma semana.

Usando uma réplica do robô de galvanização, condense as 384 matrizes em uma matriz 1536 e permita que as placas cresçam na incubadora de 21 graus Celsius por aproximadamente três dias. Replique as matrizes de 1536 em duas placas cada e coloque uma na incubadora de 21 graus Celsius e a outra em uma incubadora de 33 graus Celsius. Após 24 horas a 33 graus Celsius, replique as placas da incubadora de 33 graus Celsius para um novo conjunto de placas pré-aquecidas e coloque-as na incubadora de 33 graus Celsius.

Após três dias de crescimento a 33 graus Celsius e cinco dias de crescimento a 21 graus Celsius, use uma câmera digital para fotografar uma placa de grade marcada com nove indicadores de alinhamento. Em seguida, fotografe as placas, alternando placas de 21 graus Celsius seguidas pelas placas correspondentes de 33 graus Celsius com todas as placas colocadas em uma moldura fixa para preservar a orientação exata. Processe as imagens emparelhadas de 21, 33 placas com um software de análise de imagem de laboratório fosco personalizado para eliminar o fundo e segmentar as imagens na matriz 1536.

O programa determinará a biomassa detectada como intensidade total de pixels em cada posição. Carregue a lista de colônias selecionadas geradas pelo software como um arquivo de instruções para a robótica de coleta de colônia única. Em seguida, prepare as placas de origem e destino de acordo com as instruções de robótica e permita que o robô escolha as colônias selecionadas para uma matriz.

Coloque as placas-alvo na incubadora de 21 graus Celsius por aproximadamente cinco dias para cultivar uma placa de estoque. Depois de realizar um segundo ensaio de acumulação de biomassa e replicar 100 placas de bloco de acordo com o protocolo de texto, replicar a nova cópia das 100 placas de bloco para três cópias. Após a configuração da terceira placa no robô e a localização das colônias, faça fotomicrografias de uma região de cada ponto das placas de triagem às vezes zero e coloque as placas a 33 graus Celsius para incubação.

Em vários pontos de tempo após a remoção das placas de triagem da incubadora de 33 graus Celsius, faça fotomicrografias rapidamente, certificando-se de que o suporte da placa e o controlador de platina estejam calibrados com precisão para obter imagens das mesmas células em todos os momentos. Analise imagens microscópicas e selecione mutantes com base nos critérios desejados. Localize o conjunto final selecionado em uma placa de ágar 96 dispostas, garantindo que cada placa contenha mutantes do mesmo tipo de acasalamento e resistência a medicamentos.

Transfira grandes quantidades das colônias dispostas para o meio de indução de gametas livres de nitrogênio em microplacas de 96 poços. Incubar as placas sob luz durante cerca de cinco horas para permitir a gametogénese. Suspenda as consultas com os tipos de acoplamento opostos que abrigam os de resistência alternativos em tubos com meio de indução de gametas livres de nitrogênio para gametogênese.

Misturar as amostras de uma placa-alvo num volume de mistura correspondente de 20 microlitros. Após aproximadamente 10 minutos sob a luz, localize cinco microlitros de cada poço duas vezes. Uma vez em uma placa TAP para teste de ligação e uma vez em um TAP mais cinco paro de micromoles mais nove higros de micromol para teste de complementação.

Depois de incubar as placas de teste de complementação, replique as placas em duas cópias para identificação do fenótipo ts. Teste as colônias para o fenótipo ts de acordo com o protocolo de texto. Após a irradiação de células individuais de Chlamydomonas, as células podem crescer por dez dias a uma temperatura permissiva e, em seguida, colhidas em um formato disposto, como visto aqui.

As placas resultantes no formato 384 são mescladas em uma matriz 1536. Três tempos de exposição UV foram testados para gerar mutantes de Chlamydomonas. Empiricamente, o tempo de exposição de 1,5 minuto produziu a maioria dos mutantes ts.

No entanto, de longe, o tempo de exposição de um minuto rendeu a maioria dos candidatos ao ciclo celular. Neste experimento, dois ensaios sequenciais de fenótipo ts foram realizados e cerca de 3000 mutantes ts foram isolados e caracterizados fenotipicamente por microscopia de lapso de tempo. Como visto aqui, para remover genes altamente recorrentes do pipeline downstream, testes de complementação e ligação com genes já caracterizados com mais de dois alelos foram realizados contra candidatos recém-coletados.

Essas colônias não mostram complementação com a consulta e, portanto, são um novo alelo ts para o gene consultado. Estes são geralmente excluídos de uma caracterização posterior. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em alto rendimento.

Milhares de mutantes ts podem ser isolados em apenas duas ou três rodadas de mutagênese. Um passo fundamental após o isolamento dos mutantes ts é selecionar um subconjunto para um estudo mais aprofundado e é muito interessante ver a gama de fenótipos letais. A fenotipagem fornece dicas para a função molecular e também nos ajuda a priorizar mutantes para estudos posteriores.

Lembre-se de que os mutantes podem ter centenas ou milhares de mutações em seus genomas. Normalmente, apenas um é causador, embora às vezes duas mutações sejam necessárias para o fenótipo ts e isso pode ser determinado por análise tetra. Seguindo este procedimento, as mutações causadoras podem ser identificadas por análise de sequenciamento de próxima geração de agrupados Os genes identificados às vezes têm mutações sugerindo função ou podem ser sequências novas e desconhecidas, o que é interessante e emocionante.

Chlamydomonas tem sido um ótimo sistema modelo para estudar biologia celular no reino vegetal. Os procedimentos de que você ouviu falar devem abrir o estudo deste organismo para processos essenciais que foram relativamente não examinados e esperamos que os resultados também sejam relevantes para o reino vegetal mais amplo.