Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em

O objetivo geral do procedimento é utilizar robótica e ensaios padronizados para agilizar o isolamento de mutações letais sensíveis à temperatura em Chlamydomonas, com o fim de determinar os genes e vias essenciais nesse organismo. Estamos interessados tanto na conservação quanto na divergência de funções celulares essenciais em eucariotos. E a forma como gostamos de estudar isso é por meio de mutações que interrompem genes essenciais nesses processos.

Para que isso funcione bem, é necessário um conjunto realmente abrangente de mutantes, e os métodos sobre os quais você ouvirá são a nossa maneira de gerar tal conjunto. Estamos trabalhando com a alga verde Chlamydomonas reinhardtii como representante do reino vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que mutações letais sensíveis à temperatura provavelmente podem ser encontradas em todas as vias essenciais.

O método não requer conhecimento prévio nem mutagênese direcionada. A função molecular do gene mutado é sugerida imediatamente a partir do fenótipo letal. Isso nos ajuda a selecionar mutações interessantes que interrompem diversas vias de siala além do controle do ciclo celular.

Para realizar a mutagênese por UV, cultive células de Chlamydomonas até uma OD 750 de 0,2 a 0,5 em 100 mililitros de Tris-Acetato-Fosfato, ou TAP, sob luz a 25 graus Celsius e agitação a 100 RPM. A mutagênese por UV é realizada independentemente em dois contextos genéticos conforme descrito no protocolo. Verifique uma amostra de cada cultura ao microscópio para garantir que as células estejam viáveis e sem contaminação.

A seguir, dilua a cultura até uma DO 750 de 0,003 e envolva o frasco com papel alumínio para garantir uma densidade homogênea, já que a linhagem é móvel e nada direcionalmente em resposta à luz. Após ajustar a densidade da suspensão conforme o protocolo descrito no texto, acople um pequeno cassete de tubo compatível com um dispensador de líquidos e realize uma série de lavagens para esterilização, de acordo com as instruções do fabricante, a fim de prevenir contaminação. Utilizando um cassete dispensador de líquidos com oito seringas, distribua quatro vezes 96 gotas de dois microlitros cada de cultura em placas retangulares secas.

Toque suavemente na borda da placa para garantir a fusão de todas as gotas em uma fina camada de líquido e cubra imediatamente as placas para evitar a exposição à luz. Quando secas, coloque as placas sob uma lâmpada germicida de UV por períodos de tempo determinados empiricamente para obter um rendimento ótimo de mutantes ts entre os sobreviventes. Em seguida, transfira as placas para o escuro por oito a 24 horas à temperatura ambiente.

Em seguida, coloque as placas em uma incubadora a 21 °C com iluminação. Após aproximadamente 10 dias, quando as colônias estiverem desenvolvidas mas ainda não fundidas, carregue as placas na pilha correspondente como fontes para a seleção robótica de colônias. Em seguida, selecione colônias para matrizes 384 em placas retangulares e cultive-as a 21 °C com iluminação por aproximadamente uma semana.

Usando um robô para repicagem em réplica, concentre as matrizes 384 em uma matriz 1536 e deixe as placas crescerem no incubador a 21 °C por aproximadamente três dias. Repique as matrizes 1536 para duas placas cada e coloque uma delas no incubador a 21 °C e a outra em um incubador a 33 °C. Após 24 horas a 33 °C, repique as placas do incubador a 33 °C para um novo conjunto de placas pré-aquecidas e coloque-as no incubador a 33 °C.

Após três dias de crescimento a 33 graus Celsius e cinco dias de crescimento a 21 graus Celsius, utilize uma câmera digital para fotografar uma placa de grade marcada com nove indicadores de alinhamento. Em seguida, fotografe as placas, alternando placas de 21 graus Celsius seguidas pelas placas correspondentes de 33 graus Celsius, posicionando todas as placas em um suporte fixo para manter a orientação exata. Processe as imagens pareadas das placas de 21 e 33 graus Celsius com um software personalizado de análise de imagens em laboratório para eliminar o fundo e segmentar as imagens em uma matriz de 1536.

O programa determinará a biomassa detectada como intensidade total de pixels em cada posição. Carregue a lista de colônias selecionadas gerada pelo software como um arquivo de instruções para o robô de seleção individual de colônias. Em seguida, prepare as placas de origem e destino de acordo com as instruções do robô e permita que o robô selecione as colônias indicadas para uma matriz.

Coloque as placas-alvo no incubador a 21 graus Celsius por aproximadamente cinco dias para obter uma placa estoque. Após realizar um segundo ensaio de acúmulo de biomassa e replicar 100 placas de blocos de acordo com o protocolo descrito no texto, replique a versão fresca das 100 placas de blocos em três cópias. Após a preparação da terceira placa no robô e a deposição das colônias, tire fotomicrografias de uma região de cada ponto das placas de triagem nos tempos zero e coloque as placas a 33 graus Celsius para incubação.

Em diferentes momentos após a remoção das placas de triagem do incubador a 33 graus Celsius, capture rapidamente fotomicrografias, certificando-se de que o suporte da placa e o controlador de estágio estejam precisamente calibrados para obter imagens das mesmas células em cada ponto temporal. Analise as imagens microscópicas e selecione os mutantes com base nos critérios desejados. Inocule o conjunto final selecionado em uma placa de ágar com arranjo de 96 poços, garantindo que cada placa contenha mutantes do mesmo tipo de acasalamento e resistência ao fármaco.

Transfira grandes quantidades das colônias distribuídas em matriz para meio de indução de gametas livre de nitrogênio em microplacas de 96 poços. Incube as placas sob luz por aproximadamente cinco horas para permitir a gametogênese. Suspenda as cepas com tipos de acasalamento opostos que contêm os cassetes de resistência alternativos em tubos com meio de indução de gametas livre de nitrogênio para gametogênese.

Misture as amostras de uma placa alvo em um volume de 20 microlitros de meio de cruzamento. Após cerca de 10 minutos sob luz, plaque cinco microlitros de cada poço duas vezes: uma vez em uma placa TAP para teste de ligação e outra vez em uma placa TAP mais cinco micromoles de paro mais nove micromoles de hygro para teste de complementação.

Após a incubação das placas para o teste de complementação, replique as placas em duas cópias para a identificação do fenótipo ts. Teste as colônias quanto ao fenótipo ts de acordo com o protocolo descrito no texto. Após a irradiação de células isoladas de Chlamydomonas, as células são deixadas crescer por dez dias em temperatura permissiva e, em seguida, coletadas em formato ordenado, como mostrado aqui.

As placas resultantes no formato 384 são combinadas em uma matriz de 1536. Três tempos de exposição à UV foram testados para gerar mutantes ts de Chlamydomonas. Empiricamente, o tempo de exposição de 1,5 minuto produziu o maior número de mutantes ts.

No entanto, de longe, o tempo de exposição de um minuto gerou a maioria dos candidatos ao ciclo celular. Neste experimento, dois ensaios fenotípicos de ts sequenciais foram realizados e cerca de 3000 mutantes de ts foram isolados e caracterizados fenotipicamente por microscopia com lapso de tempo. Como visto aqui, para remover genes altamente recorrentes do fluxo de trabalho posterior, testes de complementação e ligação com genes já caracterizados que possuem mais de dois alelos foram realizados contra os novos candidatos coletados.

Essas colônias não apresentam complementação com a estirpe teste e, portanto, representam novos alelos ts para o gene analisado. Geralmente, essas são excluídas da caracterização posterior. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em alto rendimento.

Milhares de mutantes ts podem ser isolados em apenas duas ou três rodadas de mutagênese. Um passo fundamental após o isolamento dos mutantes ts é selecionar um subconjunto para estudo posterior, sendo muito interessante observar a variedade de fenótipos letais. A fenotipagem fornece pistas sobre a função molecular e também nos ajuda a priorizar mutantes para estudos adicionais.

Leve em consideração que os mutantes podem apresentar centenas ou milhares de mutações em seus genomas. Geralmente, apenas uma é causativa, embora às vezes sejam necessárias duas mutações para o fenótipo ts, o que pode ser determinado pela análise tetrad. Após este procedimento, as mutações causativas podem ser identificadas por meio de análise de sequenciamento de nova geração de The genes identificados às vezes terão mutações que sugerem função, ou podem ser sequências novas e desconhecidas, o que é interessante e empolgante.

Chlamydomonas tem sido um excelente sistema modelo para o estudo da biologia celular no reino vegetal. Os procedimentos que você ouviu devem viabilizar o estudo deste organismo em processos essenciais que foram relativamente pouco examinados, e esperamos que os resultados também sejam relevantes para o reino vegetal em geral.