A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver um método para triagem rápida e automatizada de alto rendimento de protoplastos vegetais, especificamente para abordar o gargalo atual na triagem precoce de um grande número de alvos de edição de genoma e silenciamento de genes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biotecnologia vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a produção e transformação automatizada de protoplastos de alto rendimento para triagem paralela rápida da função do promotor na expressão gênica.

Este procedimento será demonstrado usando a cultura de suspensão amarela brilhante de tabaco amplamente utilizada, ou BY-2. Comece cultivando uma cultura BY-2 em um frasco Erlenmeyer, conforme descrito no texto do protocolo. No dia do isolamento do protoplasto, misture bem a cultura, pois as células se assentarão rapidamente e transfira seis mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de fundo cônico de 15 mililitros.

Deixe as células assentarem por pelo menos 10 minutos. Ajuste o volume da célula compactada para 50% do volume total, removendo o volume apropriado de sobrenadante. Agite o tubo invertendo-o e, em seguida, use pipetas de diâmetro largo para pipetar 500 microlitros de suspensão celular em cada poço de uma placa de seis poços para digestão.

O primeiro passo neste procedimento é ligar todos os componentes do sistema robótico, que são o movimentador de microplacas, o manipulador de líquidos, o leitor de placas multimodo, o dispensador multimodo, o aquecedor ou resfriador de placas e os computadores. Em seguida, abra o software de agendamento de tarefas do movimentador de chapas que integra o movimentador de microchapas com os demais equipamentos para permitir a transferência de chapas entre cada equipamento. No software do motor de placas, defina as especificações técnicas para o material de laboratório usado no protocolo.

Clique em Configuração na barra de ferramentas principal e selecione o comando Gerenciar tipos de contêiner. Selecione o Tipo de Contêiner apropriado na lista de Tipos de Contêiner existentes. Defina as especificações técnicas para todos os materiais de laboratório que o motor de placas encontrará.

A próxima etapa é definir as posições inicial e final para cada contêiner. Clique na guia Início/Fim em um protocolo específico. Selecione a posição inicial de cada recipiente e marque a caixa para Lidded, Unlidded nas posições Start e End.

Depois de definir as posições inicial e final para cada peça de material de laboratório, carregue manualmente todas as placas na posição inicial de todo o fluxo de trabalho. Carregue as placas de triagem fluorescente de 96 poços no hotel dois, as placas de seis poços com células BY-2 no hotel três, uma placa de poço de 96 poços de profundidade que será usada para transformação no ninho dois do aquecedor de placas ou resfriador e um tubo cônico de 50 mililitros contendo a solução enzimática no dispensador multimodo. Para realizar a transformação no protocolo, pré-carregue cada poço da placa de poço de 96 profundidades com 10 microlitros de DNA plasmático contendo a construção repórter de proteína fluorescente laranja e incube no aquecedor de placa ou resfriador a quatro graus Celsius.

Carregue todos os suprimentos e placas na plataforma automatizada de manuseio de líquidos nos locais designados. Carregue uma placa de 96 poços pré-carregada com 200 microlitros de uma solução de polietilenoglicol a 40% por poço na coluna um. Coloque uma caixa de pontas de pipeta no ninho oito.

Para definir a localização de cada item no software de plataformas automatizadas de manuseio de líquidos, selecione Ferramentas no menu e clique em Editor de material de laboratório. Selecione o tipo de material de laboratório no menu suspenso. Selecione a guia Protocolo principal e clique em Configurar material de laboratório para definir a posição de cada peça de laboratório.

Clique em Executar para inicializar todos os dispositivos que serão usados no protocolo. Por fim, na janela Gerenciador de Trabalho, clique em Adicionar Unidade de Trabalho para verificar todos os materiais de laboratório no sistema e iniciar o protocolo automatizado. A parte mais sensível do procedimento é a transformação do protoplasto.

Como a transformação é realizada pelo sistema robótico, é fundamental que os protocolos automatizados sejam configurados corretamente. Para os fins deste vídeo, apenas as etapas selecionadas nos protocolos automatizados serão mostradas. Durante o protocolo de transformação, a plataforma automatizada de manuseio de líquidos aspira 70 microlitros da solução de protoplastos da placa de seis poços e a dispensa na placa de 96 poços de profundidade no ninho seis.

Em seguida, novas ponteiras de pipeta são usadas para aspirar lentamente 70 microlitros da solução de polietilenoglicol altamente viscosa da placa de poço profundo pré-carregada e dispensar completamente a solução nos poços aplicáveis da placa de poço profundo. Em seguida, a plataforma automatizada de manuseio de líquidos move a placa de poço profundo dos próximos seis para o ninho nove, onde o motor de placa pega a placa e a move para a estação agitadora de placas e a agita a 1500 RPM por 30 segundos. Após uma incubação de 20 minutos sem agitação para permitir o equilíbrio dos protoplastos, o motor da placa move a placa de poço de 96 profundidades para o dispensador multimodo e aciona o protocolo de lavagem.

Quando o protocolo automatizado de isolamento e transformação de protoplastos estiver concluído, remova a placa com os protoplastos transformados do hotel um do sistema robótico. Ligue o microscópio invertido, a câmera e a lâmpada fluorescente. Selecione a objetiva 10X para foco inicial nos protoplastos.

Ligue a lâmpada halógena e feche o obturador da lâmpada fluorescente. Carregue a placa no sistema de microscópio e concentre-se nos protoplastos usando campo claro. Em seguida, desligue a lâmpada halógena e abra o obturador da lâmpada fluorescente.

Selecione o conjunto de filtros Cy3/TRITC para visualização da proteína fluorescente laranja expressa pelos protoplastos transgênicos. Examine cada poço para determinar o número de protoplastos que expressam o marcador fluorescente. A digestão enzimática de protoplastos nas condições especificadas neste protocolo resultou em 2.820.000 protoplastos por placa de seis poços.

A perda na concentração de protoplastos após cada etapa de transferência no protocolo foi avaliada. Após o protocolo de digestão, 11.500 protoplastos foram transferidos para cada poço das placas de 96 poços de profundidade. Uma vez concluído o protocolo de transformação, 1.230 protoplastos foram transferidos para a placa de triagem fluorescente de 96 poços.

Para garantir que os múltiplos estágios de pipetagem não danificassem os protoplastos, sua viabilidade foi testada por coloração com iodeto de propídio. Os resultados não mostraram diferença significativa na viabilidade após a digestão, após a transferência para a placa de triagem fluorescente de 96 poços e após o protocolo de transformação. O protocolo de transformação foi bem sucedido na geração de células transgênicas que expressam a proteína fluorescente laranja, embora a eficiência de transformação tenha sido baixa, apenas cerca de 2%Isso se deve ao grande plasmático binário utilizado e ao protocolo não ter sido otimizado especificamente para protoplastos BY-2.

As métricas obtidas para o curso de tempo do protocolo mostraram que o maior investimento de tempo é gasto durante a etapa de digestão. A duração completa do isolamento e transformação do protoplasto foi de três horas, 50 minutos e 53 segundos, sem necessidade de entrada externa do operador. Uma vez configurada corretamente, essa técnica pode ser executada pelo robô em menos de quatro horas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica está abrindo caminho para que pesquisadores no campo da biotecnologia vegetal realizem procedimentos genômicos de culturas de alto rendimento, como edição de genoma e triagem de promotores.