A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver um método para triagem rápida e automatizada em alto rendimento de protoplastos vegetais, especificamente para abordar o gargalo atual na triagem inicial de um grande número de alvos de edição genômica e silenciamento gênico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biotecnologia vegetal. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a produção e transformação automatizadas de protoplastos em alto rendimento, para triagem paralela rápida da função de promotores na expressão gênica.

Este procedimento será demonstrado utilizando o amplamente utilizado tabaco bright yellow two, ou cultura em suspensão BY-2. Comece cultivando uma cultura BY-2 em um frasco Erlenmeyer, conforme descrito no texto do protocolo. No dia do isolamento de protoplastos, misture bem a cultura, pois as células se sedimentam rapidamente, e transfira seis mililitros da cultura para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros.

Deixe as células sedimentarem por pelo menos 10 minutos. Ajuste o volume celular empacotado para 50% do volume total removendo o volume apropriado do sobrenadante. Agite o tubo invertendo-o e, em seguida, use pipetas de grande diâmetro para transferir 500 microlitros da suspensão celular para cada poço de uma placa de seis poços para digestão.

O primeiro passo neste procedimento é ligar todos os componentes do sistema robótico, que são o transportador de microplacas, o manipulador de líquidos, o leitor de placas multimo, o dispensador multimo, o aquecedor ou resfriador de placas e os computadores. Em seguida, abra o software de agendamento de tarefas do transportador de placas, que integra o microtransportador com os demais equipamentos, permitindo a transferência de placas entre cada um deles. No software do transportador de placas, defina as especificações técnicas das vidrarias utilizadas no protocolo.

Clique em Configuração na barra de ferramentas principal e selecione o comando Gerenciar Tipos de Recipiente. Selecione o Tipo de Recipiente apropriado na lista de Tipos de Recipiente existentes. Defina as especificações técnicas para todo o material de laboratório que o transferidor de placas encontrará.

O próximo passo é definir as posições Inicial e Final para cada recipiente. Clique na aba Início/Fim em um protocolo específico. Selecione a posição Inicial de cada recipiente e marque a caixa para Com tampa, Sem tampa nas posições Inicial e Final.

Após definir as posições inicial e final para cada peça de material de laboratório, carregue manualmente todas as placas na posição inicial para todo o fluxo de trabalho. Carregue as placas de triagem fluorescente de 96 poços no hotel dois, as placas de seis poços com células BY-2 no hotel três, uma placa de fundo profundo de 96 poços que será usada para transformação no segundo encaixe do aquecedor ou resfriador de placas, e um tubo cônico de 50 mililitros contendo a solução enzimática no dispensador multímodo. Para realizar a transformação no protocolo, pré-carregue cada poço da placa de fundo profundo de 96 poços com 10 microlitros de DNA plasmidial contendo a construção do vetor repórter de proteína fluorescente laranja e incube no aquecedor ou resfriador de placas a quatro graus Celsius.

Carregue todos os suprimentos e placas na plataforma automatizada de manipulação de líquidos nos locais designados. Carregue uma placa de 96 poços pré-carregada com 200 microlitros de uma solução de polietilenoglicol a 40% por poço na coluna um. Carregue uma caixa de ponteiras de pipeta no ninho oito.

Para definir a localização de cada item no software das plataformas automatizadas de manipulação líquida, selecione Ferramentas no menu e clique em Editor de Material de Laboratório. Selecione o tipo de material de laboratório no menu suspenso. Selecione a aba Protocolo Principal e clique em Configurar Material de Laboratório para definir a posição de cada peça de material de laboratório.

Clique em Executar para inicializar todos os dispositivos que serão utilizados no protocolo. Por fim, na janela do Explorador de Trabalho, clique em Adicionar Unidade de Trabalho para verificar toda a vidraria no sistema e iniciar o protocolo automatizado. A parte mais sensível do procedimento é a transformação de protoplastos.

Como a transformação é realizada pelo sistema robótico, é fundamental que os protocolos automatizados sejam configurados corretamente. Para fins deste vídeo, apenas algumas etapas selecionadas dos protocolos automatizados serão mostradas. Durante o protocolo de transformação, a plataforma automatizada de manipulação de líquidos aspira 70 microlitros da solução de protoplastos da placa de seis poços e os dispensa na placa de 96 poços profundos no compartimento seis.

Em seguida, são utilizadas ponteiras de pipeta novas para aspirar lentamente 70 microlitros da solução altamente viscosa de polietileno glicol a partir da placa de poços profundos pré-carregada e dispensar completamente a solução nos poços apropriados da placa de poços profundos. A seguir, a plataforma automatizada de manipulação de líquidos move a placa de poços profundos do encaixe seis para o encaixe nove, onde o transportador de placas pega a placa e a leva até a estação de agitação, agitando-a a 1500 RPM por 30 segundos. Após uma incubação de 20 minutos sem agitação para permitir a equilibração dos protoplastos, o transportador de placas move a placa de 96 poços profundos para o dispensador multifuncional e aciona o protocolo de lavagem.

Quando o protocolo automatizado de isolamento e transformação de protoplastos for concluído, remova a placa com os protoplastos transformados do hotel um do sistema robótico. Ligue o microscópio invertido, a câmera e a lâmpada fluorescente. Selecione a objetiva de 10X para o foco inicial nos protoplastos.

Ligue a lâmpada de halogênio e feche o obturador da lâmpada fluorescente. Coloque a placa no sistema de microscópio e foque nos protoplastos utilizando campo claro. Em seguida, desligue a lâmpada de halogênio e abra o obturador da lâmpada fluorescente.

Selecione o conjunto de filtros Cy3/TRITC para a visualização da proteína fluorescente laranja expressa pelos protoplastos transgênicos. Analise cada poço para determinar o número de protoplastos que expressam o marcador fluorescente. A digestão enzimática dos protoplastos nas condições especificadas neste protocolo resultou em 2.820.000 protoplastos por placa de seis poços.

A perda na concentração de protoplastos após cada etapa de transferência no protocolo foi avaliada. Após o protocolo de digestão, 11.500 protoplastos foram transferidos para cada poço das placas de 96 poços profundos. Após a conclusão do protocolo de transformação, 1.230 protoplastos foram transferidos para a placa de triagem fluorescente de 96 poços.

Para garantir que múltiplas etapas de pipetagem não danificassem os protoplastos, sua viabilidade foi avaliada por meio de coloração com iodeto de propídio. Os resultados mostraram nenhuma diferença significativa na viabilidade após a digestão, após a transferência para a placa de triagem fluorescente de 96 poços e após o protocolo de transformação. O protocolo de transformação foi bem-sucedido na geração de células transgênicas que expressam proteína fluorescente laranja, embora a eficiência de transformação tenha sido baixa, cerca de 2%. Isso se deve ao grande plasmídeo binário utilizado e ao fato de o protocolo não ter sido otimizado especificamente para protoplastos BY-2.

As métricas obtidas para o curso temporal do protocolo mostraram que o maior investimento de tempo é gasto durante a etapa de Digestão. A duração completa do isolamento e transformação de protoplastos foi de três horas, 50 minutos e 53 segundos, sem necessidade de intervenção externa do operador. Uma vez configurado corretamente, esta técnica pode ser realizada pelo robô em menos de quatro horas.

Após seu desenvolvimento, esta técnica está abrindo caminho para pesquisadores na área de biotecnologia vegetal realizarem procedimentos genômicos em culturas de alto rendimento, como edição do genoma e triagem de promotores.