Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

O objetivo geral deste sistema repórter recombinante do HBV é facilitar a realização de triagem em massa para o vírus anti-hepatite B ou agentes do HBV. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do HBV, como triagem de agentes anti-HBV e identificação de fatores do HBV. A principal vantagem dessa técnica é que o sistema repórter do HBV pode monitorar os estágios iniciais do ciclo de replicação do HBV.

Após a preparação do meio de cultura celular, no dia anterior à transvecção, colocar quatro vezes 10 às seis células HepG2 em meio, em uma placa revestida de colágeno de 10 cm. Incube as células a 37 graus C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2. Usando um agente transveccionário de acordo com as instruções do fabricante, transvecte as células com 5 mcg de pUC1 2HBV delta épsilon e 5 mcg de pUC1 2HBV/NL.

No dia seguinte, remova o meio de cultura e adicione 10 mL de meio de cultura fresco. Em seguida, uma semana após a transvecção, transferir o meio de cultura contendo o HBV recombinante para um tubo de 50 mL. Em seguida, adicione 10 mL de meio de cultura fresco à placa contendo células transvectas.

Em seguida, recolher e centrifugar o meio de cultura a 2.300 x g durante cinco minutos para remover os restos celulares que contêm o VHB recombinante. Passar o sobrenadante através de um filtro de membrana de 45 mcm. Em seguida, adicione um volume igual de 25% PEG, 1,5 molar NaCl, ao filtrado e misture delicadamente.

Incubar a amostra durante a noite a quatro graus C. No dia seguinte, centrifugar a solução a 2,300 x g e quatro graus C, durante 20 minutos. Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 5 mL de tampão TNE. Agora centrifugue a amostra novamente para remover os detritos celulares e, em seguida, carregue 5 mL do HBV recombinante contendo TNE em 8 mL de sacarose a 20% em TNE.

Centrifugue os dois a 100.000 x g e 15 graus Celsius por três horas. Descarte o máximo possível do sobrenadante e use 1 mL de DMEM sem soro por 40 mL de cultura inicial para ressuspender o pellet. Incube a suspensão a quatro graus Celsius durante a noite.

Na manhã seguinte, filtrar a suspensão através de um filtro de 45 mcm. Em seguida, prepare alíquotas de 5 mL e armazene os tubos a menos 80 graus Celsius. Células HepG2 em placa, expressando de forma estável o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, ou NTCP, que são suscetíveis à infecção por HBV e incubam a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Um dia antes da infecção, coloque aproximadamente cinco vezes 10 elevado às quartas células HepG2 NTCP nos poços de uma placa revestida de colágeno de 96 poços, em 1 mL de meio de cultura. Descongele o HBV recombinante em banho-maria a 37 graus Celsius, até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco. Prepare o meio para infecção combinando 78 mcL de meio de cultura fresco, 2 mcL de DMSO, 10 mcL de 40% PEG 8000, em 1x PBS e 10 mcL de HPV recombinante.

Adicione 100 mcL de solução recombinante de HBV a cada poço de uma placa de 96 poços. Um dia após a infecção, use 300 mcL de PBS para lavar a célula três vezes para remover a proteína repórter contaminante da fração do vírus. Adicione 200 mcL de meio de cultura, contendo 2% de DMSO, às células infectadas e incube por uma semana ou menos.

Para realizar a análise da infecção pelo HBV, uma semana após a infecção, use PBS para lavar as células infectadas três vezes. Adicione 50 mcL de tampão de lise às células infectadas. Agitar a placa de cultura durante cinco minutos e depois centrifugar a 2 000 x g durante cinco minutos.

Adicione 50 mcL do substrato repórter a uma placa Luminometer. Em seguida, adicione 20 mcL do lisado celular à placa e misture agitando brevemente. Por fim, coloque a placa no Luminômetro e inicie a leitura.

Este gel mostra a digestão do plasmídeo repórter pUC1 2HBVNL construído e do plasmídeo auxiliar delta pUC1 2HBV com HindII e EcoRI. Ambas as amostras produzem os tamanhos de banda esperados. Neste western blot, lisados de células HepG2, ou células HepG2 expressando NTCP marcado com myc recombinante e infectadas com HBV recombinante, foram sondados com um anticorpo anti-myc que reconhece as proteínas recombinantes não glicosiladas de 34 kDa e as proteínas recombinantes glicosoladas de 65 kDa.

Os gráficos mostrados aqui ilustram a cinética do gene repórter. Níveis de RNA e DNA em HepG2 NTCP myc-clone 22 recombinante infectado por HBV ou células hepatócitos primárias humanas. Os níveis de RNA do HBV na atividade repórter foram elevados três dias após a infecção, tanto nas células infectadas quanto nos hepatócitos primários.

Em contraste, não houve alteração nos níveis de DNA nove dias após a infecção, porque o HBV recombinante é deficiente para núcleo e pólo funcionais, que desempenham papéis importantes na via de replicação do DNA intracelular. Nesta figura, a inibição do HBV recombinante pela imunoglobulina da hepatite B, ou HBIG, heparina e IFN-beta, é ilustrada. HBIG e heparina suprimiram fortemente a atividade repórter para menos de 10% a 75 U / mL e 150 U / mL, respectivamente.

O IFN-beta, por outro lado, suprimiu a atividade do repórter para menos de 50% a 1000 U / mL. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana para preparação do HBV recombinante, em seis dias para infecção do HBV recombinante e, em resumo, meios para medição da proteína repórter, se for realizada adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a etapa de lavagem que remove a proteína repórter contaminante da fração de polarização.

Após este procedimento, outros resultados, como infecção por HBV amplo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais de que o HBV recombinante não produziu os primeiros resultados positivos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de HBV explorarem o desenvolvimento de um agente anti-HBV em um modelo de cultura de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar e infectar células com HBV recombinante.

Não se esqueça de que trabalhar com HBV recombinante pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.