Name: Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a medir forças de adesão entre aminoácidos ou peptídeos e superfícies inorgânicas usando espectroscopia de força de molécula única com microscopia de força atômica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. agradece o apoio do Conselho de Israel para o Ensino Superior.

1. Sugestão Modificação <ol><li> Compra de nitreto de silício (Si 3 N 4) cantilevers de AFM com pontas de silício (raio cantilever nominal de ~ 2 nm). </li><li> Limpar cada cantilever AFM por imersão em etanol anidro durante 20 min. Seca-se à temperatura ambiente. Em seguida, tratar as consolas por expondo-os a O2 do plasma durante 5 min. </li><li> Suspender as pontas limpas acima (3 cm) contendo uma solução metiltrietoxisilano e 3- (aminopropil) silano em uma proporção de 15: 1 (v / v) em um exsicador sob uma atmosfera inerte (azoto ou árgon) e ligar o exsicador até uma bomba de vácuo. Vácuo durante 2 horas para formar uma monocamada destes dois tipos de compostos de silano misturadas. </li><li> Use um suporte de ponta metálica (fabricada para este processo) para colocar as dicas em uma placa quente. Em seguida, secar as pontas durante 10 minutos a 70 ° C sob condições atmosféricas. Antes do uso, limpe a placa quente, titular metálico e pinças usando etanol. </li><li> Arrefecer as dicas no quarto temperatura, e depois mergulhar as pontas em uma solução de Fluorenilmetiloxicarbonilo-PEG-N-hidroxi-succinimida (Fmoc-PEG-NHS, PM 5000 Da) a uma concentração de 5 mM em clorofórmio contendo 0,5% (v / v) de trietilamina durante 1 h a temperatura do quarto. </li><li> Mergulhe as pontas em clorofórmio durante 5 minutos e, em seguida, mergulhá-lo em dimetilformamida (DMF) durante mais 5 minutos. A fim de desproteger o grupo Fmoc de as moléculas de PEG ligadas, mergulhar as pontas em piperidina a 20% (v / v) em DMF durante 30 min. Mergulhar as pontas em DMF, durante 4 minutos e, em seguida, em N-metil-2-pirrolidona (NMP) para adicional de 4 minutos. Repita o sequencial mergulhar três vezes. </li><li> Para o acoplamento de aminoácidos, imergir as pontas em uma solução contendo N-terminal de amino ácido protegido (AA) / di-isopropiletilamina (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluophosphate (HBTU), numa proporção molar de 1: 1: 1 com uma concentração total de 30 mM em 5 mL de NMP durante 1,5 h. </li><li> Para o acoplamento de péptidos, mergulhe as pontas em uma solução cont 5 mLaining 40 mg do péptido protegido (terminal N e cadeias laterais, por exemplo, Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg de 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurio hexafluorofosfato (HBTU), e 5 ml de DIPEA em NMP durante 2 h. </li><li> Mergulhe as pontas em NMP durante 4 min. Em seguida, para proteger a mandrilagem livre / não reagido NH2 pelo grupo acetilo, mergulhar as pontas durante 30 min numa mistura de anidrido acético / DIPEA a uma razão molar de 4: 1 e uma concentração total de 0,65 M em NMP. </li><li> Para o acoplamento de péptido, realizar duas etapas adicionais. <ol><li> A fim de desproteger as cadeias laterais do péptido, imergir as pontas em uma solução contendo 95% de TFA, 2,5% de tri-isopropilsilano e 2,5% de água durante 1 h, e, em seguida, lava-se com clorofórmio e DMF. </li><li> De modo a remover o grupo Fmoc do péptido, imergir as pontas em piperidina a 20% (v / v) em DMF durante 30 min. </li></ol></li><li> Sequencialmente mergulhar o péptido / amino ácido-funcionalizard dicas para quatro minutos cada em DMF (para péptidos) ou NMP (para os aminoácidos), clorofórmio, 50% de etanol e água. Por fim, seque a ponta no ar. </li></ol> 2. Preparação de Superfície <ol><li> Prepare mica. Clivar os substratos (9,9 mm de diâmetro) antes de cada utilização, usando fita adesiva. Em seguida, lavar as superfícies com água destilada tripla (TPB). </li><li> Prepare TiO 2 -Revestido silício. <ol><li> Cortar o wafer de silício (100) em 2 cm quadrados usando uma caneta de diamante. </li><li> Colocar o substrato num tubo de ensaio de 15 ml cheio com acetona e sonicar durante cinco minutos num banho de ultra-sons. Em seguida, colocar esta superfície de um tubo de ensaio de 15 ml cheio com isopropanol e sonicar durante 5 minutos. Secar o substrato utilizando nitrogênio. </li><li> Dissolve-se o agente tensioactivo (por exemplo, BYK-348) em etanol para preparar uma solução a 5% (peso / volume). Em seguida, adicionar 0,02 ml da solução de agente tensioactivo a uma dispersão de 2 2 ml de 30% de TiO. </li><li> A partir da solução resultante, gota-cast 0.2 mL em um substrato de Si limpa. </li><li> Recozer estas superfícies fundidas-gota a 250 ° C durante 2 h em ar. 41 </li></ol></li></ol> 3. única molécula de medidas de força Espectroscopia <ol><li> Anexar a superfície desejada a um suporte metálico de AFM com cola de dois componentes comercialmente disponíveis. Colocar o suporte da metálico no suporte do copo da AFM, que tem a forma de uma pequena placa de Petri. Preencha este suporte com tampão Tris (pH 50 mM = 7,4) ou qualquer meio desejado. Em seguida, coloque o titular no palco AFM baixo do suporte da ponta. </li><li> Calibrar os braços de suporte de AFM com constantes de mola que variam de 10 a 30 pN / nm, utilizando o método de flutuação térmica 26 (incluído no software AFM) com uma incerteza absoluta de cerca de 10%. </li><li> Medir a força da interacção por se aproximar do aminoácido ou ponta funcionalizada-péptido para o substrato até que esteja em contacto com o substrato com uma compressãoforça de ~ 200 pN e, em seguida, imediatamente retrair a ponta a várias velocidades, de 0,1 a 0,8 ^ m / s, para uma distância de ~ 200 nm. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Converter os valores de deformação (V) para forçar multiplicando a sensibilidade fotodíodo (V / m) e utilizando a constante da mola determinado experimentalmente. 42 Isto é feito automaticamente pelo software AFM. <ol><li> Para obter curvas FD com um eventos única molécula, ficha várias centenas de curvas (800-1,500). Obter dois picos numa curva de uma única molécula de: o primeiro pico indica interacções não específicas entre a ponta e a superfície e o segundo corresponde ao pico da interacção específica da molécula com a superfície. Quando, a curva FD conter mais do que estes dois picos, descartá-las a partir do cálculo da força mais provável. NOTA: Apenas eventos de adesão individuais são tidas em conta (de 10 a 30% das curvas). 43 </li></ol></li><li&gt; Para calcular a taxa de carregamento aparente, ajuste de pelo menos 50 força vs. curvas distância com a corrente sem-fim-like (WLC) modelo 44 pouco antes da ruptura para obter um conjunto de taxas de carregamento, que são então utilizados para a preparação de histogramas as taxas de carga aparente. Derivar as forças unbinding entre os péptidos ácidos aminados e / superfície do salto em força depois da separação do raio de acção do substrato. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos 1.3, 1.4 e 1.7 no protocolo deve ser realizado com cuidado extenso e de uma forma muito suave. No passo 1.3, a ponta não deve estar em contacto com a mistura de silano e o processo de silanização deve ser realizada numa atmosfera inerte (de humidade livre). 45 Isto é feito a fim de evitar a formação de camadas múltiplas e porque as moléculas de silano prontamente sofrer hidrólise na presença de humidade. 45 No passo 1.4, a temperatura...

A interacção entre as proteínas e minerais inorgânicos conduz à construção de materiais compósitos com propriedades distintivas. Isto inclui materiais com elevada resistência mecânica ou as propriedades ópticas únicas. 1, 2, por exemplo, a combinação da proteína de colagénio com a hidroxiapatite mineral, quer gera ossos moles ou duras para diferentes funcionalidades. 3 péptidos curtos, também podem ligar-se materiais inorgânicos com alta especificidade. 4, 5, 6 A especificidade destes péptidos foi usado para a criação de novos materiais magnéticos e electrónicos, 7, 8, 9 fabricar materiais nanoestruturados, crescimento de cristais, 10 e sintetizar nanopartículas. 11 Para entender o mecanismo subjacente interações entre peptídeos ou proteínas e materiais inorgânicos, portanto, nos permitem projetar novos materiais compósitos com melhores propriedades de adsorção. Além disso, uma vez que a interfase de implantes com uma resposta imunitária é mediada por proteínas, uma melhor compreensão das interacções de proteínas com materiais inorgânicos vai melhorar a nossa capacidade para conceber implantes. Outra área importante, que envolve proteínas que interagem com superfícies inorgânicas é a fabricação de materiais anti-incrustações. 12, 13, 14, 15 A incrustação biológica é um processo em que organismos indesejáveis anexar a uma superfície. Ele tem muitas implicações prejudiciais sobre nossas vidas. Por exemplo, biofouling de bactérias sobre dispositivos médicos leva a infecções hospitalares. Biofouling de organismos marinhos em barcos e navios de grande porte aumenta o<html> o consumo de combustível. 12, 16, 17, 18 -Molécula única força espectroscopia (SMFS), usando um AFM, pode medir directamente as interacções entre um aminoácido ou um péptido com um substrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Outros métodos, como a exibição de fagos, 27, 28 microbalança de cristal de quartzo (QCM) 29 ou ressonância de plasma de superfície (SPR) 29, 30, 31, 32,ref &quot;&gt; 33 medida as interações de peptídeos e proteínas para superfícies inorgânicas em massa. 34, 35, 36 Isto significa que os resultados obtidos por estes métodos referem-se a conjuntos de moléculas ou agregados. Em SMFS, uma ou poucas moléculas são fixadas à ponta de AFM e as suas interacções com o substrato desejado é medido. Esta abordagem pode ser expandido para estudar o dobramento de proteínas, puxando a proteína a partir da superfície. Além disso, ele pode ser usado para medir as interacções entre células e proteínas e a ligação dos anticorpos para os seus ligandos. 37, 38, 39, 40 Este artigo descreve detalhadamente como anexar tanto peptídeos ou aminoácidos para a ponta do AFM usando química silanol. Além disso, o documento explica como realizar medições de força e como analisar aresultados.

<table><tbody><tr><td>Estabilizadores AFM de nitreto de silício (Si3N4) AFM com pontas de silício</td><td>Bruker (Camarilo, CA, EUA)</td><td></td><td>MSNL10, raio nominal dos cantilares ~2 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Metiltrietoxissilano&nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, EUA)</td><td></td><td>Para Silailação da ponta AFM&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropil) trietoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel)</td><td></td><td>Para Silaylation da ponta do AFM</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalém, Israel)</td><td></td><td>Usado para a desproteção do peptide</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)</td><td></td><td>Usado para a modificação da ponta</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)</td><td></td><td>Usado para a ponta modificação</td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)</td><td></td><td>Usado para desproteção de ponta Fmoc</td></tr><tr><td>Fluorenilmetiloxicarbonil-PEG-N-hidroxisuccinimida&nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Alemanha, Alemanha)</td><td></td> <td>Usado como ligante flexível covalente (MW = 5.000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, Inglaterra)</td><td></td><td>Usado como reagente de acoplamento.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-metil-2-pirrolidona (NMP)</td><td>Acros Organics (Nova Jersey, EUA)</td><td></td><td>Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta</td></tr><tr><td>DMF (dimetilformamida)</td><td>Merck (Darmstadt, Alemanha)</td><td></td><td>Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalém, Israel)</td><td></td><td>Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta</td></tr><tr><td>Etanol (anidro)</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>Usado como solvente no procedimento de modificação da ponta</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td> <td>Merck (Darmstadt, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anidrido acético</td><td>Merck (Darmstadt, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Peptídeos</td><td>GL Biochem (Xangai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanina e tirosina&nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Alemanha)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% de dispersão de TiO2 na mistura de solvente 2- (2-metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalém, Israel)</td><td></td> <td>(30%) na mistura de solvente 2- (2 metoxietoxi) etanol (DEGME) e 3-etoxipropionato de etila (EEP). Usado para preparação de substrato TiO2</td></tr><tr><td>Substratos de mica</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, Califórnia, EUA)</td><td></td><td>9,9 mm de diâmetro</td></tr></tbody></table>

insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com materiais inorgânicos usando single-molecule força spectroscopy

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

As interacções entre as proteínas ou péptidos e materiais inorgânicos levar a vários processos interessantes. Por exemplo, combinando proteínas com minerais conduz à formação de materiais compósitos com propriedades únicas. Além disso, o processo de incrustação biológica indesejável é iniciada pela adsorção de biomoléculas, principalmente proteínas, nas superfícies. Esta camada orgânica é uma camada de adesão de bactérias e que lhes permite interagir com a superfície. Compreender as forças fundamentais que governam as interações na interface orgânica-inorgânica, é importante para muitas áreas de pesquisa e poderia levar à concepção de novos materiais para aplicações ópticas, mecânicas e biomédicas. Este artigo demonstra uma técnica de espectroscopia de força única molécula que utiliza um AFM para medir a força de aderência entre ambos péptidos ou aminoácidos e superfícies inorgânicas bem definidas. Esta técnica envolve um protocolo para a fixação da biomolécula a AFMponta através de um ligante flexível covalente e única molécula de medidas de espectroscopia de força por parte microscópio de força atômica. Além disso, uma análise dessas medidas está incluída.

A Figura 1 apresenta o procedimento de modificação de ponta. No primeiro passo, um tratamento com plasma modifica a superfície da ponta de nitreto de silício. A ponta apresenta grupos OH. Estes grupos serão, em seguida, reagir com os silanos. No final deste passo, a superfície da ponta vai ser coberta por grupos -NH2 livres. Estas aminas livres vai então reagir com Fmoc-PEG-NHS, um ligante covalente. O grupo Fmoc do ligante é removido por PEG pipyridine, um re...

Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

O objetivo geral da técnica de espectroscopia de força de molécula única é determinar a força de adesão e a natureza das interações entre aminoácidos ou peptídeos com diferentes superfícies. Este assunto pode ajudar a responder a questões-chave na área de química de superfície e ser usado para o desenvolvimento de novos compósitos e cordados. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações sobre a interação entre a molécula desejada e as superfícies no nível de uma única molécula.Para começar, compre os cantilevers do AFM do nitreto de silicone equipados com as pontas do silicone com um raio nominal do modilhão de dois nanômetros. Monte a ponta no suporte. Limpe cada um dos cantilevers do AFM mergulhando-os no álcool etílico por 20 minutos e seque-os então na temperatura ambiente.Em seguida, coloque as pontas em uma câmara de plasma e trate os cantilevers expondo-os ao plasma de oxigênio por cinco minutos. Preparar uma solução contendo 15 partes de metiltrietoxissilano e uma parte de três aminopropiltrietoxissilano e suspender os canitlevers três centímetros acima da solução sob uma atmosfera inerte. É importante que as pontas e o suporte não toquem na mistura de s

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Química

Este vídeo demonstra a automontagem de peptídeos amilóides em uma estrutura supramolecular rica em folha beta usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Um feixe infravermelho é passado através de um cristal com alto índice de refração e a absorção de energia através da interface do cristal e a amostra é registrada. As estruturas secundárias das proteínas da amostra são identificadas pela análise de seus picos de absorção característicos em regiões específicas do...

Uma técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier para estudar a automontagem de peptídeos

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

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&lt; class = 'jove_content '&gt; Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

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