Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

O objetivo geral da técnica de espectroscopia de força de molécula única é determinar a força de adesão e a natureza das interações entre aminoácidos ou peptídeos com diferentes superfícies. Este assunto pode ajudar a responder a questões-chave na área de química de superfície e ser usado para o desenvolvimento de novos compósitos e cordados. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações sobre a interação entre a molécula desejada e as superfícies no nível de uma única molécula.

Para começar, compre os cantilevers do AFM do nitreto de silicone equipados com as pontas do silicone com um raio nominal do modilhão de dois nanômetros. Monte a ponta no suporte. Limpe cada um dos cantilevers do AFM mergulhando-os no álcool etílico por 20 minutos e seque-os então na temperatura ambiente.

Em seguida, coloque as pontas em uma câmara de plasma e trate os cantilevers expondo-os ao plasma de oxigênio por cinco minutos. Preparar uma solução contendo 15 partes de metiltrietoxissilano e uma parte de três aminopropiltrietoxissilano e suspender os canitlevers três centímetros acima da solução sob uma atmosfera inerte. É importante que as pontas e o suporte não toquem na mistura de silano.

Além disso, o silano é altamente sensível à umidade e, portanto, essas pontas precisam ser realizadas em uma atmosfera inerte. Uma vez selado, conecte o dessecador a uma bomba de vácuo e aplique vácuo por duas horas para formar uma monocamada dos dois tipos de compostos mistos de silano na superfície dos cantilever. Remova cuidadosamente as pontas e coloque-as em uma placa quente pré-aquecida a 70 graus Celsius.

Deixe as pontas secarem por 10 minutos. Resfrie as pontas em temperatura ambiente antes de mergulhá-las em uma solução de Fmoc-PEG-NHS por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe as pontas em clorofórmio por cinco minutos e depois em DMF por mais cinco minutos.

Após a incubação em DMF, desproteja os grupos Fmoc das moléculas de PEG anexadas mergulhando as pontas em solução de piperidina a 20% em DMF por 30 minutos. Novamente, mergulhe as pontas em DMF por quatro minutos e depois em N-metil-2-pirrolidona por mais quatro minutos. Para acoplar aminoácidos nas pontas, mergulhe o por uma hora e meia em uma solução de acoplamento de aminoácidos com uma concentração total de 30 milimolares e cinco mililitros de N-metil-2-pirrolidona.

Para proteger os resíduos de PEG livres ou não reagentes restantes pelo grupo acetil, mergulhe as pontas por 30 minutos em uma mistura molar de 0,65 de quatro partes de anidrido acético e uma parte de diisopropiletilamina e N-metil-2-pirrolidona. Em seguida, mergulhe sequencialmente as pontas funcionalizadas de aminoácidos peptídicos por quatro minutos cada em NMP, clorofórmio, etanol a 50% e água antes de finalmente secar a ponta ao ar. Fixe a superfície de teste desejada a um suporte metálico do AFM com epóxi disponível comercialmente.

Em seguida, coloque o suporte metálico no suporte de vidro do AFM, que tem a forma de uma pequena placa de Petri. Encha o suporte de vidro com tampão TRIS. E coloque então o suporte metálico na fase do AFM abaixo do suporte da ponta.

Em seguida, monte a ponta do AFM no vidro óptico do AFM. Coloque o bloco de vidro óptico na cabeça do AFM. E coloque a cabeça do AFM no palco.

Em seguida, calibre os cantilevers AFM com constantes de mola que variam de 10 a 30 piconewtons por nanômetro. Uma medição de força típica resulta em uma curva de distância de força como as mostradas aqui. A primeira espiada indica interações não específicas entre a ponta e a superfície e a segunda espiada refere-se ao evento de adesão específico.

A partir de várias centenas de curvas de distância de força, é possível construir um histograma plotando o número de eventos de adesão versus força. A aplicação de um ajuste gaussiano nesses histogramas determinará a força mais provável. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como modificar quimicamente as pontas do AFM com aminoácidos ou peptídeos e como realizar a espectroscopia de força de molécula única usando AFM.