Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como implementar a microscopia de imagem de tempo resolvido por fluorescência, ou FLIM, em um fluxo de trabalho automatizado de placas de múltiplos poços, utilizando software de código aberto e instrumentação básica. Esta metodologia pode ser aplicada a leituras baseadas em FLIM em uma série de células fixadas ou vivas. E é particularmente útil para avaliar o processamento de sinais celulares ou interações proteicas.

As principais vantagens desta técnica são que a FLIM fornece leituras quantitativas robustas e pode fornecer a fração populacional de interações em uma única medição. Aplicando técnicas de análise global a milhares de células em centenas de campos de visão, podemos utilizar transferência de energia por ressonância de Foster, ou leituras de FRET. E aproveitando, por exemplo, mudanças de tempo de vida até cerca de 20 picosegundos.

Para demonstrar o procedimento com Frederik Gorlitz, estarão Sunil Kumar, nosso pesquisador associado, e Ian Munro, nosso desenvolvedor de software. Comece iniciando o Micromanager e abra o plugin openFLIM-HCA. Na guia de controle FLIM, selecione o arquivo de calibração da caixa de atraso e abra os arquivos de calibração.

Selecione o arquivo de calibração para a combinação específica da unidade geradora de atraso e taxa de repetição do laser de interesse. No menu arquivo, selecione definir pasta base e escolha a pasta onde os dados serão salvos. Após confirmar que todos os parâmetros apropriados foram definidos, defina manualmente uma largura de porta de quatro nanosegundos na caixa de controle do intensificador óptico com porta para todo o experimento.

Para adquirir dados de imagem da função de resposta do instrumento, coloque manualmente um bloqueador de feixe na cassete do cubo de filtro antes do objetivo para impedir a saída de qualquer luz a laser e incline o bloqueador de feixe para minimizar reflexos de volta ao corpo do microscópio. Na guia de controle de trajeto de luz, configure os filtros de excitação, dicróico e de emissão na unidade de disco giratório, de modo que a fração da luz de excitação espalhada pelo disco de Nipkow giratório possa ser capturada sem saturar o sistema por um tempo de integração da câmera de pelo menos 200 milissegundos. Na guia de controle de FLIM, utilize a função de encontrar ponto máximo em toda a faixa de atrasos coberta pela caixa de atraso rápido programável.

Em seguida, verifique o traçado de saída exibido. E ajuste os tempos de atraso do curso, de modo que o perfil completo da função de resposta do instrumento esteja dentro do intervalo de varredura da caixa de atraso rápida. Ajuste os parâmetros de densidade neutra e tempo de exposição.

Além da acumulação de quadros, ajuste para que a câmera não fique saturada na janela temporal de brilho e para que o tempo efetivo de integração não seja inferior a 200 milissegundos. No menu de controle de FLIM, selecione a caixa de atraso rápido e defina incrementos de atraso de 25 picosegundos ao longo da faixa completa de atraso. Em seguida, selecione preencher atrasos e clique em capturar imagem de FLIM para adquirir uma imagem da função de resposta do instrumento.

E aguarde até que a aquisição seja concluída. No menu de controle do caminho óptico, selecione densidade neutra e clique em bloqueado para bloquear o laser. Abra o menu de controle de FLIM e selecione a caixa de atraso rápida para reduzir o número de etapas de atraso aumentando o valor na caixa de incremento.

Em seguida, clique em capturar imagem FLIM para adquirir uma imagem de fundo da câmera. Para adquirir os dados de referência do die, vá até a guia de controle XYZ e insira o poço H4 na caixa de diálogo ir para poço. Em seguida, vá até a guia de controle do trajeto da luz e selecione os filtros de excitação, dicróico e de emissão apropriados para a imagem da proteína fluorescente M turquoise utilizando a função encontrar ponto máximo ao longo de toda a faixa da caixa de atraso rápido.

Em seguida, defina os parâmetros apropriados para a aquisição dos dados de referência do die e uma imagem de fundo correspondente, conforme acabou de ser demonstrado. Para adquirir os dados de FLIM de uma amostra em placa de múltiplas poções, acesse o menu de configuração de aquisição sequenciada HCA. Selecione a guia posições XYZ e defina quais poções devem ser imageadas e o número de campos de visão a serem adquiridos por poção.

Selecione um campo de visão representativo contendo a amostra a ser imageada e ajuste o filtro neutro ótimo no tempo de integração da câmera para atingir 75% da faixa dinâmica da câmera de leitura. Na guia de controle XYZ, selecione o controle de foco de retorno na caixa de diálogo de foco automático e foque manualmente o microscópio nas células ou estruturas de interesse. Defina a faixa de busca do foco automático em 2000 micrômetros e pressione enter.

Em seguida, clique em AF agora para iniciar o procedimento de foco automático. Um valor de deslocamento aparecerá no campo de foco automático de deslocamento de foco. Insira esse valor de deslocamento na janela de deslocamento de AF e clique em AF agora duas vezes para repetir o procedimento de foco automático.

Os valores de compensação devem agora ser definidos como zero, indicando o correto funcionamento do sistema de foco automático. Em seguida, na guia de controle FLIM, selecione a função de autogatilhamento para garantir uma amostragem logarítmica dos pontos de atraso. Defina o número de quadros acumulados para um valor que resulte no tempo desejado de aquisição total de dados.

Em seguida, na caixa de diálogo de aquisição de FLIM, clique no botão iniciar sequência HCA para executar a aquisição de placa multipoço de FLIM e adquirir uma imagem de fundo da câmera conforme demonstrado anteriormente. Aqui é apresentado um ensaio representativo de FLIM fret utilizando o sistema modelo fret expresso em cécocélulas e uma placa multipoço, com exemplos das imagens de tempo de vida fluorescente adquiridas automaticamente dos campos típicos de visão aparentes em cada poço. Neste experimento, os poços de controle negativo apresentaram os tempos de vida mais longos, e os tempos de vida do doador exibiram os menores fret nos construtos com os comprimentos de ligador mais curtos.

No geral, a vida média, calculada como média em todos os campos de visão em cada poço, variou entre as placas de múltiplos poços. A média do perfil de decaimento da intensidade de fluorescência do doador em todas as células imageadas no poço A1, juntamente com o ajuste a um modelo de decaimento monoexponencial e a função de resposta do instrumento, ilustra que o modelo de ajuste é válido. Uma análise adicional da vida média de fluorescência para cada coluna da placa de múltiplos poços, obtida a partir de um ajuste monoexponencial por pixel, demonstra que a vida média diminui nos construtos fret com comprimentos de ligador mais curtos, simulando um experimento com diferentes eficiências de fret.

Neste experimento, os dados de FLIM de um ensaio FRET da ação de diferentes inibidores sobre a oligomerização proteica foram ajustados com um modelo de decaimento exponencial simples. O mapa de placas do tempo de vida de fluorescência ilustra o tempo de vida médio por poço, calculado como média de oito campos de visão. Um conjunto pequeno, com imagens de quatro campos de visão por poço, enquanto nosso ensaio de FLIM pode ser concluído em aproximadamente duas horas e meia, incluindo o tempo necessário para adquirir a função de resposta do instrumento, os dados de referência do corante e para executar a análise no FLIM fit.

Ao realizar um ensaio de FLIM, é importante lembrar de adquirir a função de resposta do instrumento e os dados de referência dielétrica juntamente com suas imagens de fundo, para que você tenha todas as informações necessárias para analisar os dados de FLIM. Utilizando nosso software de código aberto, FLIM fit, também é possível ajustar esses dados a modelos de decaimento mais complexos. Por exemplo, permitindo a determinação da fração de população de fret.

Nossa tecnologia FLIM HCA está ajudando pesquisadores da área de descoberta de fármacos a realizar medições robustas de fret. No futuro, esperamos que esta tecnologia permita a medição de constantes de dissociação em ensaios baseados em células. Esperamos também que este artigo em vídeo e as informações em nossa Wiki ajudem outros pesquisadores a construir sua própria instrumentação FLIM HCA e aplicá-la em fret e em outros ensaios.

Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser perigoso e que precauções, como o confinamento de todos os feixes laser, devem sempre ser tomadas ao utilizar esse tipo de instrumentação.