Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como implementar a microscopia de imagem de fluorescência com controle de tempo, ou FLIM, em um fluxo de trabalho automatizado de placas de vários poços usando software de código aberto e instrumentação básica. Esta metodologia pode ser aplicada a leituras baseadas em FLIM em uma série de células fixas ou vivas. E é particularmente útil para ler o processamento do sinal celular ou as interações proteicas.

As principais vantagens dessa técnica são que o FLIM fornece leituras quantitativas robustas e pode fornecer fração populacional de interação em uma única medição. A aplicação de técnicas de análise global a milhares de células em centenas de campos de visão nos permite utilizar a transferência de energia da resina de fomento, ou leituras FRET. E aproveitando, por exemplo, as mudanças na vida útil para cerca de 20 picossegundos.

Demonstrando o procedimento com Frederik Gorlitz estarão Sunil Kumar, nosso pesquisador associado e Ian Munro, nosso desenvolvedor de software. Comece iniciando o microgerenciador e abra o plug-in openFLIM-HCA. Na guia de controle FLIM, selecione o arquivo de calibração da caixa de atraso e abra os arquivos de calibração.

Selecione a calibração file para a combinação específica da unidade geradora de atraso e taxa de repetição do laser de interesse. No menu de arquivo, selecione definir pasta base e selecione a pasta onde os dados serão salvos. Depois de confirmar que todos os parâmetros apropriados foram definidos, defina manualmente uma largura de porta de quatro nanossegundos na caixa de controle do intensificador óptico fechado para todo o experimento.

Para adquirir dados de imagem da função de resposta do instrumento, coloque manualmente um bloco de feixe no do cubo do filtro antes da objetiva para evitar a fuga de qualquer luz laser e incline o bloco do feixe para minimizar qualquer reflexão de volta à estrutura do microscópio. Na guia de controle do caminho de luz, defina os filtros de excitação, dicróico e de emissão na unidade de disco giratório, de modo que a fração de luz de excitação espalhada pelo disco Nipkow giratório possa ser visualizada sem saturar o sistema por um tempo mínimo de integração da câmera de 200 milissegundos. Na guia de controle FLIM, use a função de localização de ponto máximo em toda a faixa de atrasos cobertos pela caixa de atraso rápido programável.

Em seguida, verifique o rastreamento de saída exibido. E defina os tempos de atraso do curso, de modo que o perfil completo da função de resposta do instrumento esteja dentro da faixa de varredura da caixa de atraso rápido. Ajuste os parâmetros de densidade neutra e tempo de exposição.

Bem como o acúmulo de quadros, para que a câmera não fique saturada no portão de tempo de brilho e o tempo de integração efetivo não seja inferior a 200 milissegundos. No menu de controle FLIM, selecione a caixa de atraso rápido e defina os passos de atraso de 25 picossegundos em toda a faixa de atraso. Em seguida, selecione preencher atrasos e clique em encaixar imagem FLIM para adquirir uma imagem de função de resposta do instrumento.

E aguarde até que a aquisição seja concluída. No menu de controle do caminho da luz, selecione densidade neutra e clique em bloqueado para bloquear o laser. Abra o menu de controle FLIM e selecione a caixa de atraso rápido para reduzir o número de etapas de atraso aumentando o valor na caixa de incremento.

Em seguida, clique em encaixar imagem FLIM para adquirir uma imagem de câmera de fundo. Para adquirir dados de matriz de referência, vá para a guia de controle XYZ e insira o poço H4 na caixa de diálogo ir para o poço. Em seguida, vá para a guia de controle do caminho da luz e selecione os filtros de excitação, dicróicos e de emissão apropriados para obter imagens da proteína fluorescente turquesa M usando a função de localização do ponto máximo em toda a faixa da caixa de atraso rápido.

Em seguida, defina os parâmetros apropriados para adquirir os dados da matriz de referência e uma imagem de fundo correspondente, conforme demonstrado. Para adquirir os dados FLIM de uma amostra de placa de vários poços, vá para o menu de aquisição sequenciada HCA de configuração. Selecione a guia Posições XYZ e defina quais poços devem ser criados e o número de campos de visão a serem adquiridos por poço.

Selecione um campo de visão representativo contendo a amostra a ser fotografada e defina o filtro de densidade neutra ideal no tempo de integração da câmera para atingir 75% da faixa dinâmica da câmera de leitura. Na guia Controle XYZ, selecione o controle de foco de retorno na caixa de diálogo de foco automático e foque manualmente o microscópio nas células ou estruturas de interesse. Defina o intervalo de pesquisa de foco automático para 2000 micrômetros e pressione enter.

Em seguida, clique em AF agora para iniciar o procedimento de foco automático. Um valor de deslocamento aparecerá no campo de foco automático de deslocamento de foco. Insira esse valor de deslocamento na janela de deslocamento AF e clique em AF agora duas vezes para repetir o procedimento de foco automático.

Os valores de deslocamento agora devem ser definidos como zero, indicando um funcionamento correto do sistema de foco automático. Em seguida, na guia de controle FLIM, selecione a função de acoplamento automático para garantir uma amostragem logarítmica dos pontos de atraso. Defina quadros acumulados como um valor que produza o tempo total de aquisição de dados desejado.

Em seguida, na caixa de diálogo de aquisição FLIM, clique no botão iniciar sequência HCA para executar a aquisição de placa de vários poços FLIM e adquirir uma imagem de câmera de fundo como acabamos de demonstrar. Aqui, um ensaio de traste FLIM representativo usando o sistema de traste modelo expresso em cocélulas e uma placa de poços múltiplos é mostrado, com exemplos das imagens de vida útil de fluorescência adquiridas automaticamente de campos de visão típicos aparentes em cada poço. Neste experimento, os poços de controle negativo apresentaram os tempos de vida mais longos, e os tempos de vida dos doadores exibiram as construções de trastes mais baixas com os comprimentos de ligante mais curtos.

No geral, a média do tempo de vida médio em todos os campos de visão em cada poço variou entre as placas de vários poços. A média do perfil de decaimento da intensidade de fluorescência do doador em todas as células fotografadas no poço A1, juntamente com o ajuste a um modelo de decaimento exponencial mono e a função de resposta do instrumento, ilustra que o modelo de ajuste é válido. Uma análise mais aprofundada do tempo médio de vida útil da fluorescência para cada coluna da placa de poços múltiplos, obtida a partir de um ajuste exponencial mono pixel wise, demonstra a diminuição do tempo de vida nas construções de trastes com comprimentos de ligante mais curtos, simulando um experimento com diferentes eficiências de trastes.

Neste experimento, os dados FLIM de um ensaio de trastes da ação de diferentes inibidores na oligomerização de proteínas foram ajustados com um único modelo de decaimento exponencial. O mapa da placa de vida útil da fluorescência ilustra a vida útil média por poço em média em oito campos de visão. Um pequeno conjunto, imagem de quatro campos de visão por poço, enquanto nosso ensaio FLIM pode ser concluído em aproximadamente duas horas e meia, incluindo o tempo para adquirir a função de resposta do instrumento, os dados da matriz de referência e executar a análise no ajuste FLIM.

Ao realizar um ensaio FLIM, é importante lembrar de adquirir a função de resposta do instrumento e os dados da matriz de referência junto com suas imagens de fundo para que você tenha todas as informações necessárias para analisar os dados FLIM. Usando nosso software de código aberto, FLIM fit, também é possível ajustar esses dados em modelos de decaimento mais complexos. Por exemplo, permitindo a determinação da fração da população de trastes.

Nossa tecnologia FLIM HCA está ajudando os pesquisadores da comunidade de descoberta de medicamentos a fazer medições robustas de frete. No futuro, esperamos que essa tecnologia permita que as constantes de dissociação sejam medidas em ensaios baseados em células. Esperamos que este artigo em vídeo e as informações em nosso Wiki ajudem outros pesquisadores a construir sua própria instrumentação FLIM HCA e aplicá-la ao traste e a outros ensaios.

Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser perigoso e que precauções como colocar todos os feixes de laser devem sempre ser tomadas ao usar essa instrumentação.