Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Este protocolo demonstra como obter imagens de eventos dinâmicos em embriões de CL egan iniciais com óptica Norky DIC ou fluorescência, fazendo uso de microscópios amplamente disponíveis e software de código aberto. O protocolo começa com a descrição de como dissecar embriões de CL gans e montá-los para imagens. Em seguida, a configuração adequada da ótica DIC nor masky é revisada para garantir imagens ideais com o mais alto detalhe.

A calibração de epifluorescente de campo amplo e iluminação também é revisada para coletar bons dados de imagem fluorescente em conjunto com software de código aberto. Uma boa microscopia pode visualizar a dinâmica celular em um embrião em desenvolvimento. As ilustrações visuais deste método são críticas, pois a configuração adequada da D iic Optics é difícil, pois a terminologia pode ser confusa e a técnica adequada é difícil de descrever na forma escrita.

Além disso, os pesquisadores devem ter o cuidado de minimizar a exposição à luz ao realizar imagens fluorescentes. Para limitar a fototoxicidade e o fotobranqueamento Para preparar os embriões para a imagem, primeiro faça duas soluções de montagem. Um é vaselina derretida e o outro é de dois a 3% de aros em buffer.

Aros mais densos podem ser feitos se as estruturas a serem fotografadas forem muito frágeis, tomando cuidado para evitar fervura. Ambas as soluções de estoque são derretidas no micro-ondas e armazenadas em alíquotas de quatro a cinco mililitros. No dia da imagem, derreta uma alíquota de solução de vaselina em um bloco de calor de 65 a 70 graus Celsius e derreta uma alíquota de solução levantada no micro-ondas.

Mais uma vez, evitando ferver. Em seguida, para manter essas soluções fundidas, armazene-as em um bloco de calor. Em seguida, cubra a parte superior e inferior de duas lâminas com uma tira de fita adesiva e posicione uma lâmina limpa entre as duas lâminas com fita adesiva.

Agora pipete algumas gotas do aros derretido na lâmina limpa e cubra-a com outra lâmina limpa. O Aros se espalha em uma fina almofada quadrada com a almofada de minhoca preparada. Use uma luneta de dissecação e uma palheta de fio de platina para transferir dois vermes adultos para uma gota de tampão de nove a 12 microlitros em uma lamínula de 18 por 18 milímetros.

Em seguida, corte. Abra os vermes com uma agulha ou bisturi para liberar os embriões com o agarro voltado para baixo. Posicione a almofada de minhoca na lamínula de 18 por 18 milímetros e remova qualquer ágar saliente.

Por fim, para selar a lamínula, aplique a solução de vaselina derretida ao longo de seu perímetro com um pincel ou palito. As células agora estão prontas para imagens. Ao colocar a lâmina no microscópio, certifique-se de que os dois polarizadores estejam alinhados perpendicularmente um ao outro.

Certifique-se de que tanto as paredes quanto os prismas estejam fora do caminho da luz. Se o campo não estiver escuro, gire o polarizador abaixo do condensador até que esteja agora. Encontre os embriões usando a objetiva de 10 vezes.

Olhe perto dos corpos dos vermes em busca de grupos de embriões jovens, a fim de obter vários embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do verme para obter as melhores imagens. Com os melhores embriões localizados, mude para um objetivo de maior potência.

Agora mude o cubo de filtro para DIC. Em seguida, insira o prisma de pedra da objetiva superior no caminho da luz e gire a torta no condensador para selecionar o prisma de pedra inferior que corresponda à objetiva. Com os prismas no lugar, ajuste o controle deslizante abaixo desta torre para corresponder à abertura numérica da lente.

Para obter a iluminação Kohler ideal, concentre o condensador até que a borda do diafragma do condensador pareça mais nítida. Mais nítida é quando a borda entre o preto claro é mais nítida ou em foco. Para obter o contraste ideal, ajuste a parede e o prisma da maçã girando o botão no controle deslizante.

Agora o microscópio está quase pronto para uso. É hora de controlar parâmetros de imagem adicionais no computador com microgerenciador e software de código aberto. Comece definindo o ganho da câmera como zero.

Em seguida, mude para salvar arquivos como tiffs de oito bits, não de 16 bits. Os arquivos TIFF podem ser analisados posteriormente por software de código aberto como o Image J.Em seguida, ajuste o nível de luz para onde os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo dos níveis de saturação. Se tudo tiver sido feito corretamente, a imagem parecerá 3D com a luz parecendo brilhar em um ângulo.

Agora que a imagem parece brilhante, selecione os embriões que deseja criar e desenhe uma região de interesse. Se o microscópio tiver um motor de foco, use-o para coletar vários planos focais a cada vez. Aponte para abrir a janela de aquisição multidimensional e defina o plano superior e inferior da pilha Z ajustando o botão de foco para encontrar o primeiro e o último plano focal com alguns grânulos de garfo em foco.

Defina o tamanho do passo. Isso definirá o número de planos focais coletados. Agora, defina um intervalo de tempo longo o suficiente para adquirir todos os planos focais.

Os pontos de tempo máximos podem ser definidos muito altos para que o software tire imagens até ser interrompido manualmente. Configure o software para exibir apenas a última imagem adquirida para que o processo possa ser monitorado. Agora dê um nome de arquivo às imagens e comece a adquirir imagens.

A análise de imagens será brevemente revisada no final da próxima seção. Construir um filme GFP é muito parecido com fazer quatro D nem MIC DIC, mas um arquivo de configuração que inclui controle de software de estilhaçamento fluorescente é usado. Em vez disso, com os embriões localizados, certifique-se de que o prisma de walstone superior não esteja no caminho da luz e mude o cubo do filtro para F-I-T-C-G-F-P.

Se isso não foi definido automaticamente Na inicialização usando o software, certifique-se de que o ganho da câmera esteja definido como 255. Um arquivo de imagem é definido para o formato tiff de 16 bits. Agora desligue a fonte de luz transmitida e clique em imagem ao vivo.

Ajuste a intensidade da fonte de luz UV e o tempo de exposição para obter uma boa relação sinal-ruído para o sinal de fluorescência, no entanto, mantenha a exposição à luz no mínimo para preservar as células. Em seguida, configure o intervalo de tempo. O número de pontos de tempo e o número de planos focais agora prosseguem com a aquisição da imagem conforme descrito anteriormente.

Para analisar os filmes, use um software de código aberto. Imagem J com o plug-in micromanager instalado Filmes muito grandes também podem ser importados para a Image J usando o plug-in loci. Este é um embrião do tipo selvagem capturado com a ótica DIC de nor masky.

Posterior está no canto inferior direito e ventral está no canto inferior esquerdo. O filme mostra uma sequência de imagens de plano focal único coletadas a cada 15 segundos. A reprodução é definida em 14 quadros por segundo.

Este embrião expressa fluorescência durante a primeira divisão embrionária aqui posterior está no canto superior direito. Este filme mostra as mudanças num único plano focal a cada 10 segundos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens de embriões vivos usando a óptica DIC Naski e a epifluorescência para estudar eventos dinâmicos.

Esperamos que você tenha uma melhor compreensão de como configurar a óptica DIC Nomar para obter imagens ideais e perceber que você pode obter dados fluorescentes de alta qualidade usando iluminação de fluorescência epi e nem sempre depende de microscópios mais avançados. Você também pode aplicar essas técnicas de imagem para examinar embriões sem função genética específica para investigar melhor os requisitos genéticos para seus eventos favoritos durante a divisão ou desenvolvimento celular.