Name: Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a imaginar embriões de C. elegans usando microscopia de epifluorescência e software de código aberto. Este protocolo demonstra técnicas de preparação e otimização para visualizar dinâmicas celulares em desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Interna fundos institucionais e as Ciências Biológicas Scholars Program da Universidade de Michigan apoiaram este trabalho.

Preparação Worm <ol><li> Transferência L4 worms larval de placas apropriadas 18-24hs antes da imagem 22. Isso irá garantir que você tenha ovo-rolamento adultos para uma ampla oferta de embriões. </li><li> Prepare os tubos de vaselina e Agarose. Nós preparamos vários tubos de 15mL falcon pelo derretimento vaselina num copo no microondas e dispensa em 05/04 alíquota mL por tubo. Da mesma forma derreter 2-3% (w / v) em tampão de Agarose (M9 ou Egg buffer) e 4-5 mL alíquota em tubos falcon. Tenha cuidado para não ferver em excesso, a fim de minimizar a evaporação. No dia da imagem, derreta um tubo de vaselina em um bloco de aquecimento 65-70 ° C e derreter um tubo de agarose no microondas, mais uma vez ter cuidado para minimizar a ferver sobre. Armazenar os tubos no bloco de calor para manter a vaselina e os Agarose no estado fundido. </li><li> Faça Agarose pad. Posição uma lâmina de microscopia novo entre dois slides guia, que são cobertos por lâminas de uma única camada de fita de laboratório comum adere a parte superior e inferior de cada slide guia. Use uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para colocar 2-3 gotas de agarose derretida no novo slide. Cubra com um slide 2 nd perpendicular ao slide original, para que ela cobre e ajuda a espalhar a Agarose para criar uma almofada fina quadrados. O slide 2 º deve descansar acima da fita nos slides guia. A concentração de Agarose pode ser aumentada para 5% para almofadas mais espessas. </li><li> Usando um escopo de dissecação e um fio de platina "pick", a transferência de dois vermes adultos a uma queda de 9 12μL de tampão M9 ou ovo em uma lamela mm x 18 mm 18. </li><li> Corte worms aberta com uma agulha (usamos 27G1 / 2 agulhas) ou bisturi para liberar embriões. Tente cortar no meio do worm. </li><li> Menor Agarose pad (com o lado agar para baixo) para a lamela 18x18 milímetros contendo os embriões. Agar guarnição que se estende desde a borda da lamínula com uma lâmina de barbear. </li><li> Seal Coverslip usando um pincel ou vara de madeira fina para aplicar a vaselina derretida para todas as quatro bordas da lamínula. </li></ol> Alternativa para montagens agar estão pendurados cai 23 se os embriões são suscetíveis à pressão (ou seja, se a casca do ovo não faz corretamente). Imagem também pode ser realizada dentro do útero a seguir fertilização ou eventos precoces, como a meiose. Worms devem ser anestesiados com Levamisole 24. A fim de aumentar o número de embriões a partir de um determinado estágio de desenvolvimento, worms várias pode ser dissecado em um tempo e os embriões posicionadas juntas delicadamente usando uma ponta fina-pipeta ou uma escova de cílios ou pipetar à boca. 4D Nomarski DIC (contraste de interferência diferencial) Filmes <ol start="8"><li> Ligue o microscópio BX61 Olympus. Como a câmera é sensível a EM ondas emitidas por outros dispositivos que está ligado passado, a lâmpada de mercúrio (se necessário, para GFP ou fluorescência) em primeiro lugar. Iniciar Micro Manager-uma vez que tudo está ligado. Escolha o arquivo de configuração adequada para imagem DIC ou fluorescentes. A principal diferença é que o arquivo DIC não inclui controle de obturador fluorescente. Cada arquivo também seleciona o cubo de filtro apropriado e ajuste de ganho da câmera. </li><li> Encontrar embriões no microscópio utilizando objetiva de 10x. Procure perto de corpos sem-fim para os grupos de embriões jovens a fim de obter vários embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do worm para melhores imagens. </li><li> Utilizando o interruptor de software para uma maior ampliação (40x a 100x) e resolução (NA 0,9-1,4) O objectivo para a imagem latente. </li><li> Ajuste Nomarski DIC Optics (Os seguintes sites contêm explicação útil da óptica DIC ea terminologia; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Em nosso Olympus BX61 os componentes importantes são: <ol><li> Polarizador - controle deslizante abaixo do condensador </li><li> Prism condensador Wollaston - torre no condensador, logo abaixo do palco. </li><li> Prism Wollaston objetivo - controle deslizante abaixo do filtro de cubos </li><li> 2 nd polarizador (analisador) - cubo de filtro na posição DIC </li></ol></li><li> Interruptor Cube Filtro para DIC para posicionar o Analyzer (2 polarizador nd) no caminho da luz (software deve fazer isso no arranque). </li><li> Certifique-se que os dois polarizadores estão devidamente alinhados (cruzados). Quando ambos os prismas Wollaston estão fora do caminho da luz do campo de visão deve ser escura. Se necessário, gire o polarizador abaixo do condensador até que isso seja correto. </li><li> Insira o objetivo (superior) Prism Wollaston no caminho da luz. </li><li> Gire o revólver no condensador para selecionar o prisma Wollaston que corresponde ao objetivo que você está usando. </li><li> Ajuste o controle deslizante abaixo desta torre para combinar NA da lente. </li><li> Foco do condensador para a iluminação Koehler ideal. </li><li> Ajustar o superior Wollaston Prism para obter um contraste ideal, girando o botão do controle deslizante. </li><li> Outras configurações de inicialização controladas por software incluem o ganho de câmera (definido como 0) e mudar para salvar arquivos como 8-bit não arquivos TIFF de 16 bits. </li></ol></li><li> Ajustar o nível de luz para dar boa imagem. (Geralmente usam 4,7 Volts) (controlada via software). Nós preferimos a iluminar a amostra de modo que o mais brilhante pixels são apenas abaixo dos níveis de saturação. Bom DIC resultados óptica em uma imagem com um olhar 3-dimensional, onde os grânulos da gema no embrião destacam-se claramente. Em alternativa, este pode ser descrito como se a luz que ilumina a amostra aparece para brilhar a partir de um ângulo de modo que um lado da amostra (ou características da amostra) é iluminado brilhantemente e do lado oposto está nas sombras e aparece mais escura. </li><li> Selecione região de interesse (ROI) para incluir os embriões que você quer para a imagem, clique em conjunto de botões ROI para reduzir janela. </li><li> Abrir a janela de aquisição multi-dimensional. Selecione Z-stacks (fatias) e Pontos de Time. </li><li> Use botão de foco microscópio para encontrar o fundo do embrião (plano focal passado, com alguns grânulos da gema em foco). Clique em baixo Select. Repita o procedimento para identificar e definir o topo do embrião. Normalmente, usamos um tamanho do passo micron e acabar com ~ 20 aviões focal. Em geral, coletar vários planos focais em cada momento, porque os embriões e células são relativamente grosso. Além disso, especialmente quando as células começam a se dividir em diferentes orientações podem deslocar em torno de outras células no embrião movê-los dentro ou fora do plano focal original. Se o seu microscópio não tem um motor de foco você pode ajustar manualmente o foco para seguir o processo de celular ou você está interessado. </li><li> Número de entrada de pontos de tempo e intervalo de tempo necessário. Nós usamos geralmente intervalo de 15 segundos ea um máximo de 500 pontos tempo. Começamos com pontos mais tempo do que vamos precisar parar a aquisição e quando desejar. Se você é imagem múltiplos planos focais, certifique-se que há tempo suficiente para adquirir todos os planos focais no intervalo entre os pontos de tempo. </li><li> Selecionar ou criar um local para salvar os dados. Certifique-se que o software é configurado para exibir a última imagem só. Dê um nome ao arquivo e clique em Acquire. Monitorar a aquisição de imagem automatizado para os primeiros pontos pouco tempo para garantir que ele está funcionando corretamente. </li><li> Clique parar quando quiser parar a aquisição, mude para objetiva de 10x e preparar o próximo slide. </li><li> Quando terminar de imagem remover componentes DIC do caminho da luz. Óleo limpo off objetivo se necessário. Desligue tudo começando com a câmera. </li></ol> Filmes GFP <ol start="20"><li> Iniciar microscópio e encontrar embriões como acima. Use arquivo de configuração que inclui o controle de software do obturador fluorescente. </li><li> Certifique-se que o prisma superior DIC (slider) não está no caminho de luz. </li><li> Interruptor Cube filtro para FITC / GFP (definido automaticamente na inicialização) </li><li> Alterar o ganho da câmera para 255 e arquivo de imagem para 16-bit Tiff (definido automaticamente na inicialização com esse arquivo de configuração). </li><li> Desligue a luz branca. </li><li> Clique ao vivo de imagens para visualização da imagem. Trabalhar rapidamente para minimizar a exposição à luz. Alternativamente use Imagem Snap para coletar única imagem. </li><li> Ajuste Mercury poder bulbo / filtros de densidade neutra, comprimento exposição para obter uma boa imagem. Em geral, você deve usar luz atingindo o mínimo de amostra para obter os dados que pretende reduzir photodamage para a célula e fotodegradação dos sinais de fluorescência. </li><li> Configurar intervalo de tempo, número de pontos de tempo e número de aviões focal. Muitas vezes usamos 10/05 intervalos de um segundo plano focal e 1-3. </li><li> Selecione ROI e definir parâmetros para aquisição de imagem, como descrito anteriormente em Passos 13-19. </li></ol> Filmes analisando <ol start="29"><li> Dados serão guardados para a pasta com o nome digitado e conter uma série de arquivos para cada imagem tiff da pilha 4D, um arquivo de texto e um arquivo xml contendo metadados, tais como níveis de exposição e intervalos de tempo. </li><li> As imagens TIFF podem ser abertos por ImageJ através de dois métodos. O primeiro (um método) é o mais simples e também ler os metadados de cada arquivo. A segunda (método b) é capaz de usar a memória virtual para abrir arquivos que são maiores do que a quantidade de memória alocada para ImageJ, mas não inclui os metadados. <ol class="lalpha"><li> Usando Micro-Manager Plugin <ol><li> Micro-Manager é construído sobre e usa ImageJ (ele instala uma nova versão do ImageJ que será diferente de qualquer outra versão que você pode ter instalado anteriormente) e inclui um plugin para abrir dados. Alternativamente, você pode copiar o conteúdo da pasta Micro-Manager-1.3/plugins para a pasta plugins para outra versão do ImageJ. </li><li> Ir para o menu Plugins, selecione Micro-Manager e, em seguida, File Manager Micro-Open. </li><li> Selecione a pasta que contém os dados que deseja visualizar e clique ok. </li><li> Jogue através das dimensões Z e T. </li></ol></li><li> Usando LOCI plugin para abrir filmes com Importador BioFormats. <ol><li> Xml e transferir os arquivos txt da pasta contendo os arquivos de tiff e renomear os dois arquivos para corresponder ao nome do conjunto de dados. </li><li> Dentro ImageJ, vá para o Plugins no menu suspenso, selecione LOCI e então ou Data Browser ou Bio-Formatos de importação. </li><li> Encontre a pasta com as pilhas a sua tiff. Clique sobre o arquivo tiff em primeiro lugar, em seguida, abra. </li><li> Ver pilha com Hyperstack. Sob organização Dataset: Selecione Arquivos de Grupo com dimensões Trocar nomes similares, e Abra todas as séries. Sob gestão da memória: Selecione: Use pilha virtual (especialmente para grandes conjuntos de dados). Clique ok </li><li> O plugin irá determinar as dimensões do conjunto de dados (número de pontos no tempo e aviões focal) e exibir o intervalo entre um conjunto de &lt;&gt; colchetes. Clique em OK ou alterar o número de pontos no tempo e / ou planos focais para abrir. </li><li> Confirmar que dimensão corresponde a cada série. </li><li> Jogue através das dimensões Z e T. </li></ol></li></ol></li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stills de um filme ilustrando DIC Nomarski normais eventos celulares durante o início C. elegans desenvolvimento embrionário: migração pronuclear (0-5:45), primeira divisão assimétrica (6:45-14:45) e segunda divisão assíncrona (14:45-27:00). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. 20 aviões focal em intervalos de 1 micron foram coletados a cada 15 segundos de exposição com 40 mS. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita e ventral é baixo. Bar escala representam 10 microns. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Stills de um filme fluorescentes ilustrando os movimentos dinâmicos de uma subunidade GFP-rotulados do complexo de passageiros cromossomo (AR-2) presentes em cromossomos de metáfase anáfase de início (A a C) antes de aparecer na midzone fuso em anáfase até citocinese completa (C a F). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. Um único plano focal foi coletada a cada 10 segundos de exposição com 50 ms. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita. Bar escala representam 10 microns. Filme 1 Filme Nomarski de Wild-Type Embryo. Filme correspondente a Figura 1. Posterior é para a parte inferior direita e ventral é o inferior esquerdo. Mostra um único plano focal do conjunto de dados original. A imagem foi recolhida a cada 15 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Clique aqui para assistir vídeo</a> Filme Movie 2 fluorescentes de tipo selvagem embrião expressando GFP:: AIR-2. Filme correspondente à Figura 2. Posterior é no canto superior direito. Filme foi coletado como um único plano focal. A imagem foi recolhida a cada 10 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Clique aqui para assistir vídeo</a>

<ol><li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li>
<li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast%3A+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li>
<li>Heuvel, S. vanden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li>
<li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li>
<li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li>
<li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li>
<li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NemaGENETAG+initiative%3A+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li>
<li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li>
<li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li>
<li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li>
<li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li>
<li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma consideração importante para a imagem latente de lapso de tempo viver é preservar a integridade e viabilidade da célula e do organismo. Microscopia DIC fornece o benefício que a amostra não é exposto à luz ultravioleta e aquecimento excessivo da fonte de iluminação. Microscopia DIC é adequado para detectar a migração celular e alterações nas células forma como citocinese e identificar algumas estruturas subcelulares, como o fuso mitótico e membrana nuclear. Imagens de fluorescência de proteínas repórter complementa microscopia DIC, identificando adicionais compartimentos subcelulares e permitindo a visualização de proteínas específicas. Para mitigar os riscos de fototoxicidade e danos ao embrião durante a imagens de fluorescência, que geralmente aumentam o ganho digitais da câmera, para compensar a intensidade da luz UV e duração reduzida de iluminação. Para fraco fluorescentes repórteres transgênicos, algoritmos de deconvolução para reatribuir algoritmos fora de foco de luz ou deblurring reduzir o fundo pode melhorar a qualidade das imagens capturadas. Enquanto microscópios avançados, tais como sistemas confocal ou multifotônica às vezes são necessários, temos verificado que muitos repórteres fluorescentes podem ser visualizados usando esta configuração de microscópio de epifluorescência, produzindo imagens de alta qualidade. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), além de ser livre, salva os arquivos diretamente para o formato TIFF em vez de formatos de arquivos proprietários de muitos pacotes de software comercial. Este simplifica significativamente a análise de nossos dados, eliminando a etapa de conversão de arquivos necessários para ler os arquivos de imagem em ImageJ, Photoshop e software de edição de imagem.

Olympus BX61 microscópio com câmera Orca Hamamatsu-ER. 10x Plano Fluorita (NA 0,3) e PlanAchromat 60x (NA 1,35) lentes objetivas Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Imagem J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose - biologia molecular / grau de eletroforese em gel Fisher Superfrost / Plus Lâminas de Microscopia (Catalog # 12-550-15) Fita de laboratório (Fisher Catalog # Series 15-901) 18 mm x 18 milímetros # 1.5 Lamelas M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Ovo tampão (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH 7.3) 25. Vaselina Escova / Stick Giletes Bloco de aquecimento Microscópio de dissecação Worms 22 Fio de platina pegar 22 27G1 / 2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) ou um bisturi com uma lâmina pequena

imagem c. elegans os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e software de código aberto

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Processos celulares, como a segregação de cromossomos, montagem e citocinese, são inerentemente dinâmicos. Lapso de tempo de imagens de células vivas, utilizando-fluorescente etiquetado proteínas repórter ou contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia, permite a análise da progressão temporal destes eventos dinâmicos que de outra forma inferida a partir de análise de amostras de 1,2 fixo. Além disso, o estudo dos regulamentos de desenvolvimento de processos celulares requer a realização de experimentos de lapso de tempo em um organismo intacto durante o desenvolvimento. O embrião Caenorhabiditis elegans é luz transparente e tem uma resposta rápida, programa de desenvolvimento invariante com uma célula conhecida linhagem 3, proporcionando assim uma experiência modelo ideal para estudar questões na biologia de células 4,5 e desenvolvimento 6-9. C. elegans pode ser alterada para a manipulação genética pela frente genética (mutagênese aleatória com base em 10,11) e da genética reversa para genes-alvo específicos (baseados em RNAi interferência mediada e orientada mutagênese 12-15). Além disso, animais transgênicos podem ser facilmente criado para expressar as proteínas fluorescentes marcados ou repórteres 16,17. Essas características se combinam para tornar mais fácil identificar as vias genéticas que regulam processos celulares fundamentais e de desenvolvimento in vivo 18-21. Neste protocolo, apresentamos métodos para geração de imagens ao vivo de C. embriões elegans utilizando óptica DIC ou de fluorescência da GFP em um microscópio composto de epifluorescência. Nós demonstramos a facilidade com que os microscópios prontamente disponíveis, normalmente usado para imagens de amostra fixa, também pode ser aplicado para o lapso de tempo de análise usando open-source software para automatizar o processo de imagem.

O<em&gt; C. elegans</emEmbrião&gt; é um poderoso sistema para o estudo de biologia celular e desenvolvimento. Nós apresentamos um protocolo para geração de imagens ao vivo de<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões utilizando óptica DIC ou fluorescência usando prontamente disponíveis microscópios de epifluorescência e open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Processos celulares, tais como a montagem, segregação e citocinese dos cromossomos, são inerentemente dinâmicos. O imageamento em time-lapse de células vivas, utilizando...

Este protocolo demonstra como obter imagens de eventos dinâmicos em embriões de CL egan's no início do desenvolvimento, utilizando óptica DIC Norky ou fluorescência, com microscópios amplamente disponíveis e software de código aberto. O protocolo inicia com a descrição da dissecação de embriões de CL gans e seu acondicionamento para aquisição de imagens. Em seguida, revisa-se a configuração adequada da óptica DIC com máscara Norky para garantir imagens ideais com o máximo de detalhe.A calibração da fluorescência epiluminescente de campo amplo e da iluminação também é revisada para coletar bons dados de imagem fluorescente combinados com software de código aberto. Uma boa microscopia pode visualizar a dinâmica celular em um embrião em desenvolvimento. Ilustrações visuais deste método são fundamentais, pois configurar corretamente a óptica D iic é difícil, já que a terminologia pode ser confusa e a técnica adequada é difícil de descrever por escrito.Além disso, os pesquisadores devem ter cuidado para minimizar a exposição à luz durante a realização de imagens fluorescentes. Para limitar a fototoxicidade e o fotodesbotamento, para preparar embriões para imagem, primeiro prepare duas soluções de montagem. Uma é vaselina derretida e a outra é dois a 3% de aros em tampão.Pode-se preparar aros mais densos se as estruturas a serem visualizadas forem muito frágeis, tomando cuidado para evitar fervura. Ambas as soluções estoque são derretidas no micro-ondas e então armazenadas em alíquotas de quatro a cinco mililitros. No dia da aquisição de imagens, derreta uma alíquota da solução de vaselina em um bloco térmico de 65 a 70 graus Celsius e derreta uma alíquota da solução de aros no micro-ondas.Novamente, evite ferver. Em seguida, para manter essas soluções no estado fundido, armazene-as em um bloco de aquecimento. Depois, cubra a parte superior e inferior de duas lâminas com uma tira de fita adesiva laboratorial e posicione uma lâmina limpa entre as duas lâminas com fita.Agora, pingue algumas gotas do aros fundido sobre a lâmina limpa e cubra-a com outra lâmina limpa. O Aros se espalha formando uma fina camada quadrada com o tampão preparado. Use um microscópio estereoscópico e uma alça de fio de platina para transferir dois vermes adultos para uma gota de nove a 12 microlitros de tampão sobre uma lamínula de 18 por 18 milímetros.Em seguida, corte. Abra os vermes com uma agulha ou bisturi para liberar os embriões com o lado do agarro voltado para baixo. Posicione a almofada de vermes sobre a lamínula de 18 por 18 milímetros e corte com uma lâmina qualquer excesso de agar.Por fim, para selar a lamínula, aplique a solução de vaselina fundida ao longo de sua periferia com um pincel ou palito de dente. As células estão agora prontas para a aquisição de imagens. Ao colocar a lâmina no microscópio, certifique-se de que os dois polarizadores estejam alinhados perpendicularmente um em relação ao outro.Certifique-se de que tanto os diafragmas quanto os prismas estejam fora do trajeto da luz. Se o campo não estiver escuro, gire o polarizador abaixo do condensador até que fique escuro. Localize os embriões utilizando a objetiva de 10 vezes.Procure perto dos corpos dos vermes grupos de embriões jovens para obter múltiplos embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do verme para obter as melhores imagens. Após localizar os melhores embriões, mude para uma objetiva de maior aumento.Agora, troque o cubo de filtro para DIC. Em seguida, insira o prisma de Walston objetiva superior no trajeto da luz e gire o anel no condensador para selecionar o prisma de Walston inferior que corresponde à objetiva. Com os prismas posicionados, ajuste o controle deslizante abaixo deste revólver para coincidir com a abertura numérica da lente.Para obter a iluminação de Kohler ideal, foque o condensador até que a borda do diafragma do condensador apareça mais nítida. O ponto mais nítido é quando o limite entre a luz e o preto é mais definido ou está em foco. Para obter o contraste ideal, ajuste a parede de maça e o prisma girando o botão no controle deslizante.Agora o microscópio está quase pronto para ser utilizado. É hora de controlar parâmetros adicionais de imageamento no computador com o software micromanager e de código aberto. Comece ajustando o ganho da câmera para zero.Em seguida, mude para salvar arquivos como TIFF de oito bits, não de 16 bits. Os arquivos TIFF podem ser analisados posteriormente por softwares de código aberto, como o Image J. Ajuste, então, o nível de luz para que os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo dos níveis de saturação. Se tudo tiver sido feito corretamente, a imagem terá aparência tridimensional, com a luz parecendo incidir em um ângulo.Agora que a imagem está excelente, selecione os embriões que deseja imaginar e desenhe uma região de interesse. Se o microscópio possuir um motor de foco, utilize-o para coletar múltiplos planos focais em cada momento. Abra a janela de aquisição multidimensional e defina os planos superior e inferior da pilha Z ajustando o botão de foco para encontrar o primeiro e o último plano focal com alguns grânulos de gema em foco.Defina o tamanho do passo. Isso definirá o número de planos focais coletados. Agora, defina um intervalo de tempo suficientemente longo para adquirir todos os planos focais.Os pontos de tempo máximos podem ser definidos muito altos, de modo que o software capture imagens até ser interrompido manualmente. Configure o software para exibir apenas a última imagem adquirida, para que o processo possa ser monitorado. Agora, atribua um nome de arquivo às imagens e comece a adquiri-las.A análise de imagem será brevemente revisada ao final da próxima seção. A construção de um filme GFP é semelhante à criação de quatro DIC D nem Musky, mas utiliza-se um arquivo de configuração que inclui o controle de software do obturador fluorescente. Em vez disso, com os embriões localizados, certifique-se de que o prisma walstone superior não esteja no trajeto da luz e troque o cubo de filtro para F-I-T-C-G-F-P.Se isso não foi definido automaticamente na inicialização usando o software, certifique-se de que o ganho da câmera esteja definido em 255. Um arquivo de imagem é definido no formato tiff de 16 bits. Agora desligue a fonte de luz transmitida e clique em imagem ao vivo.Ajuste a intensidade da fonte de luz UV e o tempo de exposição para obter uma boa relação sinal-ruído para o sinal de fluorescência; no entanto, mantenha a exposição à luz no mínimo necessário para preservar as células. Em seguida, configure o intervalo de tempo. O número de pontos temporais e o número de planos focais prosseguem com a aquisição de imagens conforme descrito anteriormente.Para analisar os filmes, utilize um software de código aberto. O ImageJ com o plugin micromanager instalado pode ser usado. Filmes muito grandes também podem ser importados para o ImageJ utilizando o plugin loci. Este é um embrião selvagem capturado com óptica DIC, sem máscara.O posterior está na parte inferior direita e o ventral na parte inferior esquerda. O vídeo mostra uma sequência de imagens de plano focal único coletadas a cada 15 segundos. A reprodução é configurada em 14 quadros por segundo.Este embrião expressa fluorescência durante a primeira divisão embrionária, sendo o posterior representado no canto superior direito. Este vídeo mostra as alterações em um único plano focal a cada 10 segundos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter imagens de embriões vivos utilizando tanto a óptica DIC Naski quanto a fluorescência em epifluorescência para estudar eventos dinâmicos.Esperamos que você tenha uma compreensão melhor de como configurar a óptica DIC Nomars para obter imagens ideais e perceba que é possível obter dados fluorescentes de alta qualidade utilizando iluminação por fluorescência em epifluorescência, sem depender sempre de microscópios mais avançados. Você também pode aplicar essas técnicas de imagem para examinar embriões que carecem de função gênica específica, a fim de investigar mais a fundo os requisitos genéticos para os eventos de seu interesse durante a divisão celular ou o desenvolvimento.

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve uma técnica para a visualização dos eventos iniciais da embriogênese do...

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Este protocolo descreve imagens de lapso de tempo de C. elegans baseadas em microfluídica em todo o desenvolvimento pós-embrionário.

Imagens de C . elegans de alta resolução em todos os estágios larvais

Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

Aprenda a imaginar embriões de C. elegans usando microscopia de epifluorescência e software de código aberto. Este protocolo demonstra técnicas de preparação e otimização para visualizar dinâmicas celulares em desenvolvimento.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Explorar mais vídeos