Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

O objetivo deste experimento é identificar o gene ou genes responsáveis pela integridade morfológica e funcional das organelas vegetais. Isso é feito pela adição de sulfonato de metano de Ethel como agente químico às sementes de atopia mutagênica que carregam o marcador fluorescente de organela. O segundo passo é coletar sementes de plantas individuais da primeira geração de mutagênicos para cultivar linhagens da geração mutante subsequente M dois.

Em seguida, as sementes de mutagênico a Eliana são observadas usando um microscópio confocal ou fluorescente para identificar o fenótipo orgânico aberrante. A etapa final é gerar a terceira geração de mutagênicos e confirmar a presença do fenótipo mutante. Em última análise, a mutação recessiva pode ser mapeada usando ferramentas de sequenciamento de próxima geração.

Uma vez identificada a localização do gene mutante, a transformação com o gene do tipo selvagem deve restaurar o fenótipo orgânico aberrante. Este método pode ajudar a responder questões-chave na manutenção da integridade morfológica e funcional das organelas vegetais. Atil metanos, tratamento com sulfonato de sementes de sta induzem mudanças de tempo de citosina no genoma, resultando em gwan de citosina para o tempo.

Adicionando mutações. O tratamento com EMS é um passo fundamental neste protocolo para garantir uma mutação de proporção perfeita dentro de M dois indivíduos. Para começar, obtenha sementes de Arabidopsis do tipo selvagem Columbia Ecotype que foram previamente projetadas para transportar um marcador fluorescente de organela relevante.

Transfira 0,8 gramas ou cerca de 40.000 sementes para um tubo de falcão de 50 mililitros. Em seguida, adicione 25 mililitros de água destilada e 0,2% de sulfonato de metano de etel. Incubar a mistura durante 16 horas num misturador mutante a baixa velocidade após a incubação, aspirar o líquido e deitar-se fora num frasco contendo um hidróxido de sódio molar.

Para inativar o EMS, adicione 25 mililitros de água ao tubo Falcon contendo as sementes. Feche o tubo e inverta cinco vezes para lavar as sementes. Depois que todas as sementes estiverem assentadas, aspire a água e descarte no frasco de hidróxido de sódio molar.

Repita esta etapa de lavagem até 10 vezes após a lavagem final, Reese gasta as sementes em uma quantidade mínima de água. Prossiga para a esterilização das sementes adicionando 25 mililitros de alvejante a 10% e agitando vigorosamente por 30 segundos. Assim que as sementes assentarem no fundo, retire a água sanitária e enxágue com 25 mililitros de água estéril.

Após a remoção da água estéril, adicione 25 mililitros de etanol a 70%. Agite os tubos por 30 segundos e deixe as sementes assentarem no fundo. Despeje o etanol e enxágue com 25 mililitros de água estéril.

Repita a lavagem com água estéril duas vezes. Em seguida, despeje as sementes em uma placa de Petri de plástico contendo papel de filtro de três mm. Deixe as sementes secarem sob o capô depois de incubá-las por dois dias a quatro graus Celsius.

Coloque as sementes em uma placa de Petri de 150 milímetros a aproximadamente 250 a 300 sementes por placa ao meio Magi e meio scoog contendo gel lutador. Como agente gelatinoso, cultive as sementes da geração M1 em placas por duas semanas. Transplante as mudas para o solo e permita que as plantas continuem a crescer.

Após 30 a 45 dias, as plantas atingirão o estágio maduro onde amadurecem, para que os vazamentos possam ser vistos claramente. Neste ponto, colete M duas sementes de plantas M1 individuais para gerar 1000 M independentes de duas linhas. Para observar as mudas com um microscópio confocal ou de fluorescência, cultive 60 sementes de cada M duas linhas por sete a 10 dias em placas de Petri de plástico ao meio.

Moreish e scoog medium contendo gel de combate também cultivam cinco mudas do controle EMS não tratado na mesma placa. Uma vez que as mudas são cultivadas, monte cinco a 10 cos lead-ins com o lado de vedação ABAC em direção à lente de 40 vezes em uma lâmina de microscópio e fechado com uma lamínula sob fluorescência, observe cada oleína da região cortical para a medial para distribuição subcelular alterada do marcador de organela. Após o transplante de plantas positivas para o solo e o crescimento das mudas, conforme descrito, confirme que o fenótipo mutante está na geração M três.

Remova as mutações de fundo contaminantes por meio de retrocruzamento pelo menos três vezes para um genoma do tipo selvagem contendo o marcador fluorescente orgânico desejado, conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar o mapeamento, use o minikit de plantas cogen DN Easy Z para extrair aproximadamente três microgramas de DNA genômico de M três, que representa o DNA mutante homozigoto de Columbia. Envie este DNA para o sequenciamento do analisador de genoma Illumina dois 14.

O próximo passo é cruzar o zago mutante Colômbia com Las Berger para gerar a única progênie após a autopolinização na qual a combinação pode ocorrer. A geração de dentes surdos resultará e, finalmente, servirá como uma população de mapeamento contendo o gene de interesse, que está causando a mutação. Ao comparar o DNA genômico dessa população com o DNA genômico de plantas do tipo poço, a localização da mutação pode ser identificada no genoma.

Após o crescimento das duas plantas F, reúna entre 70 e 100 F dois indivíduos mostrando o fenótipo aberrante e o mesmo número de F duas plantas com um fenótipo selvagem, colete um disco foliar de cada planta usando um punção inteiro. O disco foliar deve ser coletado de folhas da mesma idade. Para garantir quantidades semelhantes de DNA, as amostras podem ser processadas para extração genômica separadamente ou em grupos.

Nesse caso, é possível coletar de cinco a 10 amostras para cada tubo de orph final, de modo que haja menos tubos dos quais o DNA genômico deve ser extraído. Use o kit mestre de purificação de DNA de folhas de plantas puras para extrair o DNA genômico. O DNA genômico obtido de cada amostra pode então ser quantificado com um NanoDrop.

Em seguida, combinando a mesma quantidade de DNA de cada amostra até um total de 300 nanogramas, mantendo as amostras do tipo mutante e selvagem separadas para fazer a reação de marcação primeiro, adicione 60 microlitros de 2,5 x solução de primer aleatório e 42 microlitros de água. Depois de desnaturar o DNAA acima de 95 graus Celsius por cinco a 10 minutos, chame as amostras no gelo para desnaturar o DNA. Adicione 15 microlitros de 10 X DN tps.

Misture com biotina DCTP e complete com três microlitros. Glen polimerase. Incube as amostras durante a noite a 25 graus Celsius.

No dia seguinte, adicione 15 microlitros de acetato de sódio de três molares e 400 microlitros de etanol 100% frio. Incubar as amostras misturadas a 80 graus Celsius negativos durante uma hora após centrifugação a 20 500 vezes G durante 15 minutos. Lave o pellet com 500 microlitros de frio, 75% de etanol após uma segunda centrifugação.

Seque os grânulos de DNA a 37 graus Celsius por 10 minutos. Suspenda novamente os pellets em 100 microlitros de água e use cinco microlitros para verificar o rendimento e a qualidade de um gel bio. As principais reações de marcação aleatória foram carregadas em um gel 1%aros de um pool de plantas selvagens tipo F duas e de um pool de plantas F mutantes duas.

Como etapa final, envie 95 microlitros do tipo selvagem e da reação de marcação mutante para a arabidopsis do chip genético em uma hibridização de matriz de genoma. Após a digitalização da borracha, os arquivos CL de pontos resultantes obtidos são analisados usando nosso software. Depois de instalar nosso software, abra o programa e cole a string do biocondutor encontrada no procedimento escrito.

Em seguida, pressione a tecla return, que instalará os pacotes BIOCONDUCTOR padrão do site de array, genotipagem e mapeamento. Baixe e descompacte os arquivos listados no texto em uma nova pasta na área de trabalho. Permanecem os dados obtidos do experimento do chip genético no tipo selvagem C, L e mutante C.Agora copie os dados do chip genético para o tipo selvagem C e o mutante C na pasta.

Em seguida, abra o R para um computador. Clique em arquivo e, em seguida, clique em alterar diretório. Selecione a pasta que contém os arquivos, clique em área de trabalho de carregamento de arquivo e, em seguida, selecione A um V cinco R dados abertos, leia C do R usando o bloco de notas e copie todo o texto para R para um mac, clique em mis e, em seguida, clique em alterar diretório de trabalho.

Selecione a pasta que contém os arquivos. Clique em workspace load workspace file e selecione ATH one V five R data. Da mesma forma, abra o SFP R e o MAP R usando texto, edite e copie o texto para R na janela do console.

Uma mensagem aparecerá para pesquisar genes no recurso de informação Arabidopsis ou TAIR. Copie e cole o link encontrado no texto no navegador da Internet. Uma janela aparecerá e solicitará a abertura ou salvamento do arquivo.

Selecione salvar. Escolha um nome de arquivo e anexe a extensão. Faça x ls.

Em seguida, clique em salvar. Aqui é mostrado um resultado típico esperado. Depois de analisar os dados obtidos do gene chip Arabidopsis H one genome array, esta figura representa um exemplo de mapeamento da mutação zero Columbia usando o gene chip Arabidopsis, uma hibridização do genoma H one, onde as barras horizontais representam os limiares para detecção.

A mutação neste exemplo está localizada no cromossomo um, delimitado por barras verticais. Abra o arquivo dot XLS para encontrar a coordenada do mutante dentro da área mapeada. Nas leituras Illumina montadas do genoma mutante, identifique transições EMS específicas entre os polimorfismos de nucleotídeo único.

Uma vez dominada, a abordagem que descreve este protocolo pode ser usada para mapear o gene em um período de tempo curto em comparação com o método clássico de mapeamento.