Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

O objetivo geral deste procedimento é produzir modelos moleculares de alta precisão de vírus ou complexos macro-moleculares aplicando análise de partículas únicas a imagens de super-resolução de estruturas com componentes marcados fluorescentemente. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da virologia, incluindo a arquitetura proteica de vírus complexos e como esta se altera ao longo da infecção. A principal vantagem desta técnica é que, ao coletar múltiplas imagens da mesma estrutura, torna-se possível gerar um mapa de alta precisão de seus componentes.

Embora este método possa fornecer informações sobre a estrutura de vírus, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros patógenos e complexos macromoleculares dentro de células de mamíferos. Primeiro, obtenha imagens da amostra por microscopia de fluorescência de super-resolução. Adquira imagens de diversos campos de visão contendo centenas a milhares de partículas bem separadas, sem estruturas fluorescentes indesejadas.

Uma vez que as imagens tenham sido obtidas e processadas, importe e concatene as imagens em uma pilha com canais intercalados. Se necessário, converta a imagem concatenada de uma hiper-pilha para uma pilha. Em seguida, selecione "Extrair Estruturas Virais" no submenu VirusMapper e defina o caminho do arquivo para as partículas extraídas.

Preencha o número de canais de fluorescência capturados. Defina o canal de referência como o canal de fluorescência em que as partículas apresentam a aparência mais consistente. Se essas partículas não possuírem um máximo central, aplique uma difusão gaussiana pré-detecção para induzir a aparência de um.

Em seguida, estime o diâmetro em pixels das partículas maiores. Ajuste o raio da ROI para um valor ligeiramente superior à metade desse valor. Estime o número de ROIs necessário por quadro.

Use inicialmente não mais de cem ROI. Defina a sobreposição máxima de ROI com base na separação das partículas. Visualize as ROI para esse quadro.

Ajuste o raio, o número de ROI e a sobreposição máxima para que cada partícula no quadro seja cercada por uma única ROI. Certifique-se de que as ROI tenham pelo menos algumas pixels a mais do que as partículas maiores. Em seguida, clique em OK para executar a segmentação.

Feche a imagem da amostra no gerenciador de ROI após a extração. Não renomeie os conjuntos de partículas extraídos. Selecione Gerar Sementes e abra a pasta contendo os dados das partículas extraídas.

Defina o canal de referência e selecione todos os canais para os quais uma semente deve ser gerada. Se necessário para corresponder a modelos anteriores, rotacione as sementes em noventa graus. Para canais nos quais as partículas não possuem um máximo central, aumente o valor do desfoque gaussiano de pré-alinhamento como antes.

Se os canais não estiverem alinhados corretamente, ative a correção de deslocamento para os canais não referência. Procure na sequência de partículas uma estrutura que apareça de forma consistente. Identifique uma partícula representativa e insira o número do quadro correspondente no campo "Quadros a utilizar".

Reviseão as sementes resultantes. A seleção de sementes é uma etapa crítica deste procedimento. Examine os dados brutos cuidadosamente para identificar uma ou múltiplas estruturas a serem modeladas.

A qualidade do modelo depende muito da escolha de sementes que reflitam com precisão essas estruturas. Ajuste o canal de referência, o raio do desfoque gaussiano e a correção de deslocamento conforme necessário para otimizar a identificação de quadros adicionais com sementes semelhantes. Continue adicionando quadros e ajustando os parâmetros de geração até que a estrutura média represente melhor uma estrutura observada nos dados.

Digite o nome da pasta e o prefixo do arquivo para as sementes. Clique em OK para salvar as imagens das sementes para modelagem posterior. Selecione Gerar Modelos Com Base nas Sementes e abra a pasta de partículas extraídas.

Carregue as médias das partículas iniciais para cada canal. Se estiver realizando a descoberta de estrutura baseada em referência, selecione um canal de referência para o alinhamento. Uma estrutura de partícula conhecida em um canal pode ser usada como referência para alinhar um segundo canal desconhecido.

Isso permite o mapeamento imparcial da estrutura desconhecida. Tenha em mente que a diferença cromática entre os canais deve ser corrigida previamente. Se a análise estiver buscando pequenas diferenças ou características sutis no modelo, selecione Intensidade de imagem quadrada durante a correspondência de modelos.

Defina a similaridade mínima entre sessenta e oitenta por cento e o número de iterações como um. Selecione os modelos e partículas que serão exibidos durante o cálculo e gere os modelos de visualização. Examine os modelos de visualização.

Aumente a similaridade mínima para incluir apenas partículas com a morfologia desejada. Otimize outros parâmetros de cálculo do modelo conforme necessário e selecione elementos adicionais durante o processo de geração do modelo para exibição, se desejado. Uma vez que os modelos de visualização estejam satisfatórios, aumente o número de iterações para dez.

Defina o nome da pasta e o prefixo do arquivo. Clique em OK para salvar as pilhas de evolução do modelo contendo todas as iterações do modelo final. Um vírus Vaccinia recombinante com duas proteínas marcadas com proteínas fluorescentes verde e vermelha foi imagiado por microscopia de iluminação estruturada e modelado com o plug-in VirusMapper.

As sementes foram geradas separadamente para as orientações frontal e sagital, sendo cada uma média de cinco partículas representativas. Dependendo da orientação do vírus, pode-se distinguir um ou dois corpos laterais. Portanto, podem ser gerados modelos separados para as duas orientações.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos modelos depende amplamente da qualidade dos dados brutos adquiridos. Embora a análise de partículas isoladas possa aumentar a precisão, ela não pode compensar imagens de baixa qualidade. Após este procedimento, podem ser realizadas quantificações adicionais ou ajustes de modelos sobre esses modelos.

Isso pode ajudar a responder perguntas adicionais especificamente sobre, por exemplo, alterações em escala nanométrica na arquitetura viral durante a infecção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o software de análise de partículas individuais VirusMapper para gerar modelos de arquitetura molecular a partir de imagens de super-resolução.