Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

O objetivo geral deste procedimento é produzir modelos moleculares de alta precisão de vírus ou complexos macromoleculares, aplicando análise de partícula única a imagens de super-resolução de estruturas com componentes marcados com fluorescência. Este método pode responder a questões-chave no campo da virologia, incluindo a arquitetura de proteínas de vírus complexos e como isso muda durante o curso da infecção. A principal vantagem desta técnica é que, ao coletar várias imagens da mesma estrutura, torna-se possível gerar um mapa de alta precisão de seus componentes.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a estrutura dos vírus, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros patógenos e complexos macromoleculares dentro de células de mamíferos. Primeiro, obtenha imagens da amostra com microscopia de fluorescência de super-resolução. Adquira imagens de vários campos de visão contendo centenas a milhares de partículas bem separadas, sem estruturas fluorescentes indesejadas.

Depois que as imagens forem obtidas e processadas, importe e concatene as imagens em uma pilha com canais intercalados. Se necessário, converta a imagem concatenada de uma hiperpilha em uma pilha. Em seguida, selecione Extrair estruturas virais"no submenu VirusMapper e defina o caminho do arquivo para as partículas extraídas.

Preencha o número de canais de fluorescência fotografados. Defina o canal de referência para o canal de fluorescência no qual as partículas têm a aparência mais consistente. Se essas partículas não tiverem um máximo central, aplique o desfoque gaussiano de pré-detecção para induzir o aparecimento de um.

Em seguida, estime o diâmetro em pixels das partículas maiores. Defina o raio de ROI para um pouco mais da metade desse valor. Estime o número de ROIs necessários por quadro.

Não use mais do que cem ROIs inicialmente. Defina a sobreposição máxima de ROI com base na separação de partículas. Visualize os ROIs para esse quadro.

Ajuste o raio, o número de ROIs e a sobreposição máxima para que cada partícula no quadro seja incluída em uma única ROI. Certifique-se de que os ROIs sejam pelo menos alguns pixels mais largos do que as partículas maiores. Em seguida, clique em OK" para executar a segmentação.

Feche a imagem de amostra no gerenciador de ROI após a extração. Não renomeie os conjuntos de partículas extraídos. Selecione Gerar sementes"e abra a pasta que contém os dados de partículas extraídos.

Defina o canal de referência e selecione todos os canais para os quais uma semente deve ser gerada. Se necessário para combinar com os modelos anteriores, gire as sementes em noventa graus. Para canais nos quais as partículas não têm um máximo central, aumente o valor de desfoque gaussiano de pré-alinhamento como antes.

Se os canais não estiverem alinhados, ative a correção de deslocamento para os canais não referenciados. Pesquise na sequência de partículas uma estrutura que aparece consistentemente. Identifique uma partícula representativa e insira o número do quadro correspondente no campo Quadros a serem usados".

Revise as sementes resultantes. A seleção de sementes é uma etapa crítica deste procedimento. Visualize os dados brutos com cuidado para identificar uma ou várias estruturas a serem modeladas.

A qualidade do modelo é altamente dependente da escolha de sementes que reflitam com precisão essas estruturas. Ajuste o canal de referência, o raio de desfoque gaussiano e a correção de deslocamento conforme necessário para otimizar a identificação de quadros adicionais com sementes semelhantes. Continue adicionando quadros e ajustando os parâmetros de geração até que a estrutura média represente melhor uma estrutura observada nos dados.

Digite o nome da pasta e o prefixo do arquivo para as sementes. Clique em OK" para salvar as imagens iniciais para modelagem posterior. Selecione Gerar modelos com base em sementes"e abra a pasta de partículas extraídas.

Carregue as médias de sementes para cada canal. Se estiver fazendo a descoberta de estrutura baseada em referência, selecione um canal de referência para alinhamento. A estrutura de partículas conhecida em um canal pode ser usada como referência para alinhar um segundo canal desconhecido.

Isso permite o mapeamento imparcial da estrutura desconhecida. Lembre-se de que a mudança cromática entre os canais deve ser corrigida com antecedência. Se a análise estiver procurando por pequenas diferenças ou recursos sutis no modelo, selecione Intensidade da imagem quadrada durante a correspondência do modelo.

Defina a semelhança mínima entre sessenta e oitenta por cento e o número de iterações como um. Selecione os modelos e as partículas a serem mostrados durante o cálculo e gere os modelos de visualização. Inspecione os modelos de visualização.

Aumente a semelhança mínima para incluir apenas partículas com a morfologia desejada. Otimize outros parâmetros de cálculo do modelo conforme necessário e selecione elementos adicionais no processo de geração do modelo a serem mostrados, se desejado. Quando os modelos de visualização estiverem satisfatórios, aumente o número de iterações para dez.

Defina o nome da pasta e o prefixo do arquivo. Clique em OK" para salvar as pilhas de evolução do modelo que contêm todas as iterações do modelo final. Um vírus Vaccinia recombinante com duas proteínas marcadas com proteínas fluorescentes verdes e vermelhas foi fotografado por microscopia de iluminação estruturada e modelado com o plug-in VirusMapper.

As sementes foram geradas separadamente para as orientações frontal e sagital, cada uma com média de cinco partículas representativas. Dependendo da orientação do vírus, um ou dois corpos laterais podem ser distinguidos. Portanto, modelos separados podem ser gerados para as duas orientações.

Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a qualidade dos modelos depende muito da qualidade dos dados brutos adquiridos. Embora a análise de partícula única possa aumentar a precisão, ela não pode compensar imagens de baixa qualidade. Seguindo este procedimento, uma quantificação adicional ou um ajuste do modelo podem ser feitos nesses modelos.

Isso pode ajudar a responder a perguntas adicionais especificamente sobre, por exemplo, mudanças em escala nano na arquitetura viral durante a infecção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o software de análise de partícula única VirusMapper para gerar modelos de arquitetura molecular a partir de imagens de super-resolução.