Name: De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a detectar mutações somáticas de baixa frequência usando PCR de bloqueio de tipo selvagem e sequenciamento direto. Este método altamente sensível analisa amostras de medula óssea para mutações no gene myd88.

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Os autores não têm agradecimentos.

Declaração de Ética: Todos os testes de amostras humanas foi realizada após a obtenção Institutional Review Board aprovação (IRB). 1. Extracção de DNA a partir de FFPE tecido, sangue periférico, medula óssea e Aspirar <ol><li> Para osso tecido FFPE medula com o kit de extracção de ADN FFPE <ol><li> Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura). NOTA: Se início com aparas de tecido, usar 3 - 6 secções de 5 - 10? M de espessura e avance para o passo 1.1.6. </li><li> Colocar as lâminas em um carrinho deslizante e preparar quatro reservatórios de lavagem (duas por xileno e duas para 100% de álcool). Adicionar um volume mínimo de 600 ml de solução para cada carrinho. </li><li> Desparafinar as lâminas fazendo uma lavagem de xileno 5 min na primeira bandeja. Transferir as lâminas para o segundo reservatório de lavagem xileno durante um adicional de 5 min. </li><li> Após desparafinizao, lavar as lâminas com uma álcool 100% durante 5 min. Transferir as lâminas para a segundareservatório de lavagem de álcool durante um adicional de 5 min. </li><li> Permitir que as lâminas secar completamente sob uma capa antes raspando-as com uma lâmina de barbear para um tubo de microcentrífuga. NOTA: Se um slide de H &amp; E com a região do tumor indicado está disponível, alinhar as lâminas e raspar apenas a região do tumor. </li><li> Prossiga com as instruções do fabricante folheto incluídos no kit. </li></ol></li><li> Para BM aspirado e sangue periférico <ol><li> Extracto de acordo com as instruções folheto do fabricante com estas especificações. NOTA: Existem numerosos conjuntos e métodos de extracção de ADN a partir de tecidos e células FFPE disponíveis comercialmente. Praticamente, todos podem ser utilizados. Use um método que é criada em laboratório. <ol><li> Use 200 uL de sangue periférico (PB) ou 100 ul BM + 100 uL de PBS. </li><li> Use 4 uL de RNase A solução estoque. </li><li> Eluir com 100 mL de tampão de eluição. </li></ol></li></ol></li><li> Quantificação de DNA<ol><li> Medir as concentrações de ADN, utilizando um espectrofotómetro de assegurar um / A280 nm 260 nm de aproximadamente 1,8 (para o ADN puro). Se a proporção é sensivelmente menor, que pode indicar a presença de proteína, de fenol, ou outros contaminantes que podem interferir com as aplicações a jusante. </li><li> Ajustar as concentrações de ADN de, aproximadamente, 50 - 100 ng / mL com tampão de eluição adequado. </li></ol></li></ol> 2. Bloqueio de Tipo Selvagem de PCR <ol><li> projeto Primer <ol><li> Concepção e obtenção de iniciadores para genes de interesse de acordo com o anteriormente descrito orientações gerais do projecto de iniciador de PCR 13. Incluem-M13 para frente e reverso iniciadores de sequenciação universais em iniciadores de PCR. NOTA: O ensaio de MyD88 foi desenvolvido para amplificar o exão 5 de MyD88 (G259 - N291) e 110 nucleótidos localizados na região 5&#39; intrónica para cobrir o local de splicing e parte do intr 4. O directo e inverso foram concebidos iniciadores com um 5&#39; -M13 sequência (H13-forward: tgt aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverso: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) para permitir a hibridação dos iniciadores de sequenciação complementares (ver Materiais Tabela). </li></ol></li><li> Ácido nucléico bloqueado Oligonucleotide projeto <ol><li> Desenhar o oligonucleótido de bloqueio para ser de aproximadamente 10 - 15 bases de comprimento e complementar ao modelo WT, onde é desejado o enriquecimento mutante. NOTA: Um oligo mais curto irá melhorar a discriminação incompatibilidade. Para alcançar alta especificidade alvo, é importante para não usar demais nucleotídeos bloqueio pois isso pode resultar em um oligonucleotídeo muito &quot;pegajoso&quot;. O conteúdo e o comprimento de nucleótidos e bloqueio deve ser optimizar de acordo com as sequências de nucleótidos específicas que têm de ser bloqueados. É importante para conseguir a especificidade de ligação de elevada sem comprometer a estrutura secundária e correr o risco de auto-complementaridade. </li><li> Conceber o oligo de bloqueio para ter uma Tm de 10 - 15 ° C acima da temperat extensãoure durante ciclos tmicos. Ajustar a Tm por adição ou remoção de bases de bloqueio ou por substituição de bases de bloqueio para o ADN, evitando trechos longos (3 - 4 bases) de bloqueio de bases G ou C. <ol><li> Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o &quot;bloqueio Oligo Tm Prediction&quot; ferramenta. </li><li> Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa &quot;Oligo Sequência&quot;. Adicionar &quot;+&quot; na frente de bases para indicar bases bloqueador. </li><li> Selecione o botão &quot;Calcular&quot; para determinar o aproximada T m do híbrido de ADN-Blocker. </li></ol></li><li> Conceber o oligo de bloqueio para evitar a formação de estruturas secundárias ou auto-dímeros. <ol><li> Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o &quot;bloqueio Oligo Optimizer&quot; ferramenta. </li><li> Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa. Adicionar &quot;+&quot; na frente de bases para indicar o bloqueio bases. </li><li> Selecione as duas caixas para &quot;estrutura secundária&quot; e &quot;Self Only&quot;. Pressione o botão Analisar para analisar o oligo de estruturas secundárias potencialmente problemáticos ou auto-dímeros. NOTA: As pontuações representam estimativas muito grosseiras da T m &#39;s das estruturas secundárias e auto-dímeros. As pontuações mais baixas são portanto ideal e pode ser conseguida limitando bloqueador-bloqueador de emparelhamento. O oligonucleótido bloqueador para MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + D + G + A + T + CC / invdT /)] foi concebida para cobrir aminoácidos Q262-I266 e apresenta uma 3&#39;-invertida dT para inibir tanto a extensão por polimerase de ADN e da degradação por 3&#39;-exonuclease. Este oligo bloqueio específico é um 17-mero com 10 bases de bloqueio que são denotados como &quot;+ N&quot;. Os restantes 7 bases são nucleótidos de ADN comuns. </li></ol></li></ol></li><li> Configuração WTB-PCR e ciclos de temperatura <ol><li> Preparar um WTB-PCR mi mestrex (MMX) utilizando 2,5 mL de PCR de tampão de reacção 10 x w / 20 mM de MgCl2, 250 ^ M de dNTP, 0,2 uM iniciador directo e inverso, 1,2 uM MYD88blocker, e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma definitiva volume da solução de 21,75 mL por reacção. NOTA: Trabalhando concentrações referem-se ao volume de reacção final de 25 ul (após a adição de DNA molde e polimerase). PCR convencional MMX é preparado por simplesmente omitindo a adição do bloqueador. Todos os passos do protocolo permanecem idênticas para ambos WTB e PCR convencional. Isso pode ser usado em validação e determinação de enriquecimento alcançado pela adição de bloqueador. <ol><li> Ao calcular a quantidade de MMX para preparar a certificar-se de que são responsáveis ​​por reacções adicionais 3 (controlos positivos e negativos e um controlo não-modelo para verificar se há contaminação) e pelo menos uma reacção adicional para erros de pipetagem. </li></ol></li><li> Vortex MMX completamente. A MMX pode ser armazenado a -80 ° C durante até ayorelha. </li><li> Adicionar 0,25 mL de Taq DNA polimerase por reacção à MMX e invertido para misturar. Uma vez que a polimerase foi adicionado à MMX, mantê-lo em gelo. </li><li> Colocar uma nova placa de 96 poços de PCR sobre uma placa fria e pipeta de 22 uL da MMX com polimerase, para cada cavidade de reacção. </li><li> Adiciona-se 3 mL de ADN genómico (50 - 100 ng / mL para cada um dos poços que contêm a MMX com polimerase. </li><li> Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço. </li><li> Carregar a placa de PCR num termociclador. <ol><li> Definir as condições de termociclização para a reacção WTB-PCR como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 6 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento de iniciador a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensão final a 72 ° C durante 10 min. NOTA: Melhor prática envolve completar o restante do protocolo em uma área separada fisicamente para evitar a contaminação amplicon in futuras configurações. </li></ol></li></ol></li><li> Efectuar a electroforese de gel de acordo com protocolos anteriormente descritos 14, a fim de determinar se WTB-PCR foi bem sucedida e para confirmar a falta de amplificação no controlo não-molde. </li><li> Purificação de PCR produtos por esferas magnéticas <ol><li> Remover esferas magnéticas a partir de 4 ° C e trazer para a temperatura ambiente. </li><li> Transferir 10 uL do produto de PCR para uma nova placa de PCR. </li><li> Vortex as esferas magnéticas vigorosamente para voltar a suspender totalmente as partículas magnéticas. </li><li> Adicionar 18 mL esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipeta misturar 10 vezes. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Colocar a placa de PCR para a placa de íman contornado-lado durante 2 minutos para separar as pérolas da solução. </li><li> Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de canais múltiplos, evitando-se o sedimento de grânulo. </li><li> Dispensar 150 uL de 70% de etanol a cada poço e incubar à temperatura ambiente for pelo menos 30 s. Aspirar o etanol com uma pipeta multicanal e descartar dicas. Repetir este procedimento de lavagem mais uma vez. </li><li> Usando uma pipeta de múltiplos canais 20 uL aspirar o etanol remanescente a partir de cada cavidade e descartar dicas. </li><li> Depois dos poços são secos (~ 10 min), remover da placa íman e adicionar 40 uL de água livre de nuclease a cada poço e mistura pipeta 15 vezes ou vórtice suavemente. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Colocar a placa de PCR no prato íman durante 1 min para separar as pérolas a partir de solução. </li><li> Transferência de 35 uL de produto purificado para uma nova placa de PCR. Este produto de PCR é purificado é agora pronto para prosseguir com a sequenciação bidireccional ou pode ser armazenado a -20 ° C até ser necessário. Nota: Quando o desenvolvimento de um novo ensaio, a quantificação de produto de PCR purificado pode ser necessária. 1-3 ng de ADN amplic / uL é ideal para sequenciação bi-direccional. Se a concentração é consistentemente baixa, aumentar o produto de PCR e magnéticos grânulos proportionally (1: 1,8). Se a concentração é consistentemente elevado, elui-se com um maior volume de água. </li></ol></li></ol> 3. Sequência de WTB-PCR produtos <ol><li> Sequenciamento Bi-direcional NOTA: O protocolo seguinte é uma forma modificada de instruções do fabricante que foi optimizado para usar menos reagentes. <ol><li> Preparar para a frente e reverso reacção de sequenciação mistura-se com 0,25 mL Pronto mistura de reacção, 1,88 mL Sequenciação Tampão, 1,78 uM M13-F ou M13-R iniciadores de sequenciação e adicionar e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma solução final volume de 9 mL por reacção. Esta mistura de reacção de sequenciação pode ser armazenado a -20 ° C durante até um ano. </li><li> Pipeta 9 pL da mistura de reacção de sequenciação para a frente em cada poço de uma nova placa de 96 poços de PCR para a reacção de sequenciação para a frente. Repetir em uma placa separada para a reacção de sequenciação reversa. </li><li> Adicionar 1 mL do produto purificado t WTB-PCRO cada poço em ambas as placas para a frente e reverso. </li><li> Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço. </li><li> Carregar a placa de PCR num termociclador. <ol><li> Definir as condições de termociclização para a reacção de sequenciação como se segue: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 4 min; manter a 4 ° C até estar pronta para purificação. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar Sequencing produtos <ol><li> Prepara-se uma solução 01:25 de acetato de fresco de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100%. </li><li> Prepara-se uma solução fresca de etanol a 70%. </li><li> Adicionar 30 ul de acetato de sódio / solução de etanol a 100% a cada poço de ambas as placas para a frente e inverso de sequenciação e mistura pipeta de 5 vezes. </li><li> Selar a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar a placa a 2250 xg durante 15 min. </li><li> Remova o vedante de placa e inverta sobre um desperdíciorecipiente. NOTA: Inverter apenas uma ou a pelota pode soltar a partir do fundo bem. </li><li> Colocar a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugar a 150 xg durante 1 min. </li><li> Adicionar 150? L de 70% etanol a cada poço. </li><li> Selar a placa e girar a 2250 xg durante 5 min. </li><li> Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7. </li><li> Se os poços não são completamente seca, permitir-lhes secar ao ar à temperatura ambiente. Certifique-se as amostras são protegidas da luz durante a secagem. </li><li> Adicionar 10 mL de formamida a cada poço e pipeta mix 10 vezes. Selar a placa. </li><li> Desnaturar no termociclador a 95 ° C durante 3 minutos seguido de 4 ° C durante 5 min. </li><li> Após desnaturação, substituir o vedante de placa com um septo e a sequência na plataforma de sequenciação de acordo com as instruções do fabricante 15. </li></ol></li></ol> 4. Análise dos Resultados Sequencing <ol><li> Visualizar os traços de sequenciação utilizando um dat sequenciaçãoum software de análise de acordo com as instruções do fabricante 16 e alinham com as respectivas sequências de referência. MyD88 alinhar a sequcia de refercia do NCBI &quot;NM_002468&quot;. </li></ol>

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<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio WTB-PCR descrita aqui utiliza um conjunto genérico de iniciadores com um oligo de bloqueio concebido para bloquear a amplificação de ADN WT durante a extensão (Figura 1). O produto WTB-PCR é, em seguida, sequenciados para análise mutacional. O utilitário de WTB-PCR / Sanger reside na sua simplicidade, de alta sensibilidade, e de alto rendimento. Usando as diretrizes descritas aqui, a maioria dos ensaios baseados em Sanger existentes podem ser simplesmente modificadas por meio da adição de um ol...

Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 - 20% alelo mutante em um fundo de WT) 1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a terapia difícil por sequenciação convencional sozinho 2. Através da substituição de PCR convencional com ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo selvagem bloqueio de PCR (WTB-PCR), na sequenciação de Sanger, sensibilidades de até 0,1% alelo mutante em um fundo de WT pode ser obtida 2, 3, 4. DentroWTB-PCR, o enriquecimento para os alelos mutantes é conseguido através da adição de uma pequena (~ 10-14 NT) de bloqueio (LNA) oligonucleótido que se liga preferencialmente ao ADN WT impedindo assim a amplificação de ADN WT. O produto WTB-PCR enriquecido mutante pode em seguida ser sequenciados. Ao bloquear ADN WT em vez de seleccionar para mutações específicas WTB-PCR permite o enriquecimento de ambas as mutações conhecidas e desconhecidas presentes em fracções celulares hora. Vários métodos são actualmente utilizados para a detecção de mutações em fracções de células pequenas. Isto inclui por PCR, do sistema específico de alelo amplificação refractário mutação (ARMS), desnaturante cromatografia líquida de alta eficiência (DHPLC), grânulos, emulsões, amplificação, e magnetos (radiante), libertação induzida por um campo eléctrico e de medição (Efirm), de alta resolução ponto de fusão e outros. No entanto, a maioria desses métodos são limitados por falsos positivos e a capacidade de detectar apenas uma mutação que o ensaio foi concebido para quatro </sup&gt;. WTB-PCR, no entanto, permite ao utilizador visualizar os traços de sequenciação que permite a detecção de vários tipos de mutação e podem auxiliar na exclusão de falsos positivos devido a artefactos ou eventos de desaminação. sequenciação próxima geração (NGS) pode oferecer uma alternativa adequada para a sequenciação convencional, no entanto, substancialmente maiores custos, complexidade e tempo de ensaio mais o tornar uma opção desnecessária para muitos tipos de doenças com alguns marcadores moleculares distintos ou para a monitorização de pacientes em terapia para emergente mutações de resistência. Além disso, as altas taxas de falsos positivos, quando detectam variantes com frequências de alelos mutantes de menos de 5% pode representar um problema para NGS à base de amplicon 5, 6. Aqui demonstramos o aumento da sensibilidade obtida por WTB-PCR em rastreio de mutações no gene de diferenciação mielóide factor de 88, tal como descrito por Albitar et al. Mutatio 3 MyD88ns são factores de diagnóstico e prognóstico importantes em Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM monoclonal gamopatia de significado desconhecido (IgM-MGUS), linfoma da zona marginal esplénica (SMZL), e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). MyD88 mutações são encontrados em quase todos os casos de WM e aproximadamente 50% dos pacientes com Imunoglobulina M (IgM) secretores MGUS. Em contraste, as mutações MyD88 são encontrados em apenas 0-6% dos doentes com SMZL e estão ausentes no mieloma múltiplo 7, 8. Porque morfológica sobreposição, imunofenotípicas, citogenética, e características clínicas entre WM e SMZL ou mieloma múltiplo IgM muitas vezes pode complicar o diagnóstico diferencial, a presença de uma mutação MyD88 pode servir como um factor de identificação útil 9. MyD88 mutações também têm sido associadas com uma maior carga da doença em pacientes com DLBCL e sobrevivência global pobre seguintes terapia 7, </sup&gt; 10. Além disso, porque as mutações MyD88 são mais frequentemente encontrados na célula B semelhante (ABC) DLBCL activada do que o centro germinal B-célula-like (GCB) DLBCL ou linfoma de células B do mediastino primário (PMBL), estado de mutação MyD88 pode servir como um marcador substituto para o subtipo de ABC 11, 12. O protocolo detalhado fornecida aqui serve como um molde a partir do qual novos ensaios podem ser desenvolvidos ou a maioria dos ensaios de sequenciação existentes podem ser facilmente adaptadas para detectar com precisão as mutações de baixa frequência em vários tipos de amostras. A abordagem também pode ser utilizada para monitorar e detectar mutações resistentes que podem desenvolver-se tumores ou mesmo bactérias que podem desenvolver enquanto os pacientes estão a ser tratados com terapia direcionada ou antibióticos. Além disso, aborda e remédios muitos dos problemas associados com o enriquecimento de mutação, especialmente no tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE).

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safe-Lock de 1,5 ou 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Álcool 100%</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Grau de histologia; 91,5% Etanol, 5% Álcool isopropílico, 4,5% Álcool metílico</td></tr><tr><td>3730XL sequenciador</td><td>ABI</td><td></td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Para purificação de PCR de esferas magnéticas</td></tr><tr><td>Alumínio folhas de vedação</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Para PCR e armazenamento a frio</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit de sequenciamento de ciclo</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Para sequenciamento bidirecional. Com 5x Centrífuga de Tampão de Sequenciamento</td></tr><tr><td>Série 5804</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP rotor (para placa PCR)</td></tr><tr><td>Placa fria para placas de 96 poços</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, livre de RNAse, água</td><td></td><td></td><td></td>ultra-pura</tr><tr><td>dNTPs (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Ímã de Saia Lateral</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Para uso em purificação de PCR.</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 provas, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Exiqon website Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polimerase (5 U/&micro; L)</td> <td>Roche</td><td>12032937001</td><td>Com tampão de reação PCR concentrado 10x, com 20 mM MgCl2</td></tr><tr><td>aparelho de eletroforese</td><td></td><td></td> em <td>gel de agarose</td></tr><tr><td>2% GeneRead DNA FFPE extraction Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Contém uracil DNA glicosilase necessário para reduzir artefatos de sequenciamento</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamida</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>Para sequenciamento.</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo LNA</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = bases LNA)</td></tr><tr><td>M13-F Sequenciamento Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequenciamento</td><td>Primer ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Modelo 5430</td><td>Rotor Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 (para tubos de microcentrífuga de 1,5/2 mL)</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR primer reverso</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR placas</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &micro; </td></tr><tr><td>L Septa de placa, 96 poços</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Para aspirado de BM e sangue periférico</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Para análise de sequenciamento</td></tr><tr><td>Cesta</td><td></td><td></td><td></td>de slides</tr><tr><td>Acetato de Sódio (3 M, pH 5.2)&nbsp;</td><td>Ponteiras</td><td></td> de pipeta filtradas estéreis Sigma S7899 <td></td></tr><tr><td></td> 20, 200, 1,000 &micro;<td></td><td></td><td> L</td></tr><tr><td>Termomixer C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório</td><td></td><td></td> de lavagem<td>~ 1.000 mL</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Grau de histologia</td></tr></tbody></table>

de tipo selvagem bloqueio de pcr combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de baixa frequência mutações somáticas

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

A detecção precisa e identificação de mutações de baixa frequência pode ser problemática quando se avalia doença residual após terapia, o rastreio de mutações de resistência emergente durante a terapia, ou quando os pacientes têm poucas células tumorais circulantes. De tipo selvagem bloqueio de PCR seguido por análise de sequenciação oferece alta sensibilidade, flexibilidade e simplicidade como uma metodologia para detectar essas mutações de baixa frequência. Ao adicionar um projetado bloqueado oligonucleótido ácido nucleico para um ensaio de sequenciação baseada em PCR convencional novo ou previamente estabelecida, sensibilidades de aproximadamente um alelo mutante de um fundo de 1.000 alelos WT pode ser conseguida (1: 1000). artefactos de sequenciação associados com eventos de desaminação comumente encontrados em tecidos embebidos em parafina fixados com formalina pode ser parcialmente remediada pela utilização de glicosilase de uracilo de ADN durante os passos de extracção. O protocolo optimizado aqui é específico para a detecção de mutação MyD88, mas pode servir como um modelo para conceber qualquerensaio WTB-PCR. As vantagens do ensaio de WTB-PCR em relação a outros ensaios vulgarmente utilizados para a detecção de mutações de baixa frequência, incluindo alelo específico PCR e PCR em tempo real quantitativo incluem menos ocorrências de falsos positivos, maior flexibilidade e facilidade de aplicação, e a capacidade para detectar tanto conhecida e mutações desconhecidas.

Uma visão geral conceitual de WTB-PCR durante a extensão é apresentado na Figura 1. Uma vez que um único nucleótido mal emparelhado o híbrido ADN-bloqueador diminui consideravelmente a sua temperatura de fus (? T m = 20 - 30 ° C), a amplificação do alelo WT é bloqueado enquanto ADN molde mutante é livre para completar a extensão 17. Neste modo, o DNA mutante é amplificada exponencialmente, enquanto ADN WT é amplificado linearmente. ...

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar mutações somáticas de baixa frequência em diversos tipos de amostras. Esta metodologia pode ajudar a responder perguntas-chave em testes de mutação somática, facilitando a detecção de mutações com frequência muito baixa. Aqui, procuraremos mutações no gene myd88 em amostras de medula óssea.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece informações altamente precisas e sensíveis sobre a presença de mutações somáticas, mesmo com um número muito pequeno de células neoplásicas. Este ensaio de sequenciamento baseado em PCR com bloqueio do tipo selvagem foi desenvolvido para amplificar parte do éxon cinco no gene myd88, garantindo a cobertura do sítio quente L265. Os primers direto e reverso foram desenhados com uma sequência M13 na extremidade cinco prima para permitir o uso de primers de sequenciamento complementares universais.Projete o oligonucleotídeo bloqueador com aproximadamente 10 a 15 bases de comprimento e complementar ao molde do tipo selvagem onde se deseja o enriquecimento do mutante. Um oligo mais curto melhorará a discriminação de descompasso. Para alcançar alta especificidade do alvo, é importante não usar muito dos nucleotídeos bloqueadores, pois isso resultará em oligonucleotídeos muito adesivos.Para projetar o oligonucleotídeo bloqueador, comece acessando o site Oligo Tools. Selecione a ferramenta de previsão de TM de oligonucleotídeos. Uma nova janela será aberta.Cole a sequência do modelo do tipo selvagem a ser bloqueado na caixa de sequência do oligonucleotídeo. Adicione um sinal de mais na frente das bases do bloqueador para marcá-las. Clique no botão calcular para determinar a TM aproximada do híbrido de DNA bloqueador.As temperaturas de fusão calculadas aparecerão nas caixas abaixo. Projete o oligonucleotídeo bloqueador para ter uma temperatura de fusão 10 a 15 graus Celsius acima da temperatura de extensão durante a termociclagem. Aqui, a temperatura de extensão é de 72 graus Celsius.Para ajustar a temperatura de fusão, adicione, remova ou substitua bases bloqueadoras. Evite trechos longos de três a quatro bases C ou G bloqueadoras. Em seguida, para evitar a formação de estrutura secundária ou dimerização autógena, retorne à tela inicial do site Oligo Tools e selecione a ferramenta Oligo Optimizer.Uma nova janela será aberta. Cole a sequência do modelo do tipo selvagem a ser bloqueado na caixa. Adicione um sinal de adição para indicar as bases bloqueadoras.Selecione as duas caixas para estrutura secundária e apenas auto e pressione o botão analisar para visualizar as pontuações para hibridização e estrutura secundária. Essas pontuações representam estimativas muito aproximadas das temperaturas de fusão dos dímeros próprios e das estruturas secundárias, respectivamente. Pontuações mais baixas são ideais e podem ser obtidas limitando o pareamento do bloqueador com o bloqueador.Remova ou reposicione nucleotídeos bloqueadores para obter pontuações mais baixas. O oligonucleotídeo bloqueador otimizado para myd88 mostrado aqui estabelece um equilíbrio entre a temperatura de fusão do híbrido do bloqueador de DNA e pontuações de hibridização e estrutura secundária suficientemente baixas. Foi projetado para cobrir os aminoácidos Q262 a I266 e possui um DT invertido na extremidade três prima para inibir tanto a extensão pela DNA polimerase quanto a degradação pelo exonuclease três prima.Após o planejamento dos iniciadores, monte a PCR com bloqueio do tipo selvagem e realize a termociclagem conforme descrito no documento anexo. Remova as microesferas magnéticas do armazenamento a quatro graus Celsius e leve-as à temperatura ambiente. Transfira 10 microlitros do produto de PCR para uma nova placa de PCR.Vortexe as esferas magnéticas vigorosamente para completar a ressuspensão completa das partículas magnéticas e, em seguida, adicione 18 microlitros das esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipeteie para cima e para baixo 10 vezes para homogeneizar. Incube, então, a placa à temperatura ambiente por cinco minutos.Após a incubação, coloque a placa de PCR sobre a placa magnética com bordas laterais por dois minutos para separar as microesferas da solução. Utilize uma pipeta multicanal para aspirar o sobrenadante. Tenha cuidado para evitar o pellet de microesferas.Em seguida, distribua 150 microlitros de etanol 70% em cada poço e incube a placa à temperatura ambiente por pelo menos 30 segundos. Em seguida, aspire o etanol com uma pipeta multicanal e descarte as ponteiras. Repita este procedimento de lavagem mais uma vez.Usando uma pipeta multicanal de 20 microlitros, aspire o etanol remanescente de cada poço e descarte as ponteiras. Após deixar os poços da placa secarem por cerca de 10 minutos, remova-a do ímã e adicione 40 microlitros de água livre de nucleases a cada poço. Pipete para cima e para baixo 15 vezes para homogeneizar.Em seguida, incubar à temperatura ambiente por dois minutos. Após a incubação, colocar a placa de PCR de volta na placa magnética por um minuto para separar as microesferas da solução. Transferir 35 microlitros do produto purificado para uma nova placa de PCR e realizar o sequenciamento bidirecional conforme descrito no documento anexo.Após a sequenciação bidirecional ter sido realizada, para purificar os produtos de sequenciamento, prepare uma solução fresca em 25 partes de acetato de sódio trimolar a PH 5,2 e etanol a 100%. Prepare também uma solução fresca de etanol a 70%. Em cada poço das placas de sequenciamento direta e reversa, adicione 30 microlitros de acetato de sódio em etanol a 100% e pipete para cima e para baixo cinco vezes para homogeneizar.Em seguida, resele o poço e incube no escuro, à temperatura ambiente, por 20 minutos. Após decorridos os 20 minutos, centrifugue a placa a 2.250 × g por 15 minutos. Após a centrifugação, remova o selo da placa e inverta-a uma vez sobre um recipiente de resíduos.Se a placa for invertida várias vezes, os pellets podem se soltar dos fundos das poças. Coloque a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugue a 150 vezes G por um minuto. Em seguida, adicione 150 microlitros de etanol 70% a cada poço e resele a placa.Centrifugar a 2.250 ×g durante cinco minutos. Em seguida, repita o processo de remoção do selante da placa e inversão da placa. Se as cavidades não estiverem completamente secas, deixe secar ao ar à temperatura ambiente.Certifique-se de que as amostras estejam protegidas da luz. Assim que os poços estiverem completamente secos, adicione 10 microlitros de formamida a cada poço e pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Selle novamente a placa.Desnaturar usando um termociclador a 95 graus Celsius por três minutos, seguido por quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a desnaturação, substituir o selante da placa por uma septa e sequenciar em uma plataforma de sequenciamento de acordo com as instruções do fabricante. Utilizando software de análise de sequência, visualizar os traços e alinhar as sequências às sequências de referência apropriadas.Alinhe myd88 à sequência de referência do NCBI NM002468. O DNA genômico de pacientes com e sem mutações foi submetido à PCR convencional e à PCR de bloqueio do tipo selvagem, e os produtos resultantes foram sequenciados. Como pode ser observado aqui, o alelo mutante foi enriquecido quando a PCR de bloqueio do tipo selvagem foi realizada, e não foram observados falsos positivos no DNA do tipo selvagem.Uma queda característica na intensidade do sinal, como mostrada aqui, é frequentemente observada quando se usa uma concentração muito alta do bloqueador ou quando a purificação pós-PCR não remove o bloqueador antes do sequenciamento bidirecional. Isso ocorre quando a purificação enzimática é realizada no lugar da purificação com esferas magnéticas. Qualquer ensaio baseado em PCR que enriqueça alelos mutantes detectará artefatos de baixa frequência.Esses traços mostram um aumento nos artefatos de sequenciamento CG, em relação aos artefatos TA em tecidos FFPE, quando citosina ou citosina metilada são desaminadas pela fixação em formalina, convertendo-se em uracila ou timina, respectivamente. A uracila-DNA glicosilase ou UDG pode remover a uracila antes da PCR com bloqueio do tipo selvagem, ajudando a reduzir os artefatos de sequenciamento. No entanto, a timina resultante da desaminação da cinco metil citosina, que ocorre com frequência nas ilhas CPG, não pode ser removida pela UDG.Diminuir a concentração do bloqueador utilizado na PCR de bloqueio de tipo selvagem pode ajudar a reduzir a ocorrência de artefatos de sequenciamento que não são corrigidos pelo tratamento com UDG. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar mutações somáticas com alto grau de precisão e sensibilidade, utilizando a técnica de bloqueio de tipo selvagem. O princípio desta tecnologia pode ser aplicado à detecção de mutações em pequenas subpopulações de células.Portanto, possui utilidade na detecção de doença residual mínima, no monitoramento de pacientes e na predição de recidiva precoce em pacientes com diversos neoplasmas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

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