Name: Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a engenhar fatores de splicing artificiais para manipular splicing alternativo específico em células humanas usando domínios PUF personalizados. Esta técnica flexível auxilia pesquisadores a estudar regulação de RNA em doenças como câncer.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R01-CA158283 e NSFC conceder 31400726 a ZWYW é financiado pelo Programa de Jovens Mil Talentos e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (subvenções 31471235 e 81422038). XY é financiado pela fundação de ciência pós-doutoral da China (2015M571612).

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<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
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<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este relatório fornece uma descrição detalhada para o projeto e construção de fatores artificiais de splicing que podem manipular especificamente o splicing alternativo de um gene alvo. Este método tira vantagem do modo de ligação de ARN único de repetições de PUF para produzir um andaime de ligação de ARN com especificidade personalizada. Ele pode ser usado para ativar ou reprimir splicing. A etapa crítica neste protocolo é a geração do domínio reprogramado PUF que define a especificidade d...

A maioria dos genes humanos sofrer splicing alternativo (AS) para produzir múltiplas isoformas com actividades distintas, o que tem aumentado grandemente a complexidade de codificao do genoma 1, 2. AS fornece um importante mecanismo para regular a funo do gene, e que é fortemente regulada através de diversas vias celulares em diferentes estágios de desenvolvimento e 3, 4. Porque splicing desregulação é uma causa comum de doenças humanas 5, 6, 7, 8, segmentação regulação de splicing é a tornar-se um percurso terapêutico atractivo. De acordo com um modelo simplificado de regulação de splicing, como é controlada principalmente por splicing Regulatory cis -Elements (SRE) em pré-ARNm que funcionam como intensificadores de splicing ou silenciadores de exs alternativos. ºEstas SREs recrutam especificamente vários fatores de proteína de transação ( isto é, fatores de splicing) que promovem ou suprimem a reação de splicing 3 , 9 . A maioria dos fatores de splicing em trans tem domínios de ligação de ARN específicos de seqüência separados para reconhecer seus alvos e domínios efetores para controlar splicing. Os exemplos mais conhecidos são os membros da família de proteínas ricas em serina / arginina (SR) que contêm Motivos de Reconhecimento de RNA N-terminais (RRMs), que se ligam a intensificadores de empasamento exónico e domínios RS C-terminais, que promovem a inclusão de exões 10 . Inversamente, o hnRNP A1 liga-se a silenciadores de empacotamento exónico através dos domínios RRM e inibe a inclusão do exão através de um domínio rico em glicina C-terminal 11 . Usando tais configurações modulares, os pesquisadores devem ser capazes de criar fatores de splicing artificial combinando um domínio de ligação a RNA específico (RBD) com diferentes efetor domínios que activam ou inibem a splicing. A chave de um tal desenho é a utilização de um RBD que reconhece dado alvos com especificidade de ligação de ARN programável, que é análogo ao modo de ligação do ADN do domínio história. No entanto, a maioria dos factores de splicing nativas conter RRM ou K Homologia (KH), que reconhecem os domínios elementos de ARN curtos com afinidade fraca e, portanto, carecem de um &quot;código de&quot; reconhecimento de ARN-proteína de previsão 12. O RBD de proteínas de repetição de PUF (isto é, o domínio PUF) tem um modo de reconhecimento de RNA original, permitindo a remodelação de domínios de PUF para reconhecer especificamente ARN de diferentes alvos 13, 14. O domínio PUF canónica contém oito repetições de três hélices a, cada um reconhecendo um único base num alvo de ARN 8-nt. As cadeias laterais de aminoácidos em certas posições das ligações de hidrogénio específicas segunda forma α-hélice com a borda de Watson-Crick de tele ARN base, que determina a especificidade de ligao de ARN de cada repetição (Figura 1A). O código de reconhecimento de ARN de base da repetição PUF é surpreendentemente simples (Figura 1A), permitindo a geração de domínios de PUF que reconhecem qualquer combinação de 8-base de possível (revisto por Wei Wang e 15). Este princípio de construção modular permite a geração de um Factor de Splicing Engineered (FSE) que consiste de um domínio PUF personalizado e um domio de modulao de splicing (isto é, um domínio SR ou um domínio Gli-rico). Estes ESF pode funcionar como activadores de splicing ou como inibidores para controlar vários tipos de eventos de splicing, e que provaram ser úteis como ferramentas para manipular o splicing de genes endógenos relacionados com a doença humana 16, 17. Como um exemplo, nós construímos ESF-Gli-tipo PUF para alterar especificamente o splicing do gene de Bcl-x, Convertendo a isoforma longa anti-apoptótica (Bcl-XL) ao curto isoformas pró-apoptótica (Bcl-XS). Mudando a relação entre a Bcl-x isoforma foi suficiente para sensibilizar várias células cancerosas a múltiplas drogas de quimioterapia anti-cancro 16, sugerindo que estes fatores artificiais podem ser úteis como reagentes terapêuticos potenciais. Além de controlar o splicing com domínios splicing efectoras conhecidos (por exemplo, um cabo RS ou domínio Gli-rica), os factores de PUF modificados também podem ser utilizados para examinar as actividades dos novos factores de splicing. Por exemplo, utilizando esta abordagem, que demonstraram que o domínio C-terminal de vias proteas SR pode activar ou inibir o splicing quando se ligarem a diferentes regiões pre-mRNA 18, que o motivo rico em alanina de RBM4 pode inibir o splicing 19, e que o motivo rico em prolina de DAZAP1 pode melhorar splicing 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Estes novos domínios funcionais podem ser utilizados para construir os tipos adicionais de fatores artificiais para afinar o splicing.

<table><tbody><tr><td>DNA polimerase de alta fidelidade (Phusion High-Fidelity) com tampão de PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligase (T4 DNA ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção lipossomal (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA tampão de extração (reagente de TRIzol)</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>reagente de TRIzol inclui fenol, que pode causar queimaduras. Use luvas ao manusear</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptase Reversa (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 anticorpo</td> Tecnologia <td>de Sinalização Celular</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo PARP</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Bcl-x</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo beta-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting reagentes de detecção</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de Células Ativadas por Fluorescência (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtre-esterilize e armazene a 4 &deg; </td></tr><tr><td>C Vector pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vector pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vector psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (livre de RNase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18</td><td>Primer Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo (IgG anti-camundongo, anticorpo ligado a HRP)</td> <td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de fatores artificiais para manipular especificamente splicing alternativo em células humanas

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

O processamento da maioria dos ARNs eucarióticos é mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) com configurações modulares, incluindo um módulo de reconhecimento de ARN, que se liga especificamente ao alvo pré-ARNm e a um domínio efector. Anteriormente, tomamos vantagem do modo de ligação de ARN único do domínio PUF em Pumilio 1 humano para gerar um andaime de ligação de ARN programável, que foi utilizado para criar várias RBPs artificiais para manipular o metabolismo de ARN. Aqui, descreve-se um protocolo detalhado para construir Factores de Splicing Engineered (ESFs) que são especificamente concebidos para modular o splicing alternativo de genes alvo. O protocolo inclui como conceber e construir um andaime PUF personalizado para um alvo de ARN específico, como construir um plasmídeo de expressão de ESF fundindo um domínio PUF de design e um domínio efector, e como utilizar ESFs para manipular o empalme de genes alvo. Nos resultados representativos deste método, descrevemos também os ensaios comunsdas actividades do FSE utilizando repórteres de splicing, a aplicação de FSE em células humanas em cultura, e o subsequente efeito de alterações de splicing. Ao seguir os protocolos detalhados neste relatório, é possível projetar e gerar ESFs para a regulação de diferentes tipos de splicing alternativo (AS), proporcionando uma nova estratégia para estudar regulação do splicing ea função de diferentes isoformas de splicing. Além disso, através da fusão de diferentes domínios funcionais, com um domínio PUF concebidos, os investigadores podem engendrar fatores artificiais que têm como alvo RNAs específicos para manipular vários passos de processamento do ARN.

Este relatório descreve o protocolo completo para a concepção e construção de ESFs e repórteres de splicing. Ele também delineia a aplicação de ESFs na manipulação da AS de genes endógenos [ 16] . Para ilustrar os resultados típicos de alterações de emenda mediadas por ESF, usamos os dados de nosso trabalho anterior como um exemplo. Os ESF com diferentes domínios funcionais podem ser utilizados para promover ou inibir a inclusão do exão de cassete alvo ( <strong c...

Este relatório descreve um método de bioengenharia para conceber e construir novos factores de splicing artificial (ASFS) que modulam especificamente a splicing de genes alvo em células de mamífero. Este método pode ser expandido para manipular vários fatores artificiais para manipular outros aspectos do metabolismo do ARN.

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

O objetivo geral deste protocolo é projetar fatores de splicing artificiais que possam manipular especificamente o splicing alternativo de um determinado alvo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do processamento de RNA, como a regulação e a má regulação do splicing alternativo em células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é sua flexibilidade.Podemos projetar fatores artificiais que promovem ou inibem diferentes tipos de splicing alternativo em qualquer gene. Demonstrando este procedimento estarão Huan-Huan, um pesquisador associado do meu laboratório, e Qianyun, um pós-doutorado em meu laboratório. O DNA PUF do tipo selvagem é usado como modelo para gerar o andaime de domínio PUF personalizado.Use primers de PCR contendo sequências PUF que reconhecem especificamente diferentes nucleotídeos de RNA em cada posição. Para cada repetição de PUF, use quatro primers diferentes para reconhecer uma base diferente em cada posição. Na primeira rodada de PCR, use os pares de primers mostrados para gerar sequências de codificação para quatro repetições PUF, fragmentos de ponte universal e fragmentos de tampa.Na segunda rodada, use os produtos de PCR gera

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5'-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células humanas para analisar os fatores de iniciação da tradução que se ligam à tampa 5' do mRNA durante condições fisiológicas de oxigênio. Este método utiliza um análogo de tampa m7GTP ligado à agarose e é adequado para investigar fatores de ligação de tampas e seus parceiros de interação.

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Aprenda a engenhar fatores de splicing artificiais para manipular splicing alternativo específico em células humanas usando domínios PUF personalizados. Esta técnica flexível auxilia pesquisadores a estudar regulação de RNA em doenças como câncer.

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

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