Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

O objetivo geral deste protocolo é projetar fatores de splicing artificiais que possam manipular especificamente o splicing alternativo de um determinado alvo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do processamento de RNA, como a regulação e a má regulação do splicing alternativo em células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é sua flexibilidade.

Podemos projetar fatores artificiais que promovem ou inibem diferentes tipos de splicing alternativo em qualquer gene. Demonstrando este procedimento estarão Huan-Huan, um pesquisador associado do meu laboratório, e Qianyun, um pós-doutorado em meu laboratório. O DNA PUF do tipo selvagem é usado como modelo para gerar o andaime de domínio PUF personalizado.

Use primers de PCR contendo sequências PUF que reconhecem especificamente diferentes nucleotídeos de RNA em cada posição. Para cada repetição de PUF, use quatro primers diferentes para reconhecer uma base diferente em cada posição. Na primeira rodada de PCR, use os pares de primers mostrados para gerar sequências de codificação para quatro repetições PUF, fragmentos de ponte universal e fragmentos de tampa.

Na segunda rodada, use os produtos de PCR gerados na última etapa como modelos com as combinações de primers mostradas para gerar sequências de codificação para os códigos de reconhecimento de RNA R-um a R-quatro e R-cinco a R-oito. Na terceira rodada, use os produtos da segunda rodada e faça a ponte quatro a cinco como modelos com o primer direto R-one e o primer reverso R-eight para gerar sequências de codificação para R-one a R-eight sem tampas. Na quarta rodada de PCR, use R-um a R-oito, tampa de extremidade de cinco primos e tampa de extremidade de três primos como modelos, para gerar sequências de codificação para domínios PUF completos.

Para iniciar a transfecção de células HEK-293T, misture o reagente de transfecção lipossomal invertendo suavemente os frascos. Em seguida, dilua dois microlitros de reagente de transfecção lipossomal em 50 microlitros de meio de soro reduzido por transfecção. Misture delicadamente e incube por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, diluir 04 microgramas de vetor de expressão de domínio rico em glicina e 0,2 microgramas do plasmídeo repórter de splicing modular em 50 microlitros de meio de soro reduzido em um tubo estéril. Em seguida, dilua 0,4 microgramas de vetor de expressão de domínio efetor RS e 0,2 microgramas de plasmídeo repórter PGZ-três em 50 microlitros de meio de soro reduzido. Por fim, dilua 0,4 microgramas do vetor de expressão PGL-RS-PUF e 0,2 microgramas de plasmídeos repórteres PEZ-1B ou PEZ-2F em 50 microlitros de meio de soro reduzido em um tubo estéril.

Após cinco minutos de incubação à temperatura ambiente, misture suavemente o reagente de transfecção lipossomal diluído com as misturas de plasmídeos diluídos. Incube as misturas finais por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione as misturas de transfecção contendo os vetores de expressão a cada poço de uma placa de 24 poços semeada com células HEK-293 e incube por pelo menos 12 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após 12 horas de incubação, colher as células transfectadas por tripsinização e centrifugação. Após a centrifugação, descarte o meio e adicione 0,5 mililitros de tampão de extração de RNA por tubo. Adicione 0,1 mililitros de clorofórmio por 0,5 mililitros de tampão de extração de RNA a cada amostra.

Após a incubação, centrifugue os tubos por 15 minutos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, transfira a base aquosa para um novo tubo. Adicione 0,25 mililitros de isopropanol por 0,5 mililitros de tampão de extração de RNA usado na homogeneização inicial.

Misture por vórtice e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Após uma centrifugação como antes, o precipitado de RNA geralmente é visível no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante e lave o pellet de RNA com 0,5 mililitros de etanol a 75% por 0,5 mililitros de tampão de extração de RNA.

Vortex vigorosamente e, em seguida, centrifugue a 7.500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e seque ao ar os pellets de RNA. Dissolva os RNAs em 50 microlitros de água livre de RNase.

Em seguida, adicione dois microlitros de cinco unidades por microlitro DNase-um, sete microlitros de tampão 10X e 11 microlitros de água a cada solução de RNA de 50 microlitros. Após a incubação, aqueça as soluções a 70 graus Celsius por 15 minutos para inativar a DNase. Depois de realizar uma reação de transcriptase reversa para sintetizar o cDNA de cada amostra, adicione os componentes da reação de PCR marcada no corpo na ordem mostrada na tela aos tubos de PCR.

Preparar uma reação por amostra. Execute o programa RT-PCR no termociclador. Finalmente, resolva os produtos de PCR por eletroforese através de um gel de poliacrilamida a 10% com tampão TBE.

Use um scanner de fluorescência para visualizar os produtos e meça a quantidade de cada isoforma emendada usando um software de densitometria. Para o ensaio de imunofluorescência para medir a apoptose, prepare uma mistura de transfecção contendo plasmídeos de expressão de domínio ricos em glicina, conforme mostrado anteriormente, e transfecte células HeLa cultivadas em lamínulas de vidro revestidas de polilisina em uma placa de seis poços. 24 horas após a transfecção, fixe as células nas lamínulas com um mililitro de paraformaldeído a 4% em 1x PBS por 20 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave suavemente as células das lamínulas com dois mililitros de 1x PBS por cinco minutos. Em seguida, permeabilize as células com 0,2% Triton X-100 em 1x PBS por 10 minutos. Depois de lavar três vezes com 1x PBS como antes, bloqueie a ligação não específica com albumina de soro bovino a 3% em 1x PBS por 10 minutos.

Dilua o anticorpo bandeira de um a 1.000 em 3% BSA em PBS e pipete 30 microlitros do anticorpo bandeira diluído na folha de parafilme. Use uma pinça para remover uma lamínula. Seque cuidadosamente o excesso de tampão com lenços umedecidos e, em seguida, coloque a lamínula com o lado da célula voltado para baixo na solução anti-sinalização.

Incube por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione aproximadamente 500 microlitros de 1x PBS ao lado da célula da lamínula até que ela flutue sobre a solução. Retorne-o à placa de seis poços com 1x PBS nos poços.

Incubar com anticorpo secundário no parafilme como antes por 15 minutos. Lave como antes e, em seguida, monte as lamínulas nas lâminas do microscópio usando o meio de montagem contendo DAPI. Visualize as células usando um microscópio de fluorescência e fotografe-as usando uma câmera digital.

Usando microscopia de imunofluorescência, muitas células que expressam Gly-PUF-531 tinham DNA nuclear fragmentado, indicando que estavam passando por apoptose. Como controle, as células que expressam Gly-PUF do tipo selvagem tinham DNA nuclear menos fragmentado quando comparadas às células transfectadas com Gly-PUF-531. Aqui, a microscopia de imunofluorescência usando o anticorpo anti-flag fundido com células coradas com DAPI mostra que o Gly-PUF-531 localiza-se predominantemente nos núcleos das células transfectadas.

Gly-PUF do tipo selvagem também localizado nos núcleos de células transfectadas, sugerindo que esses ESFs se dissociam de seus alvos quando os mRNAs totalmente emendados são transportados para o citoplasma. A porcentagem de células apoptóticas com DNA nuclear fragmentado foi medida a partir de campos escolhidos aleatoriamente de imagens de microscopia de fluorescência. Uma vez dominada, a construção de andaimes PUF com especificidade de ligação ao RNA pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular especificamente o splicing alternativo em células humanas por meio da engenharia de fatores artificiais.