Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

O objetivo geral desses procedimentos é avaliar a especificidade e a eficácia dos conjugados de anticorpos para se acumular dentro de células-alvo e tumores durante os estágios iniciais de desenvolvimento, para que possam ser usados na clínica. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a resposta aos campos conjugados, como a eficiência da localização nuclear e o acúmulo intercelular geral. Uma vantagem dessa técnica é que, por meio de imagens PET, os pesquisadores podem avaliar a eficácia e a seletividade dos conjugados de anticorpos candidatos.

As implicações dessas técnicas se estendem à terapia e ao diagnóstico do câncer, porque o acúmulo ineficaz de células tumorais é uma grande limitação dessas aplicações para conjugados de anticorpos. Depois de sintetizar um conjugado de anticorpos de sequência de localização nuclear de ácido cólico de acordo com o protocolo de texto, trate as células-alvo TF1A com 200 conjugados de anticorpos MLS de ácido cólico 7G3 nanomolares. Inclua células tratadas com anticorpos monoclonais de controle modificados.

Incubar cinco vezes 10 até o sexto antígeno-positivo com os conjugados a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova o sobrenadante e use um mililitro de PBS gelado para lavar as células três vezes. Adicione meio fresco e incube as células a 37 graus Celsius por mais uma hora.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de PBS, contendo 0,25% de tripsina e EDTA, e incube as células a 37 graus Celsius por até 30 minutos. Em seguida, use 1,5 mililitros de meio RPMI1640 com 10% de FBS para neutralizar a tripsina. Centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos, remova o sobrenadante e use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes novamente.

Adicione 0,5 mililitros de 1% de PFA e 1% de sacarose e PBS às células e coloque-as no gelo por 30 minutos para corrigi-las. Em seguida, use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes e centrifugue as amostras a 250 vezes G por cinco minutos. Em seguida, adicione 0,15% de Triton X-100 e PBS às células e permeie-as no gelo por cinco minutos.

Em seguida, com PBS gelado, lave as células e repita a centrifugação. Suspenda as células em 0,1 mililitros de PBS, contendo dois microgramas por mililitro de um anticorpo policlonal secundário antiespelhamento FC conjugado ao Alexa Fluor 647, e incube as amostras no escuro em temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue as células a 250 vezes G por cinco minutos e use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes.

Em seguida, suspenda as células em 0,5 mililitros de PBS. Adicione 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio às células. Em seguida, use o meio de montagem para montar uma vez 10 elevado à quinta célula em lâminas de vidro antes de cobrir a amostra com uma lamínula de vidro.

Examine as células com uma objetiva de imersão em óleo Plan APO 60X, abertura numérica de 1,42, em um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Detecte a fluorescência PI usando o laser de argônio de 488 nanômetros e o prisma de varredura espectral definido para 600 a 650 nanômetros. Para fluorescência AF 647, use o laser de hélio-neônio de 633 nanômetros e o prisma de varredura espectral definido para 650 a 700 nanômetros.

Colete imagens de PI e AF 647 sequencialmente, 1024 por 1024 pixels, com média de linha 2X, tiradas em intervalos de 0,5 mícron em toda a espessura da célula. Apresente imagens como projeções Z. Para analisar as células, avalie e registre se a fluorescência intracelular no citoplasma está agrupada e próxima à superfície celular ou difusa e homogênea.

Avalie também a intensidade relativa de fluorescência por célula. Depois de preparar e concentrar o conjugado de anticorpos NLS de ácido cólica radiomarcado de acordo com o protocolo de texto, determine a eficiência da radiomarcação aplicando 0,5 microlitros de citrato de sódio PH5,5 0,1 molar, ou eluente ITLC, a uma tira ITLC. Forme uma auto-radiografia da tira e obtenha uma imagem digital.

Realize densitometria para obter a proporção de Cobre-64 ligado e livre. Se o teor de cobre-64 livre for superior a 5%, concentre ainda mais a amostra. Para estudos de acúmulo celular de cobre-64, trate as células com 100 nanomolares de conjugados A14 marcados com cobre-64 a 37 graus Celsius por uma, seis e 24 horas, conforme descrito anteriormente.

Trate as células com A14 não modificado para bloquear os alfacitos IL5R e a quatro graus Celsius para bloquear a internalização mediada pelo receptor. Depois de lavar as células e incubar com meio fresco, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, adicione 0,5 mililitros de PBS contendo 0,25% de tripsina e EDTA e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, depois de neutralizar e lavar as células como antes, adicione tampão de lise plasma-membrana às células e incube-as no gelo por 10 minutos.

Centrifugar as células lisadas por membrana plasmática a 90 vezes G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo. Isso representa a fração citoplasmática.

Em seguida, use PBS gelado para lavar os núcleos três vezes e adicione as lavagens à fração citoplasmática. Certifique-se de que os frascos contendo as frações nuclear e citoplasmática estejam selados e, em seguida, coloque-os em um contador gama calibrado para cobre-64 para converter as contagens brutas em megabecaril. Determinar a qualidade do isolamento dos núcleos realizando análise de Western-Blot para lamina AC, uma proteína nuclear restrita; e Rab-7, uma proteína citoplasmática abundante, em lisado por atacado, frações nucleares e citoplasmáticas.

Trate cinco vezes 10 para as seis células com 500 microlitros de ensaio de radio-amino-precipitação, ou tampão RIPA, e tampão de lise plasma-membrana contendo 1%2%e 4%NP-40. Além disso, trate os núcleos isolados com 500 microlitros de tampão RIPA para obter proteínas nucleares isoladas. Adicione quatro vezes o volume da amostra de acetona fria às proteínas nucleares, citoplasmáticas e de atacado isoladas e incube por 60 minutos a menos 20 graus Celsius.

Centrifugar as amostras a 13 000 vezes G durante 10 minutos. Transvase o sobrenadante, tomando cuidado para não desalojar o pellet de proteína. Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS para dissolver as proteínas.

Depois de realizar o Western Blotting conforme descrito anteriormente, corte a membrana ao meio no marcador de peso molecular de 40 kilodaltons. Use anticorpos específicos para lamina-AC para sondar o blot contendo as proteínas de maior peso molecular e use anticorpos específicos para Rab-7 para sondar a metade inferior da membrana. Em grupos contendo quatro camundongos nodskit, injete na veia da cauda 20 a 30 microgramas de conjugado de anticorpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado, A14 NLS radiomarcado e A14 radiomarcado.

No mesmo dia, coloque um simulador cilíndrico contendo cinco megabecaril de cobre-64 no scanner PET para converter as contagens radioativas por segundo em dose injetada por grama de tecido. 48 horas depois, após anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de texto, transfira rapidamente um camundongo para uma mesa de scanner PET na posição de cabeça para baixo com um nariz para isoflurano. Inicie a aquisição de dados PET usando uma configuração regular do modo de amostragem e uma janela de energia de 250 a 650 quiloelétron-volts.

Após a digitalização, remova o mouse do scanner e coloque-o de volta na gaiola. Como mostrado nesta figura, as setas mostram a diferença ao avaliar o acúmulo de conjugados de anticorpos com e sem tripsinização. Em células que não são tripsinizadas, o acúmulo e a distribuição intracelular são difíceis de avaliar devido à superexpressão dos receptores de superfície da célula-alvo.

As setas mostram a diferença no acúmulo intracelular e na distribuição de dois candidatos a conjugados de anticorpos quando as células são adequadamente tripsinizadas. O conjugado de anticorpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado mostra afinidade nanomolar por IL5R alfa. Com o aumento das concentrações de conjugado de anticorpos NLS de ácido cólico A14 radiomarcado, a ligação específica do conjugado de anticorpos NLS de ácido cólico A14 aproximou-se da saturação em concentrações de 3,5 nanomolares em células HT-1376 e HT-B9.

A contagem gama revela que o aumento da radioatividade no núcleo e no citoplasma do conjugado de anticorpos NLS de ácido cólico A14 radiomarcado é específico e aumenta com o tempo. As células HT-1376 e HT-B9 foram incubadas com tampão de lise plasma-membrana contendo 1%2%ou 4%NP-40. Para as células HT-1376 e HT-B9, o tampão de lise contendo um ou 2% de NP-40 Rap-7 não foi detectado na fração nuclear, e a lâmina AC não foi detectada na fração citoplasmática.

A imagem PET permite a avaliação de conjugados de anticorpos candidatos quanto à sua capacidade de atingir tumores positivos para antígenos, setas vermelhas e azuis e suas propriedades de biodistribuição associadas em comparação com o anticorpo parental não modificado por peptídeos. Pode-se ver o acúmulo de sinal no tumor para ajudar a selecionar o potencial para um conjugado de anticorpos desenvolvido. A imagem PET também permite a avaliação da captação de conjugados de anticorpos candidatos em tecidos saudáveis, como o fígado.

Depois de dominar essas técnicas, os pesquisadores no campo da entrega de cargas moleculares direcionadas ao tumor poderão explorar agentes adicionais onde o acúmulo de células tumorais é prejudicado devido ao aprisionamento do endossomo.