Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

O objetivo geral da funcionalização química da superfície das nanopartículas HEV é fornecer uma abordagem repetível e consistente para a conjugação de moléculas imunogênicas, terapêuticas e diagnósticas direcionadas à superfície das nanopartículas HEV para fins de diagnóstico e tratamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanomedicina, como o direcionamento aprimorado do câncer e a distribuição de nanoterapêuticas podem ser monitorados. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente reprodutível, eficiente e muito mais fácil de alcançar quando comparada à geração de engenharia genética.

Demonstrando os procedimentos estarão Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, assistentes de pesquisa de nosso laboratório. Comece este protocolo com a produção e purificação de nanopartículas do vírus da hepatite E, conforme descrito no protocolo de texto. Dilua as amostras de nanopartículas HEV entre 0,5 e dois miligramas por mililitro com 10 milimolares MES, pH 6,2 para uma imagem TEM.

Ionize as grades revestidas de carbono com descarga de brilho de 40 miliamperes por 30 segundos para produzir uma superfície de carbono hidrofílica. A superfície hidrofílica de carbono das grades pode durar apenas 30 minutos após o tratamento de descarga luminescente. Após a ionização, segure a grade e a pinça e adicione dois microlitros da amostra de nanopartículas HEV à grade.

Após 15 a 30 segundos, seque a grade com papel de filtro. Em seguida, lave imediatamente a grelha com água bidestilada e seque novamente com papel de filtro. Adicione imediatamente dois microlitros de acetato de uranila a dois por cento à grade.

Após 15 segundos, seque a grade com papel de filtro. Seque as grades de amostra colocando-as em um gabinete seco de desumidificador eletrônico durante a noite. Dependendo da amostra, microscopia eletrônica criogênica ou crio-EM pode ser necessária para visualização e caracterização da estrutura.

Transfira a grade para um MET e imagem com ampliação de 10 a 80 K. As nanopartículas de HEV aparecem no MET como proteínas icosaédricas vazias com aproximadamente 27 nanômetros de diâmetro devido à ausência de RNA viral. Para realizar a conjugação de uma etapa de nanopartículas de HEV e biotina ligada à maleimida, primeiro aplique as nanopartículas de HEV em mini unidades de diálise.

Dialise as nanopartículas contra 0,01 molar PBS pH 7,4 à temperatura ambiente por uma hora de acordo com o protocolo do fabricante. Após a diálise, transfira as nanopartículas de HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração de proteína em 280 nanômetros usando um espectrofotômetro. Misture as nanopartículas a um miligrama por mililitro com uma quantidade igual de 100 micromolares de maleimida biotina e 0,01 molar PBS pH 7,4 para fazer uma proporção de um a cinco molares.

Depois de reagir durante a noite a quatro graus Celsius, remova a biotina de maleimida não ligada com um procedimento de coluna de dessalinização por centrifugação de acordo com o protocolo do fabricante. Analise as amostras por meio de uma página de SDS redutora padrão. Usando os procedimentos padrão, prepare um Western blot quimioluminescente usando estreptavidina ligada a HRP e capture o sinal quimioluminescente por filme de raios-x.

Para realizar a conjugação em duas etapas do ligante específico da célula de câncer de mama, LXY30, para cisteína exposta à superfície em nanopartículas de HEV, primeiro aplique as nanopartículas em mini unidades de diálise e dialise contra 0,01 molar PBS pH 7,4 em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, transfira as nanopartículas HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração de proteína a 280 nanômetros usando um espectrofotômetro. Em seguida, combine 650 azida de maleimida micromolar e 650 alcino micromolar LXY30 com sulfato de cobre 200 micromolar e ácido ascórbico milimolar.

Isso forma LXY 30 ligado à maleimida a 650 micromolar. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, misture as nanopartículas de HEV a um miligrama por mililitro com cerca de 10% do volume de LXY 30 ligado à maleimida para fazer uma proporção de um a três molares.

Reaja durante a noite a quatro graus Celsius. Devido à concentração relativamente alta de maleimida LXY 30, as concentrações finais dos reagentes, como o sulfato de cobre, são reduzidas cerca de 10 vezes após a mistura. Para evitar danos às nanopartículas do vírus da hepatite E, outra opção é o método de contribuição livre de cobre.

Remova a maleimida não ligada clique LXY 30 com uma coluna de dessalinização de rotação de acordo com o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas HEV ligadas ao LXY 30 a quatro graus Celsius. Para realizar a conjugação de uma etapa das nanopartículas LXY 30 HEV e da etiqueta fluorescente Cy5.5, primeiro misture as nanopartículas ligadas a LXY 30 a um miligrama por mililitro com um volume igual de etiqueta fluorescente Cy5.5 para fazer uma proporção de um a cinco molares.

Depois de reagir a mistura durante a noite a quatro graus Celsius, remova o Cy5.5 NHS não ligado com um procedimento de coluna de dessalinização por centrifugação de acordo com o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 a quatro graus Celsius. Dois métodos foram tentados para a funcionalização LXY 30 de nanopartículas HEV para direcionamento de células tumorais.

Quando as nanopartículas de HEV 573C foram ligadas à azida de maleimida primeiro, seguidas por uma reação química de clique ao alcino LXY 30, as nanopartículas de HEV 573C pareceram se desmontar sob observação de TEM. No entanto, uma reação química de clique inicial entre o alcino LXY 30 e a azida de maleimida para formar LXY 30 ligado à maleimida, seguida de conjugação para auxiliar as nanopartículas HEV modificadas, não afetou sua estrutura e as nanopartículas HEV 573C permaneceram intactas. As nanopartículas de HEV ligadas a LXY 30 e Cy5.5 foram aplicadas a células de câncer de mama cultivadas e observadas por microscopia confocal.

As imagens de fluorescência no infravermelho próximo por microscopia confocal indicam que as nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 tiveram maior afinidade de ligação para uma maior internalização em células de câncer de mama MDA MB 231 em comparação com nanopartículas HEV ligadas a Cy5.5. As implicações dessa técnica se estendem ao exame de moléculas terapêuticas e de direcionamento multimodal que permitem o direcionamento e diagnóstico precisos do tumor sem causar danos às células normais. Embora esse método possa fornecer informações sobre o câncer e o direcionamento do tumor por meio da modulação química da superfície, ele pode ser aplicado ao diagnóstico precoce do câncer, triagem e tratamento guiado por imagem.