Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química
11 de maio de 2018
Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.
O objetivo geral da funcionalização química da superfície das nanopartículas HEV é fornecer uma abordagem repetível e consistente para a conjugação de moléculas imunogênicas, terapêuticas e diagnósticas direcionadas à superfície das nanopartículas HEV para fins de diagnóstico e tratamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanomedicina, como o direcionamento aprimorado do câncer e a distribuição de nanoterapêuticas podem ser monitorados. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente reprodutível, eficiente e muito mais fácil de alcançar quando comparada à geração de engenharia genética.
Demonstrando os procedimentos estarão Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, assistentes de pesquisa de nosso laboratório. Comece este protocolo com a produção e purificação de nanopartículas do vírus da hepatite E, conforme descrito no protocolo de texto. Dilua as amostras de nanopartículas HEV entre 0,5 e dois miligramas por mililitro com 10 milimolares MES, pH 6,2 para uma imagem TEM.
Ionize as grades revestidas de carbono com descarga de brilho de 40 miliamperes por 30 segundos para produzir uma superfície de carbono hidrofílica. A superfície hidrofílica de carbono das grades pode durar apenas 30 minutos após o tratamento de descarga luminescente. Após a ionização, segure a grade e a pinça e adicione dois microlitros da amostra de nanopartículas HEV à grade.
Após 15 a 30 segundos, seque a grade com papel de filtro. Em seguida, lave imediatamente a grelha com água bidestilada e seque novamente com papel de filtro. Adicione imediatamente dois microlitros de acetato de uranila a dois por cento à grade.
Após 15 segundos, seque a grade com papel de filtro. Seque as grades de amostra colocando-as em um gabinete seco de desumidificador eletrônico durante a noite. Dependendo da amostra, microscopia eletrônica criogênica ou crio-EM pode ser necessária para visualização e caracterização da estrutura.
Transfira a grade para um MET e imagem com ampliação de 10 a 80 K. As nanopartículas de HEV aparecem no MET como proteínas icosaédricas vazias com aproximadamente 27 nanômetros de diâmetro devido à ausência de RNA viral. Para realizar a conjugação de uma etapa de nanopartículas de HEV e biotina ligada à maleimida, primeiro aplique as nanopartículas de HEV em mini unidades de diálise.
Dialise as nanopartículas contra 0,01 molar PBS pH 7,4 à temperatura ambiente por uma hora de acordo com o protocolo do fabricante. Após a diálise, transfira as nanopartículas de HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração de proteína em 280 nanômetros usando um espectrofotômetro. Misture as nanopartículas a um miligrama por mililitro com uma quantidade igual de 100 micromolares de maleimida biotina e 0,01 molar PBS pH 7,4 para fazer uma proporção de um a cinco molares.
Depois de reagir durante a noite a quatro graus Celsius, remova a biotina de maleimida não ligada com um procedimento de coluna de dessalinização por centrifugação de acordo com o protocolo do fabricante. Analise as amostras por meio de uma página de SDS redutora padrão. Usando os procedimentos padrão, prepare um Western blot quimioluminescente usando estreptavidina ligada a HRP e capture o sinal quimioluminescente por filme de raios-x.
Para realizar a conjugação em duas etapas do ligante específico da célula de câncer de mama, LXY30, para cisteína exposta à superfície em nanopartículas de HEV, primeiro aplique as nanopartículas em mini unidades de diálise e dialise contra 0,01 molar PBS pH 7,4 em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, transfira as nanopartículas HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração de proteína a 280 nanômetros usando um espectrofotômetro. Em seguida, combine 650 azida de maleimida micromolar e 650 alcino micromolar LXY30 com sulfato de cobre 200 micromolar e ácido ascórbico milimolar.
Isso forma LXY 30 ligado à maleimida a 650 micromolar. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, misture as nanopartículas de HEV a um miligrama por mililitro com cerca de 10% do volume de LXY 30 ligado à maleimida para fazer uma proporção de um a três molares.
Reaja durante a noite a quatro graus Celsius. Devido à concentração relativamente alta de maleimida LXY 30, as concentrações finais dos reagentes, como o sulfato de cobre, são reduzidas cerca de 10 vezes após a mistura. Para evitar danos às nanopartículas do vírus da hepatite E, outra opção é o método de contribuição livre de cobre.
Remova a maleimida não ligada clique LXY 30 com uma coluna de dessalinização de rotação de acordo com o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas HEV ligadas ao LXY 30 a quatro graus Celsius. Para realizar a conjugação de uma etapa das nanopartículas LXY 30 HEV e da etiqueta fluorescente Cy5.5, primeiro misture as nanopartículas ligadas a LXY 30 a um miligrama por mililitro com um volume igual de etiqueta fluorescente Cy5.5 para fazer uma proporção de um a cinco molares.
Depois de reagir a mistura durante a noite a quatro graus Celsius, remova o Cy5.5 NHS não ligado com um procedimento de coluna de dessalinização por centrifugação de acordo com o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 a quatro graus Celsius. Dois métodos foram tentados para a funcionalização LXY 30 de nanopartículas HEV para direcionamento de células tumorais.
Quando as nanopartículas de HEV 573C foram ligadas à azida de maleimida primeiro, seguidas por uma reação química de clique ao alcino LXY 30, as nanopartículas de HEV 573C pareceram se desmontar sob observação de TEM. No entanto, uma reação química de clique inicial entre o alcino LXY 30 e a azida de maleimida para formar LXY 30 ligado à maleimida, seguida de conjugação para auxiliar as nanopartículas HEV modificadas, não afetou sua estrutura e as nanopartículas HEV 573C permaneceram intactas. As nanopartículas de HEV ligadas a LXY 30 e Cy5.5 foram aplicadas a células de câncer de mama cultivadas e observadas por microscopia confocal.
As imagens de fluorescência no infravermelho próximo por microscopia confocal indicam que as nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 tiveram maior afinidade de ligação para uma maior internalização em células de câncer de mama MDA MB 231 em comparação com nanopartículas HEV ligadas a Cy5.5. As implicações dessa técnica se estendem ao exame de moléculas terapêuticas e de direcionamento multimodal que permitem o direcionamento e diagnóstico precisos do tumor sem causar danos às células normais. Embora esse método possa fornecer informações sobre o câncer e o direcionamento do tumor por meio da modulação química da superfície, ele pode ser aplicado ao diagnóstico precoce do câncer, triagem e tratamento guiado por imagem.
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Visão Geral
Este estudo apresenta a engenharia da proteína da cápsula do vírus da hepatite E em uma nanopartícula teranostica (HEVNP) para terapia tumoral direcionada. As HEVNPs são modificadas para melhorar a direcionamento para o tumor através da conjugação de ligantes sintéticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Nanomedicina
- Teranostics
- Oncologia
Fundamento
- HEVNPs se auto-organizam em estruturas estáveis.
- Modificação de nanopartículas pode melhorar as capacidades de direcionamento.
- Entender a distribuição de terapêuticos é crucial no tratamento do câncer.
- Esta abordagem é mais eficiente em comparação com métodos tradicionais de engenharia genética.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método consistente para funcionalização de HEVNPs.
- Melhorar o direcionamento de células cancerígenas usando ligantes sintéticos.
- Facilitar o diagnóstico e tratamento de tumores.
Métodos Usados
- Produção e purificação de nanopartículas HEV.
- Diluição de amostras HEVNP para imagem.
- Conjugação de ligantes a resíduos de cisteína expostos na superfície.
- Uso de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para análise.
Principais Resultados
- HEVNPs podem ser efetivamente modificadas para direcionamento tumoral.
- O método de conjugação é reprodutível e eficiente.
- Foi demonstrado um direcionamento aprimorado de células cancerígenas.
- Aplicações potenciais em diagnósticos e terapêuticas foram destacadas.
Conclusões
- HEVNPs representam uma plataforma promissora para terapia do câncer.
- A modificação da superfície permite a entrega direcionada de agentes terapêuticos.
- Este método poderia avançar o campo da nanomedicina.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
