Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

O objetivo geral deste método de amostragem de fluido de revestimento mucoso é estudar a assinatura imunológica local das vias aéreas sem a necessidade de procedimentos de estimulação. Este método permite estudar questões-chave na área de doenças respiratórias pediátricas, como infecções, asma e alergia. As vantagens do método são que você pode medir níveis muito baixos de mediadores imunológicos na mucosa das vias aéreas não estimulada in vivo.

A demonstração do procedimento será feita pelo Dr. Wolsk. Para a coleta de amostras de recém-nascidos, primeiro corte pelo menos duas tiras de três por 15 milímetros de folhas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso. Em seguida, coloque o recém-nascido em uma cama e anote quaisquer sintomas de infecção das vias aéreas.

Em seguida, use uma pinça para inserir um pedaço de papel de filtro de aproximadamente um centímetro na parte anterior do corneto inferior de cada narina do bebê e administre água com açúcar ao recém-nascido para maior conforto, conforme necessário. Tome nota de qualquer espirro, choro persistente ou epistaxe que ocorra durante o período de amostragem. Após dois minutos de absorção, transfira os papéis de filtro para um tubo rotulado para armazenamento imediato a 80 graus Celsius negativos.

Demonstrando o procedimento experimental estará Lisbeth Rosholm, uma técnica em meu laboratório. Para quantificação do mediador imunológico das vias aéreas, coloque até 10 amostras de armazenamento negativo de 80 graus Celsius no gelo e registre seus números de identificação. Quando as amostras tiverem descongelado, mergulhe ambos os papéis de filtro por indivíduo em 150 microlitros de tampão recém-preparado por papel de filtro, suplementado com um comprimido inibidor de protease completo por 25 mililitros de solução de estoque tampão.

Transferir as amostras para um agitador de chapas a 400 rpm durante cinco minutos. Transfira os papéis tampão e de filtro para os copos de filtros individuais de tubos de acetato de celulose. Centrifugue as amostras para coletar o extrato nasal filtrado no fundo dos tubos de microcentrífuga.

Em seguida, retire os copos e coloque os tubos no gelo. Em seguida, transfira alíquotas de 150 microlitros do extrato nasal para poços individuais de placas de armazenamento de baixa ligação a proteínas e armazene as placas a 80 graus Celsius negativos até a análise. Em seguida, meça a concentração dos mediadores imunológicos nasais de interesse por uma matriz multiplexada baseada em eletroquimioluminescência de alta sensibilidade de acordo com os protocolos de ensaio padrão.

Nesta análise representativa de 620 neonatos, a maioria dos mediadores imunológicos medidos demonstrou um baixo nível de detecção. Os níveis de IFN gama estavam abaixo do limite inferior de detecção em quase metade das amostras, enquanto os níveis de TNF alfa, CCL4 e TGF beta estavam abaixo do limite inferior de detecção em menos de 1% das amostras. Uma forte multicolinearidade foi evidente para os 20 níveis de mediadores detectados, conforme ilustrado pelo mapa de calor.

Em neonatos assintomáticos infectados pelo picornavírus, foi observado um perfil de regulação positiva comprometido principalmente de mediadores imunológicos tipo 1, sugerindo um papel desencadeante imunológico de bactérias e vírus colonizadores na primeira parte da vida. Uma associação entre a presença de irmãos na casa ao nascer e uma resposta imune específica da mucosa direcionada Tipo 1 Tipo 17 também foi determinada com evidências de correlação desse fenômeno com um efeito de priming imunológico in utero que está inversamente correlacionado com o tempo desde o último parto. Além disso, crianças nascidas de mães que receberam suplementos de alto versus placebo foram caracterizadas por uma regulação positiva em mediadores imunológicos específicos, sugerindo que a vitamina D promove uma resposta imune antibacteriana independente daquela induzida por vírus, bactérias, irmãos ou atopia materna.

Este método de microamostragem também pode ser utilizado através de um broncoscópio, permitindo estudar os mediadores imunológicos nas vias aéreas inferiores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como medir mediadores na mucosa das vias aéreas não estimulada in vivo em neonatos e crianças mais velhas.