Name: Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda as técnicas de nasossucção e broncossucção para amostragem de fluido da mucosa respiratória humana usando matrizes absorventes sintéticas. Esses métodos não invasivos permitem coleta padronizada em pacientes de todas as idades.

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Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Instituto Nacional Imperial para centro de pesquisa biomédica (BRC) saúde pesquisa (NIHR), o NIHR saúde proteção pesquisa unidade (HPRU) em infecções respiratórias no Imperial College London, em parceria com a saúde pública Inglaterra (PHE) e o centro de investigação de translação NIHR Imperial segurança do paciente. As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente os do NHS, o NIHR, departamento de saúde ou saúde pública Inglaterra.

As técnicas usadas no protocolo a seguir foram aprovadas pelo Comitê de ética de pesquisa (número de referência 15/lO/0444) West London.
1. nasal absorção (NA)
<ol><li>
Preparação antes da amostragem de at
	<ol>
<li>Ao efectuar at, primeiro lave as mãos e colocar luvas, de preferência na frente do paciente.</li>
		<li>Inspecionar a cavidade nasal usando uma lanterna e tem o médico usar seu polegar não-dominante para retrair o nariz do paciente para visualizar a cavidade nasal. Nota: Um espéculo nasal não é geralmente necessário.</li>
		<li>Visualize a cavidade nasal e inferior corneto antes da amostragem. Nota: Narinas (nariz) não são redondas em secção transversal e vão direto para trás. Geralmente, corneto inferior pode ser visto como uma protuberância ou recuo na parede lateral da narina, com septo nasal formando a parede lisa, plana medial. Queremos amostra neste inferior Corneto, uma vez que o epitélio subjacente é um epitélio ciliado simples do trato respiratório44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amostragem de at
	<ol>
<li>Quando a amostragem, passe o SAM at suavemente até o lúmen da narina, orientando-o para ser plana contra corneto inferior.</li>
		<li>Pergunte o doador para usar um dedo para pressionar o SAM para a mucosa nasal. AT pode causar uma ligeira cócegas, com possível olho molhando, como o MLF é absorvida. Nota: Em adultos, geralmente realizamos at para 60 s.</li>
		<li>Após a absorção da MLF, remova o dispositivo NA narina e colocar de volta no tubo original.</li>
		<li>Processar as amostras imediatamente em laboratório ou congelá-los, conforme detalhado no final deste protocolo. Nota: AT está sendo estudada em uma variedade de modelos de desafio da mucosa nasal e também em doenças de vias aéreas diferentes. No entanto, validação contra outros métodos de recolha de amostras respiratórias deve ser executada para cada população de estudo e paciente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. brônquica absorção (BA)
<ol><li>
Preparação antes da amostragem de BA Nota: BA é executada por pessoal especializado em uma suíte de broncoscopia.<ol>
<li>Antes de colocar o dispositivo de BA para baixo o cateter, verifique se o SAM está expulsando e retirada de volta dentro do cateter.</li>
		<li>Antes da realização BA em um paciente, realizar um BA simulado em um simulador de broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amostragem de BA
	<ol>
<li>Passe o broncoscópio para baixo a traqueia e o brônquio principal direito para o nível do brônquio intermedius, imediatamente proximal à divisão nos lobos inferiores direito e meio. Nota: Nós normalmente amostra do brônquio intermedius, embora outros sites dentro das vias aéreas podem ser saboreados. Ao observar o cateter e o SAM, um não pode ver a ponta do broncoscópio. Observamos os seguintes passos simples para BA, uma vez que o broncoscópio alcançou o local de amostragem desejada.</li>
		<li>CATETER para baixo: Introduza o cateter de BA através do canal de funcionamento do broncoscópio até a ponta branca é apenas visível na via aérea, até um máximo de 1 cm distal à extremidade do broncoscópio. Mantenha a ponta broncoscópio e cateter no centro do lúmen das vias aéreas. Tenha cuidado para minimizar o contato entre a ponta do cateter e a mucosa dos brônquios para reduzir o risco de abrasão da mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Pressione o punho do dispositivo, BA para que o SAM é extrudado no lúmen das vias aéreas no lobo inferior direito ou meio. Sob visão direta, dobre a ponta do broncoscópio para garantir que o SAM está fazendo contato com o MLF na parede das vias aéreas. Deixar o SAM dentro das vias aéreas, plana para a parede da mucosa por 30 s.</li>
		<li>SAM IN: Olhe através do broncoscópio para garantir que a sonda de SAM a úmido é em linha reta e não dobrados volta sobre a extremidade do cateter. Se necessário, a ponta do cateter e broncoscópio pode ser trazida de volta para endireitar o SAM. Sob visão direta, retrai o SAM reta suavemente para o cateter. Nota: Se houver dificuldade para retrair o SAM volta dentro do cateter, retirar o dispositivo com SAM expulsado para fora das vias aéreas.</li>
		<li>CATETER acima: Retire o cateter inteiro do canal de funcionamento do broncoscópio.</li>
		<li>CORTAR o SAM: O SAM é cortado com uma tesoura esterilizada e é então colocado um criotubo no gelo. Estas amostras podem ser processadas com diferentes métodos, como detalhado mais tarde no presente protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. processamento de at e amostras de BA
Nota: Existem inúmeras opções para o processamento laboratorial das amostras resultantes de at e BA. Estes protocolos visam armazenar amostras para uso posterior e eluir a amostra MLF o SAM.
<ol><li>
Opções para manipulação de imediata das amostras at e BA
	<ol>
<li>Opção 1: Armazene o SAM húmido no gelo por algumas horas antes da transformação.</li>
		<li>Opção 2: Imediatamente deep freeze at SAMs na coleção do tubo. Da mesma forma, congele BA SAMs em frascos criogênicos após a remoção, com tesouras, do dispositivo de amostragem.</li>
		<li>Opção 3: Coloque o SAM destacado em tampão de eluição (300 µ l) antes da transformação direta ou profunda congelando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opções de tampão de eluição para amostras at e BA Nota: A escolha do tampão de eluição depende o que vai ser analisado na amostra MLF e sugerimos quatro alternativas principais:<ol>
<li>Use um buffer de ensaio pré-preparadas apropriado para procedimentos de imunoensaio. Tais buffers devem conter uma pequena quantidade de detergente (0.05%) bem como de proteínas, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) em 1%.</li>
		<li>Como alternativa, use um buffer que contém uma maior quantidade de detergente, para que a lise celular ocorre. Nota: Nós usamos buffers contendo Triton-X ou NP40 na concentração de 1%. Buffers de lise celular ativar citocinas intracelulares e extracelulares ser eluída do SAM e geralmente resultam em níveis mais elevados de citocinas e quimiocinas. Esses buffers também devem conter proteínas e são compostos com BSA 1%.</li>
		<li>Para medições de RNA, como a PCR quantitativo de RNA viral ou medição do RNA do hospedeiro, adicionar o buffer de extração de RNA diretamente para o SAM húmido. Nota: Buffers de extração de RNA caotrópicas contêm guanidínio que desnatura as proteínas. Uma alternativa é adicionar o buffer de extração de RNA ao fluido eluted MLF contido em tampão de Lise imunoensaio ou célula.</li>
		<li>Use solventes orgânicos, tais como ácido trifluoroacético, para extração de lipídios e seus metabolitos, para avaliação por espectrometria de massa. Nota: Detalhes de todos estes reagentes são incluídos na seção materiais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica de eluição
	<ol>
<li>Para qualquer uma das técnicas de eluição acima, insira o SAM um mL 2 microcentrífuga, juntamente com o buffer de extração desejada.</li>
		<li>Vórtice misturar a amostra por 30 s para lavar o SAM de fluidos vagamente anexados e biomoléculas.</li>
		<li>Para garantir a recuperação completa de amostras, execute eluição centrífuga adicionando o SAM úmido para uma rotação filtro mini coluna que insere-se no tubo de 2 mL de microcentrífuga mesmo usado para lavar roupa. Nota: Dois tipos de rotação filtro mini coluna podem ser usados. O primeiro contém apenas um engranzamento plástico, que detém o SAM no lugar, permitindo que a eluição completa de fluidos. Alternativamente, se trabalhar com materiais infecciosos, use filtros de rotação com um tamanho de poros de 0,22 µm. Estes filtros vão esterilizar amostras e são adequados para amostras com suspeita de infecção por micobactérias. Entretanto, estes filtros devem ser pré-incubado com buffer, para minimizar a vinculação dos mediadores para o filtro por interacções não-específicas.</li>
		<li>Use Pinças esterilizadas para transferir o SAM úmido para o filtro de rotação. Alterar o fórceps entre amostras para evitar a contaminação.</li>
		<li>Amostras de centrifugar por 20 min a 16.000 x g em uma centrífuga mini resfriado a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de exemplo do Resumo
	<ol>
<li>No laboratório, rotular 2ml microcentrífuga tubos para coleta de amostra e adicionar o volume desejado de tampão de eluição (tipicamente 300 µ l para at; 100 µ l de BA). Feche a tampa e colocar no gelo.</li>
		<li>Após a amostragem (imediatamente ou no laboratório), o SAM é retirado o identificador usando fórceps e colocados no buffer que contém o tubo de coleta (produzido na etapa anterior). Certifique-se a tampa do tubo microcentrifuga está bem fechada e transferir as amostras, no gelo, ao laboratório para processamento adicional.</li>
		<li>Remover os tubos contendo o tampão SAM e eluição de seu mix de contêiner e vórtice de transferência por 30 s.</li>
		<li>Usando a pinça estéril, remover SAM e colocar em uma coluna de rotação (com ou sem filtro de acetato de celulose 0,22 µm).</li>
		<li>Coletar o tampão de eluição do tubo da coleção e reter.</li>
		<li>Coloque a coluna de rotação, com SAM, no tubo da coleção original (ou uma nova se filtragem estéril amostras) e adicionar o buffer de coleção para girar a coluna. Desta forma, o fluido de lavagem passará através da coluna de rotação volta no tubo de coleta, ajudando a eluir a amostra do SAM.</li>
		<li>Centrifugar as amostras com tampas seladas (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Remover as amostras da centrífuga e coloc em uma cremalheira.</li>
		<li>Abra a tampa selada dos tubos e remover a coluna de rotação contendo o SAM. Descarte de SAM e girar a coluna em um recipiente de recolha apropriado.</li>
		<li>Cuidadosamente a alíquota o eluato contido dentro do tubo em rotulados criogênico tubos. Registre o volume total de eluato e o volume em cada alíquota.</li>
		<li>Transferir os tubos criogênicos selados para um freezer-80 ° C e armazenar na vertical até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Resultados de técnicas de amostragem de vias aéreas existentes são considerados altamente variável; técnicas de amostragem alternativos são necessários para padronizar a pesquisa dentro deste campo5. NA BA permitir a amostragem de MLF de forma não-invasiva e têm potencial emocionante para medir respostas imunes nas vias aéreas saudáveis e doentes. Estas técnicas oferecem inúmeras vantagens potenciais sobre técnicas existentes, incluindo maior tolerabilidade, velocidade de amostragem, a capacidade de repetir frequentemente a amostragem, baixa variabilidade inter-user e diminuíram a diluição dos mediadores imunes5 . A duração da absorção e da técnica de processamento usado deve ser otimizada para cada estudo e rigorosamente mantida entre eventos de amostragem. Além disso, no caso de BA, o local de amostragem dentro das vias aéreas deve ser cuidadosamente replicado entre indivíduos.
ND e particularmente BA, são ainda relativamente novas técnicas para a pesquisa clínica. No entanto, os benefícios destas técnicas resultaram em seu uso em numerosos estudos, incluindo validação cuidadosa contra técnicas alternativas5. Estes dispositivos estão agora disponíveis como dispositivos de marcação CE pronto para uso difundido na investigação respiratória. Enquanto nd e BA resultam em muito menores volumes de amostra do que as técnicas de amostragem alternativo, altas concentrações obtidas podem resultar em maior sensibilidade aos mediadores imunes baixa abundância.
Dependendo de aplicações a jusante desejadas, amostras at e BA diretamente podem ser congeladas para posterior processamento, realçando o estudo de viabilidade em um ambiente de pesquisa clínica. O protocolo para manuseio de amostras também pode ser adaptado às aplicações particulares a jusante. As técnicas de processamento sugerido podem ser usadas para a coleção de proteína ou imune mediadores lipídicos ou ácidos nucleicos, mas devem ser otimizadas para cada estudo. Em particular, MLF pode ser eluída com buffers diferentes. Em primeiro lugar, imunoensaio buffer pode ser usado para medir os anticorpos6,45, quimiocinas e citocinas na mucosa. Buffers com níveis mais elevados de detergente também podem ser usados para garantir a lise celular ocorre, permitindo a inclusão de citocinas intra celulares. Extração de RNA caotrópicas buffers de devem ser usados para a determinação da infecção viral, viral carregar, o apresentador de mRNA e o microbiome. Alternativamente, solventes orgânicos podem ser usados para lipidomics e espectrometria de massa.
Em conclusão, absorção direta de MLF de superfícies mucosas é uma técnica excitante com potencial de uso em doenças da mucosa respiratórias, gastrointestinal, urogenitais e outras. No entanto, essas técnicas de absorção promissor exigirá validação precisa de amostragem e técnica para ensaios individuais (biomarcadores) em cada configuração de doença de processamento. Além disso, estas técnicas de amostragem da mucosa precisão romance exigirá validação contra amostras convencionais, tais como de sangue, respiração e saliva. Com estas técnicas, MLF pode ser usado para medir os anticorpos, citocinas, quimiocinas, prostanoids e micróbios.

A maioria das doenças respiratórias causam uma resposta inflamatória, e há uma necessidade urgente de amostragem da superfície da mucosa respiratória na rinite alérgica, infecções virais e fúngica, tuberculose, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, pulmonar fibrose e pulmão câncer 1. Aspirado de nasofaringe (NPA), lavagem nasal e lavagem broncoalveolar (BAL) são técnicas comuns de amostragem das vias aéreas superiores e inferiores. No entanto, essas técnicas apresentam problemas consideráveis, incluindo pobre tolerabilidade, diluição de mediadores inflamatórios e a incapacidade de se repetir com frequência de amostragem2. Uma alternativa para amostragem de NPA é o uso de cotonetes, nylon reuniram-se, o algodão ou viscose3,4, mas estas também têm limitações, uma vez que causam desconforto e danos para o epitélio nasal e em alguns ligação irreversível de casos de mediadores inflamatórios5. Essas técnicas geralmente não podem ser repetidas em série, mais de uma hora, e técnicas alternativas podem ser mais eficazes para a deteção de baixa abundância citocinas e quimiocinas5,6. Além disso, a variabilidade de usuário associada com estas técnicas pode gerar inconsistências nos dados, tendo por resultado a exigência de maiores coortes de pacientes.
Alternativamente, técnicas de absorção utilizando esponjas naturais e sintéticas têm sido usadas para coletar MLF de superfícies mucosas. Esponjas de Oftalmologia é composta por celulose natural (por exemplo, Weck-cel) têm sido usados para amostra saliva, cervical e secreções vaginais7. Além disso, esponjas sintéticas, feitas de álcool polivinílico (PVA) e acetato de polivinilo hidroxilado (HPVA) foram utilizados8. Sete diferentes materiais absorventes foram comparados para amostragem de fluido oral antes da medição anticorpos9, enquanto o miniesponjas poliuretano têm sido utilizadas para coletar as lágrimas humanas10.
Papel de filtro, consistindo de celulose natural da planta do algodão tem sido amplamente utilizada para absorver as secreções nasais desde o papel pioneiro de Alam e colegas em 199211,12,13,14, 15,16,17. Papel de filtro discos produzidos a partir de cartões de filtro (por exemplo, Shandon) e têm sido utilizados para medir histaminas e citocinas depois de controlados os desafios alérgeno nasal e com exposição de alérgeno natural18,19 ,20,21. No entanto, diferentes lotes de papel de filtro variam em seu grau de ligação às proteínas e alguma falha ao liberar citocinas. Métodos utilizando uma matriz sintética de absorção (SAM), portanto, têm sido desenvolvidos2,22,23. SAMs agora são usadas geralmente para obter MLF nasal por NA. Estes materiais absorventes são confortáveis para usar e pode obter MLF nem do nariz inflamado em intervalos frequentes durante longos períodos de tempo.
Absorção nasal é uma forma de amostragem da mucosa de precisão usando uma SAM para a amostragem de MLF na via aérea superior. Dispositivos de at são fabricados como dispositivos médicos a marcação CE de materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. O sampler at consiste de um identificador e SAM em um criotubo estéril. O SAM é composto de polímeros, fibras, normalmente, mas também está disponível como espuma, e estas são selecionadas para ser macio e absorvente, com rápida absorção para coleta de amostra. SAMs tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. NA é uma técnica muito suave, não-invasivo que pode ser executada em doadores de todas as idades. Além disso, amostragem serial, mesmo em poucos minutos, é possível. AT foi validado contra as vias aéreas superiores existentes amostragem técnicas5 e amostragem repetitiva permitiu a geração de dados cinéticos seguindo o desafio da via aérea com alérgeno23,24,25, endotoxina bacteriana26 e viral-tipo TLR agonistas (JAI, a. et al., manuscrito em preparação). AT também tem sido usado em recém-nascidos para investigar a história natural da atopia27,28,29 e na bronquiolite viral30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) é um procedimento para a coleção de MLF na via aérea inferior que foi desenvolvida por Olympus31,32,33. Infelizmente, este sistema BMS é apenas licenciado no Japão. Olympus fornecer dois sistemas BMS: um com um poliéster hidroxilado fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, e um com um algodão sonda n3833,, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. um obstáculo tem sido que a sonda BMS usada em pacientes com asma causados contato da mucosa, sangramento, com metade de todas as amostras contaminadas com sangue. Os autores concluíram que não era viável a amostra MLF usando este sistema BMS de vias aéreas periféricas em pacientes de asma43.
Como alternativa, temos desenvolvido BA usando uma SAM suave que pode ser executado durante a investigação bronchoscopic das vias aéreas inferiores, incluindo a infecção experimental de indivíduos asmáticos com rinovírus6a seguir. O dispositivo de BA consiste de: um cateter externo oco, uma peça de mão que na ativação extrusão o SAM e um fio-guia central de plástico que tem o SAM em sua extremidade. Quanto a AT, BA kits são fabricados com materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. Além disso, dispositivos são CE marcado e são fornecidos gama irradiados. Faixa de SAM é macio, absorvente e tem rápida absorção para coleta de amostra. Também tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. O dispositivo pode caber através do canal de trabalho de um broncoscópio e pode ser usado para rapidamente e com precisão da amostra MLF em locais específicos de interesse dentro das vias aéreas. Ao contrário de BAL ou BMS, BA não resulta em sangramento de contato ou após o procedimento adicional desconforto ao paciente.
Cuidadosa consideração deve ser dada para o processamento de amostras de at e BA. As amostras podem ser directamente congelado e processadas em lotes ou pode ser processada imediatamente. O tipo de processamento pode ser adaptado para determinadas aplicações a jusante, incluindo os imunoensaios de quimiocinas e citocinas, imunoglobulinas ou elutions de viral, bacteriana, e a célula hospedeira associado do RNA. Apresentamos a coleção clínica e o laboratório associadas at e BA como um guia para os investigadores clínicos de técnicas de processamento.

<table><tbody><tr><td>Nasosorção (adulto, 7 mm de largura)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>Diferentes tamanhos estão disponíveis para diferentes grupos/idades de pacientes.</td></tr><tr><td>Broncosorção</td><td>Hunt Developments</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>Tamanho mínimo do canal do broncoscópio 2mm; Comprimento máximo de trabalho 815mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtros de tubo de centrífuga (sem membrana)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtros de tubo de centrífuga (membrana de 0,22um)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>Para esterilização de amostras com risco de infecção.</td></tr><tr><td>Tampão de ensaio (eluição)</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>Não listado no site da Millipore, mas disponível por meio de empresas de suprimentos de laboratório ou de consulta geral, como a Cedarlane. Contém 0,05% de Tween-20 e 1% de BSA.</td></tr><tr><td>Tampão de lise celular NP-40</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>Adicionar albumina de soro bovino a 1% (p/v). Pode recuperar níveis absolutos mais altos de mediadores.</td></tr><tr><td>Tampão RLT (extração de RNA)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Permite a recuperação de RNA de amostras de nasossorção e broncosorção.</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>Para eluição de amostras a serem usadas em aplicações de HPLC</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 ml</td> Os tubos <td>Costar</td><td>3213</td><td>de 2 ml são necessários para os filtros de tubo Spin-X, os tubos tradicionais de 1,5 ml não se encaixam neles.</td></tr></tbody></table>

absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Os métodos de absorção nasal (NA) e absorção brônquica (BA) usam matrizes absorventes sintéticas (SAM) para absorver o líquido de mucosa (MLF) do trato respiratório humano. NA é uma técnica não-invasiva que absorve o líquido do corneto inferior e causa desconforto mínimo. AT produziu resultados reprodutíveis com a capacidade de repetir frequentemente a amostragem das vias aéreas superiores.
Por comparação, métodos alternativos de mucosa respiratória, tais como a aspiração nasofaríngea (NPA) e limpeza convencional, de amostragem são mais invasivos e podem resultar em maior variabilidade de dados. Outros métodos têm limitações, por exemplo, biópsias e procedimentos brônquicos são invasivos, escarro contém muitos mortos e morrendo células e requer a liquefação, condensado do ar exalado (EBC) contém água e saliva e lavagem as amostras são diluídas e variável.
BA pode ser realizada através do canal de trabalho de um broncoscópio na clínica. A amostragem é bem tolerada e pode ser realizada em vários locais na via aérea. BA resultados em amostras MLF, sendo menos diluído do que amostras de lavado broncoalveolar (BAL) de lavagem.
Este artigo demonstra as técnicas de at e BA, bem como o processamento laboratorial das amostras resultantes, que pode ser adaptada para o biomarcador de jusante desejada sendo medido. Estas técnicas de absorção são alternativas úteis para as técnicas de amostragem convencional usadas em pesquisa clínica respiratória.

AT tem sido utilizada em uma série de estudos para facilmente e não invasiva mede a inflamação da mucosa. Após a administração do alérgeno para o nariz, observam-se níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) para subir e descer em poucos minutos (Figura 1), em consonância com a degranulação de mastócitos (Thwaites et al., manuscrito em preparação). Além disso, os mediadores da inflamação do tipo II, tais como IL-5 (Figura 2, reproduzido com permissão de 24), podem ser medidos após alérgeno nasal desafio23,24horas. Na infecção experimental de asmáticos alérgicos e controles saudáveis, at foi usado para medir um painel de mediadores, incluindo o interferão-gama (IFN-γ), ao longo de 7 dias (Figura 3, reimpresso com permissão de 6). Além disso, na infecção natural pelo vírus sincicial respiratório (RSV) dos lactentes, at demonstrou RSV para ser associado com os níveis elevados de citocinas inflamatórias, tais como IFN-γ, em relação ao não-RSV lactentes com bronquiolite e controles saudáveis ( Figura 4, reimpresso com permissão de 30). Curiosamente, esta discriminação entre RSV e não-RSV bronquiolite não foi significativa em vez de correspondência amostras NPA (Figura 4).
BA também foi usada durante a infecção experimental de asmáticos alérgicas com rinovírus. No dia 4 de infecção por rinovírus, níveis de IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 foram elevados da linha de base (Figura 5; A, B, C e D, respectivamente). Além disso, esta técnica demonstrou elevados níveis de IL-5 na via aérea inferior de asmáticos alérgicas durante a infecção por rinovírus, em relação a controles saudáveis (Figura 5) (Figura 5 reimpresso com permissão de 6).
Estes resultados representativos foram gerados de amostras eluídas usando buffer de ensaio contendo 0.05% Tween-20% e 1% de BSA (ver Tabela de materiais).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Geração rápida e liberação de prostaglandina-D2, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Os níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) medido a partir eluídos absorção nasal em amostras seriais seguindo o desafio de alérgeno nasal com o pólen de grama Timothy (n = 5). Cada linha representa dados de um indivíduo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Medição cinética de IL-5, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Produção de IL-5, em amostras de absorção nasal serial seguindo o desafio de alérgeno nasal. 3 repita o alérgeno desafio estudos foram realizados, com os participantes (n = 19) receberam placebo (azul), baixa de prednisona oral dose (10 mg) (laranja), ou prednisona oral de alta dose (25 mg) (vermelha) uma hora antes da administração do alérgeno. As linhas indicam a média geométrica e barras de erro são intervalos de confiança de 95% de todos os participantes. (Figura reimpresso com permissão da Leaker et al, Imunologia da mucosa, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Indução de Interferon-γ durante infecção rinovírus. Durante o desafio de infecção de adultos saudáveis (n = 11, azul) e asmáticos alérgicos (n = 28, vermelho) com 16-rinovírus, amostragem de absorção nasal foi utilizada para medir os níveis de interferon-γ (IFN-γ). Dados são representados como parcelas de espaguete A) cru dos indivíduos e níveis B) medianos com barras de erro que indicam faixas de percentis. (Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina Interferon-γ elevado associado com infecção pelo VSR dos lactentes. Absorção nasal e aspiração nasofaríngea (NPA) foram usados para medir os níveis de interferão-γ em lactentes com bronquiolite associada com infecção por vírus sincicial respiratório (VSR) (vermelho, n = 12), um patógeno respiratório não-RSV (verde, n = 12) e saudável controles (azul, n = 9). Os dados foram analisados usando um teste de Kruskall-Wallis com correção de Dunn para comparações múltiplas (* * *p&lt; 0,001). Linhas denota valores medianos e barras de erro são faixas de percentis. (Figura modificada com a permissão de Thwaites et al 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediadores inflamatórios em amostras de absorção brônquica durante a infecção de rinovírus. Após infecção do rinovírus-16 de controles saudáveis (n = 10, azul) e alérgicos asmáticos voluntários (n = 23, vermelho), absorção brônquica foi usada para medir os níveis de IFN-γ A), CXCL11 B), C) IL-10 e IL-5 D) na linha de base e no dia 4 de infecção. Dados analisados por Wilcoxon assinaram rank test (amostras correspondentes) e teste de Mann-Whitney (incomparáveis amostras). Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Hoje, vamos demonstrar a técnica de nasossorção, uma forma de amostragem de mucosa de precisão usando uma matriz absorvente sintética para absorver o fluido de revestimento da mucosa. O amostrador de nasossorção consiste em uma alça e SAM em um criotubo estéril. O SAM consiste em polímeros, fibras ou espuma, e são especialmente selecionados para serem macios e absorventes, com rápida absorção para coleta de amostras.Os SAMs também têm ligação mínima a proteínas, para permitir a eluição eficiente das secreções absorvidas. A nasossorção é uma técnica muito suave e não invasiva que pode ser realizada em pacientes de todas as idades, incluindo bebês. Além disso, a amostragem em série, mesmo a cada poucos minutos, é possível.Ao realizar a nasossorção, você deve primeiro lavar as mãos e colocar luvas, de preferência na frente do paciente. Primeiro, a cavidade nasal é inspecionada. Recomendamos o uso de uma lanterna de cabeça e que o clínico use o polegar não dominante para retrair o nariz do paciente para visualizar a cavidade nasal.Um espéculo nasal geralmente não é necessário. Se você olhar para a cavidade nasal, as narinas, ou narinas, não são redondas em seção transversal e vão direto para trás. Você geralmente vê o corneto inferior como uma protuberância, um recuo na parede lateral da narina, com o septo nasal formando a parede medial lisa e plana.Queremos amostrar a partir deste corneto inferior, uma vez que o epitélio subjacente é um epitélio ciliado simples do trato respiratório. Durante a amostragem, o SAM de nasossorção é passado suavemente pelo lúmen, orientando-o para ser plano contra o corneto inferior. Em seguida, use o dedo indicador para pressionar o SAM na mucosa nasal.Isso pode causar uma leve cócega com possível lacrimejamento ocular à medida que o MLF é absorvido. Geralmente usamos uma absorção cronometrada de 60 segundos. O dispositivo de nasossorção é então removido da narina, colocado de volta no criotubo e pode ser imediatamente armazenado em gelo e depois ultracongelado.Alternativamente, você pode prosseguir imediatamente para eluir o MLF. A nasossorção está sendo estudada em uma variedade de modelos de desafio da mucosa nasal e também em diferentes doenças das vias aéreas. No entanto, esse método relativamente novo ainda requer validação formal em relação a outros métodos de amostragem respiratória.A técnica de broncosorção usa uma matriz absorvente sintética para coletar amostras do fluido de revestimento mucoso do brônquio. O método é realizado por pessoal especializado por meio de um broncoscópio de fibra óptica. O dispositivo de broncosorção consiste em um cateter oco externo com um fio-guia plástico central.Este tem um SAM na extremidade que pode ser extrudado na ativação da peça de mão. Como a nasossorção, a tira SAM é macia e absorvente, com rápida absorção para coleta de amostras. Ele também tem ligação mínima a proteínas para permitir a eluição eficiente das secreções absorvidas.Antes de colocar o dispositivo de broncosorção no broncoscópio, é comum verificar se o SAM está extrudando e retirando de volta para o cateter com facilidade. Vamos agora demonstrar o método de broncissossorção usando um simulador de broncoscopia. Primeiro, uma broncoscopia padrão é realizada, passando o broncoscópio pela traqueia, para o brônquio principal direito e para o nível do brônquio intermediário próximo à divisão dos lobos inferior direito e médio direito.Uma vez inserido neste nível, cinco etapas são seguidas. Um, cateter para baixo. Insira o cateter de broncosorção através do canal de operação do broncoscópio até que a ponta branca seja visível nas vias aéreas até um máximo de um centímetro distal à extremidade do broncoscópio.Mantenha o broncoscópio e a ponta do cateter no centro do lúmen das vias aéreas. Tenha cuidado para minimizar o contato entre a ponta do cateter e a mucosa brônquica para reduzir o risco de danos à mucosa. Dois, SAM fora.Pressione a alça do dispositivo de broncosorção para que a tira SAM seja extrudada no lúmen das vias aéreas do lobo médio direito ou inferior direito. Sob visão direta, dobre a ponta do broncoscópio para garantir que o SAM esteja fazendo contato com o fluido de revestimento da mucosa na parede das vias aéreas. Deixe a tira SAM dentro das vias aéreas, plana na parede da mucosa por 30 segundos cronometrados.Três, SAM em. Sob visão direta, retraia o SAM diretamente de volta para o cateter. Ao retrair, certifique-se de que a sonda SAM úmida esteja reta.Se necessário, o cateter e a ponta do broncoscópio podem ser trazidos de volta para endireitar o SAM. Se houver dificuldade em retrair o SAM, retire todo o dispositivo com o SAM extrudado de volta para fora das vias aéreas. Quatro, cateter para cima.Retire todo o cateter do canal de operação do broncoscópio. Cinco, corte o SAM. O SAM é cortado com uma tesoura estéril, colocado em um criotubo e deve ser imediatamente colocado no gelo antes de ser ultracongelado ou eluído diretamente.O videoclipe a seguir mostra a extrusão de um SAM nas vias aéreas de um paciente submetido a uma broncoscopia de pesquisa. A broncosorção está sendo estudada atualmente em uma variedade de doenças pulmonares diferentes. Esperamos que este método de amostragem de mucosa de precisão seja útil na investigação diagnóstica e na estratificação e monitoramento de pacientes.Processamento laboratorial Após nasossorção e broncosorção. A eluição do fluido de revestimento mucoso da matriz de absorção sintética. Hoje vamos demonstrar os princípios gerais do processamento de amostras laboratoriais após as técnicas não invasivas de amostragem de mucosa de nasossorção e broncossorção.Em particular, demonstraremos como eluvamos a amostra de fluido de revestimento da mucosa da matriz de absorção sintética. No ponto de coleta, as amostras devem ser colocadas em gelo para transporte para o laboratório. As amostras podem ser processadas imediatamente ou podem ser colocadas diretamente no congelador em seu tubo de amostra original para eluição em uma data posterior.Se o processamento imediato estiver sendo realizado, a amostra pode ser transferida em gelo para o laboratório em seu tubo de amostra original. Ou o SAM pode ser destacado e colocado em tampão de eluição no ponto de coleta e, em seguida, posteriormente transferido em gelo para o laboratório. As amostras podem permanecer no gelo em tampão ou dentro de seu tubo de amostra por várias horas antes do processamento.Uma etapa de lavagem antes da centrifugação e eluição por centrifugação do SAM visa otimizar o rendimento da amostra. Para conseguir isso, o SAM é inserido em um tubo Eppendorf junto com o bugger de extração desejado. A amostra é então misturada em um misturador de vórtice por 30 segundos para lavar o SAM de fluidos e biomoléculas frouxamente ligados.Para garantir a recuperação completa da amostra, a eluição por rotação é realizada adicionando o SAM úmido a um inserto de centrifugação dentro do mesmo tubo Eppendorf usado para lavagem. Pinças limpas devem ser usadas para este procedimento e devem ser trocadas entre as amostras para evitar contaminação. Este método usa centrifugação para extrair o fluido do SAM.Centrifugamos amostras por 20 minutos a 16.000 g em uma centrífuga resfriada a quatro graus Celsius. O bug de eluição usado será determinado pela aplicação desejada. Comumente usamos tampão de ensaio de aminoácidos contendo proteínas ou tampão de lise de RNA.Dois tipos de filtro de rotação podem ser usados. O primeiro contém apenas uma malha de plástico que mantém o SAM no lugar, permitindo a eluição total dos fluidos. Alternativamente, se estiver trabalhando com materiais infecciosos, filtros de rotação com um tamanho de poro de 0,2 micrômetro podem ser usados.Esses filtros descontaminam amostras infectadas e são adequados para amostras com suspeita de infecção microbacteriana. Se tais filtros forem necessários, é importante incluir uma etapa de pré-incubação em que o tampão proteico seja absorvido pelo filtro antes da adição da amostra. Esta etapa minimiza a ligação de mediadores ao filtro por absorção inespecífica de proteínas.A seguir está um exemplo de método usado por nosso laboratório para processamento de nasossorção e broncosorção de amostras que não requerem uma etapa de descontaminação, incluindo patógenos de classe dois. Etapa um, o SAM é colocado em um Eppendorf contendo o buffer e o vórtice apropriados por 30 segundos. Para nasossorção, normalmente usamos 300 microlitros de tampão e para broncossorção 100 microlitros.Etapa dois, o SAM é removido usando uma pinça e colocado em um copo de filtro de malha de plástico junto com o tampão usado para lavar o SAM. Etapa três, o copo do filtro de malha de plástico contendo o SAM é devolvido ao Eppendorf original. Etapa quatro, o Eppendorf contendo copo de filtro, tampão e SAM é centrifugado por 20 minutos a 16.000 g a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, o copo do filtro contendo o SAM é removido e descartado. O eluimento pode então ser aliquotado e ultracongelado para análise posterior. A amostragem de nasossorção foi aplicada a vários ambientes de pesquisa respiratória clínica.Isso inclui medições de mediadores inflamatórios durante o desafio com alérgenos nasais, como prostaglandina D2 e interleucina 5. É importante ressaltar que, nessas configurações de modelo de desafio, a amostragem por nasossorção permite o perfil cinético frequente dos níveis de mediador, onde a amostragem pode ser repetida a cada poucos minutos. A nasossorção também foi usada durante um desafio de infecção por rinovírus em indivíduos saudáveis e asmáticos alérgicos, onde a nasossorção foi repetida diariamente durante o período do estudo.O uso de nasossorção no estudo permitiu a caracterização sensível das respostas do interferon à infecção por rinovírus. Finalmente, usamos amostragem de nasossorção para estudar bebês com bronquiolite. Neste estudo, a infecção pelo vírus sincicial respiratório foi associada a níveis mais elevados de mediadores inflamatórios, como o interferon gama.É importante ressaltar que a amostragem com nasossorção permite a inclusão de um grupo controle saudável em estudos em bebês. A broncosorção também foi usada no estudo de desafio do rinovírus em indivíduos saudáveis e asmáticos alérgicos. Este estudo demonstrou aumentos significativos nos mediadores inflamatórios interferon gama, ITAC, IL-10 e IL-5 nas vias aéreas inferiores durante a infecção por rinovírus.A inclusão dessa técnica nos estudos das vias aéreas inferiores cria a possibilidade de medir os níveis de mediadores, que podem ser indetectáveis por métodos convencionais, como o lavado broncoalveolar. Em conclusão, o fluido de revestimento mucoso pode ser obtido de forma não invasiva e tem um potencial empolgante para medir as respostas inflamatórias na infecção e inflamação. Os métodos de eluição devem ser adaptados de acordo com a natureza das amostras e os parâmetros a medir.Em particular, o MLF pode ser usado para medir citocinas e quimiocinas da mucosa, infecções virais, carga viral, infecções bacterianas e fúngicas e o microbioma e anticorpos da mucosa. Finalmente, os métodos de amostragem e eluição de mucosa exigirão desenvolvimento personalizado e validação cuidadosa para projetos individuais.

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Este vídeo demonstra a separação de neutrófilos das secreções traqueais usando um dispositivo microfluídico com canais espirais. O dispositivo alcança uma separação eficiente com base no tamanho da célula, utilizando espessuras variadas e canais em forma trapezoidal. A interação entre as forças resulta em grandes neutrófilos se acumulando perto da parede interna, enquanto os eritrócitos e os agregados de mucina permanecem perto da parede externa, garantindo a separação eficaz dos neutrófilos.

Separação de neutrófilos sem marcação da secreção traqueal usando canal microfluídico espiral

Este vídeo demonstra a quantificação dos níveis de mediador imunológico no extrato fluido de revestimento da mucosa nasal humana neonatal. Um sistema de ensaio multiplex baseado em eletroquimioluminescência mede esses mediadores avaliando a intensidade da luz emitida quando eles são excitados.

Quantificação dos níveis de mediadores imunológicos no fluido de revestimento da mucosa humana

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Este artigo descreve técnicas de broncoscopia no pulmão bovino em condições experimentais, ou seja, a inoculação broncoscopicamente guiada, lavado bronco-alveolar, escovado brônquico e biópsia pulmonar transbrônquica.

O pulmão bovino em Investigação Biomédica: visualmente guiada Broncoscopia, intrabrônquico Inoculação e<em&gt; In Vivo</em&gt; Técnicas de Amostragem

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

Nesta pesquisa, vamos demonstrar um método de separação de neutrófilos rótulo livre de secreções clínico das vias aéreas utilizando a operação de circuito fechado de microfluídica inercial espiral. O método proposto poderia expandir os ensaios clínicos em vitro para várias doenças respiratórias.

Livre de rótulo neutrófilo enriquecimento de secreção do paciente-derivado das vias aéreas usando microfluídica inercial de circuito fechado

Para garantir uma análise funcional ciliar bem-sucedida e de alta qualidade para o diagnóstico da DCP, um método preciso e cuidadoso para amostragem e processamento do epitélio respiratório é essencial. Para continuar prestando serviço de diagnóstico de PCD durante a pandemia de COVID-19, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi atualizado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.

Amostragem e processamento de escovação nasal usando videomicroscopia ciliar digital de alta velocidade – adaptação para a pandemia de COVID-19

Vários patógenos bacterianos podem causar infecções do trato respiratório e levar a sérios problemas de saúde se não forem detectados com precisão e tratados prontamente. A detecção rápida e precisa desses patógenos por meio de amplificação isotérmica mediada por loop fornece gerenciamento e controle eficazes de infecções do trato respiratório em ambientes clínicos.

Detecção rápida de patógenos bacterianos que causam infecções do trato respiratório inferior por meio de amplificação isotérmica mediada por loop baseada em chip microfluídico

O presente protocolo descreve um novo método para evitar a contaminação do sangue no líquido de lavagem nasal murino (NLF). Como esse método garante a coleta de NLF sem contaminação do sangue, ele permite detecções mais precisas de componentes imunológicos e vários patógenos respiratórios.

Coleta de fluido de lavagem nasal murina sem contaminação do sangue

Este protocolo descreve um método LAMP baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, que permite a detecção na assistência médica de 15 patógenos causadores de infecções do trato respiratório inferior em pacientes de terapia intensiva dentro de uma hora.

Detecção Rápida no Ponto de Atendimento de Patógenos para Infecções do Trato Respiratório Inferior em Pacientes de UTI

Aprenda as técnicas de nasossucção e broncossucção para amostragem de fluido da mucosa respiratória humana usando matrizes absorventes sintéticas. Esses métodos não invasivos permitem coleta padronizada em pacientes de todas as idades.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras (Vídeo) | JoVE Journal

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

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