Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

Hoje, vamos demonstrar a técnica de nasossorção, uma forma de amostragem de mucosa de precisão usando uma matriz absorvente sintética para absorver o fluido de revestimento da mucosa. O amostrador de nasossorção consiste em uma alça e SAM em um criotubo estéril. O SAM consiste em polímeros, fibras ou espuma, e são especialmente selecionados para serem macios e absorventes, com rápida absorção para coleta de amostras.

Os SAMs também têm ligação mínima a proteínas, para permitir a eluição eficiente das secreções absorvidas. A nasossorção é uma técnica muito suave e não invasiva que pode ser realizada em pacientes de todas as idades, incluindo bebês. Além disso, a amostragem em série, mesmo a cada poucos minutos, é possível.

Ao realizar a nasossorção, você deve primeiro lavar as mãos e colocar luvas, de preferência na frente do paciente. Primeiro, a cavidade nasal é inspecionada. Recomendamos o uso de uma lanterna de cabeça e que o clínico use o polegar não dominante para retrair o nariz do paciente para visualizar a cavidade nasal.

Um espéculo nasal geralmente não é necessário. Se você olhar para a cavidade nasal, as narinas, ou narinas, não são redondas em seção transversal e vão direto para trás. Você geralmente vê o corneto inferior como uma protuberância, um recuo na parede lateral da narina, com o septo nasal formando a parede medial lisa e plana.

Queremos amostrar a partir deste corneto inferior, uma vez que o epitélio subjacente é um epitélio ciliado simples do trato respiratório. Durante a amostragem, o SAM de nasossorção é passado suavemente pelo lúmen, orientando-o para ser plano contra o corneto inferior. Em seguida, use o dedo indicador para pressionar o SAM na mucosa nasal.

Isso pode causar uma leve cócega com possível lacrimejamento ocular à medida que o MLF é absorvido. Geralmente usamos uma absorção cronometrada de 60 segundos. O dispositivo de nasossorção é então removido da narina, colocado de volta no criotubo e pode ser imediatamente armazenado em gelo e depois ultracongelado.

Alternativamente, você pode prosseguir imediatamente para eluir o MLF. A nasossorção está sendo estudada em uma variedade de modelos de desafio da mucosa nasal e também em diferentes doenças das vias aéreas. No entanto, esse método relativamente novo ainda requer validação formal em relação a outros métodos de amostragem respiratória.

A técnica de broncosorção usa uma matriz absorvente sintética para coletar amostras do fluido de revestimento mucoso do brônquio. O método é realizado por pessoal especializado por meio de um broncoscópio de fibra óptica. O dispositivo de broncosorção consiste em um cateter oco externo com um fio-guia plástico central.

Este tem um SAM na extremidade que pode ser extrudado na ativação da peça de mão. Como a nasossorção, a tira SAM é macia e absorvente, com rápida absorção para coleta de amostras. Ele também tem ligação mínima a proteínas para permitir a eluição eficiente das secreções absorvidas.

Antes de colocar o dispositivo de broncosorção no broncoscópio, é comum verificar se o SAM está extrudando e retirando de volta para o cateter com facilidade. Vamos agora demonstrar o método de broncissossorção usando um simulador de broncoscopia. Primeiro, uma broncoscopia padrão é realizada, passando o broncoscópio pela traqueia, para o brônquio principal direito e para o nível do brônquio intermediário próximo à divisão dos lobos inferior direito e médio direito.

Uma vez inserido neste nível, cinco etapas são seguidas. Um, cateter para baixo. Insira o cateter de broncosorção através do canal de operação do broncoscópio até que a ponta branca seja visível nas vias aéreas até um máximo de um centímetro distal à extremidade do broncoscópio.

Mantenha o broncoscópio e a ponta do cateter no centro do lúmen das vias aéreas. Tenha cuidado para minimizar o contato entre a ponta do cateter e a mucosa brônquica para reduzir o risco de danos à mucosa. Dois, SAM fora.

Pressione a alça do dispositivo de broncosorção para que a tira SAM seja extrudada no lúmen das vias aéreas do lobo médio direito ou inferior direito. Sob visão direta, dobre a ponta do broncoscópio para garantir que o SAM esteja fazendo contato com o fluido de revestimento da mucosa na parede das vias aéreas. Deixe a tira SAM dentro das vias aéreas, plana na parede da mucosa por 30 segundos cronometrados.

Três, SAM em. Sob visão direta, retraia o SAM diretamente de volta para o cateter. Ao retrair, certifique-se de que a sonda SAM úmida esteja reta.

Se necessário, o cateter e a ponta do broncoscópio podem ser trazidos de volta para endireitar o SAM. Se houver dificuldade em retrair o SAM, retire todo o dispositivo com o SAM extrudado de volta para fora das vias aéreas. Quatro, cateter para cima.

Retire todo o cateter do canal de operação do broncoscópio. Cinco, corte o SAM. O SAM é cortado com uma tesoura estéril, colocado em um criotubo e deve ser imediatamente colocado no gelo antes de ser ultracongelado ou eluído diretamente.

O videoclipe a seguir mostra a extrusão de um SAM nas vias aéreas de um paciente submetido a uma broncoscopia de pesquisa. A broncosorção está sendo estudada atualmente em uma variedade de doenças pulmonares diferentes. Esperamos que este método de amostragem de mucosa de precisão seja útil na investigação diagnóstica e na estratificação e monitoramento de pacientes.

Processamento laboratorial Após nasossorção e broncosorção. A eluição do fluido de revestimento mucoso da matriz de absorção sintética. Hoje vamos demonstrar os princípios gerais do processamento de amostras laboratoriais após as técnicas não invasivas de amostragem de mucosa de nasossorção e broncossorção.

Em particular, demonstraremos como eluvamos a amostra de fluido de revestimento da mucosa da matriz de absorção sintética. No ponto de coleta, as amostras devem ser colocadas em gelo para transporte para o laboratório. As amostras podem ser processadas imediatamente ou podem ser colocadas diretamente no congelador em seu tubo de amostra original para eluição em uma data posterior.

Se o processamento imediato estiver sendo realizado, a amostra pode ser transferida em gelo para o laboratório em seu tubo de amostra original. Ou o SAM pode ser destacado e colocado em tampão de eluição no ponto de coleta e, em seguida, posteriormente transferido em gelo para o laboratório. As amostras podem permanecer no gelo em tampão ou dentro de seu tubo de amostra por várias horas antes do processamento.

Uma etapa de lavagem antes da centrifugação e eluição por centrifugação do SAM visa otimizar o rendimento da amostra. Para conseguir isso, o SAM é inserido em um tubo Eppendorf junto com o bugger de extração desejado. A amostra é então misturada em um misturador de vórtice por 30 segundos para lavar o SAM de fluidos e biomoléculas frouxamente ligados.

Para garantir a recuperação completa da amostra, a eluição por rotação é realizada adicionando o SAM úmido a um inserto de centrifugação dentro do mesmo tubo Eppendorf usado para lavagem. Pinças limpas devem ser usadas para este procedimento e devem ser trocadas entre as amostras para evitar contaminação. Este método usa centrifugação para extrair o fluido do SAM.

Centrifugamos amostras por 20 minutos a 16.000 g em uma centrífuga resfriada a quatro graus Celsius. O bug de eluição usado será determinado pela aplicação desejada. Comumente usamos tampão de ensaio de aminoácidos contendo proteínas ou tampão de lise de RNA.

Dois tipos de filtro de rotação podem ser usados. O primeiro contém apenas uma malha de plástico que mantém o SAM no lugar, permitindo a eluição total dos fluidos. Alternativamente, se estiver trabalhando com materiais infecciosos, filtros de rotação com um tamanho de poro de 0,2 micrômetro podem ser usados.

Esses filtros descontaminam amostras infectadas e são adequados para amostras com suspeita de infecção microbacteriana. Se tais filtros forem necessários, é importante incluir uma etapa de pré-incubação em que o tampão proteico seja absorvido pelo filtro antes da adição da amostra. Esta etapa minimiza a ligação de mediadores ao filtro por absorção inespecífica de proteínas.

A seguir está um exemplo de método usado por nosso laboratório para processamento de nasossorção e broncosorção de amostras que não requerem uma etapa de descontaminação, incluindo patógenos de classe dois. Etapa um, o SAM é colocado em um Eppendorf contendo o buffer e o vórtice apropriados por 30 segundos. Para nasossorção, normalmente usamos 300 microlitros de tampão e para broncossorção 100 microlitros.

Etapa dois, o SAM é removido usando uma pinça e colocado em um copo de filtro de malha de plástico junto com o tampão usado para lavar o SAM. Etapa três, o copo do filtro de malha de plástico contendo o SAM é devolvido ao Eppendorf original. Etapa quatro, o Eppendorf contendo copo de filtro, tampão e SAM é centrifugado por 20 minutos a 16.000 g a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, o copo do filtro contendo o SAM é removido e descartado. O eluimento pode então ser aliquotado e ultracongelado para análise posterior. A amostragem de nasossorção foi aplicada a vários ambientes de pesquisa respiratória clínica.

Isso inclui medições de mediadores inflamatórios durante o desafio com alérgenos nasais, como prostaglandina D2 e interleucina 5. É importante ressaltar que, nessas configurações de modelo de desafio, a amostragem por nasossorção permite o perfil cinético frequente dos níveis de mediador, onde a amostragem pode ser repetida a cada poucos minutos. A nasossorção também foi usada durante um desafio de infecção por rinovírus em indivíduos saudáveis e asmáticos alérgicos, onde a nasossorção foi repetida diariamente durante o período do estudo.

O uso de nasossorção no estudo permitiu a caracterização sensível das respostas do interferon à infecção por rinovírus. Finalmente, usamos amostragem de nasossorção para estudar bebês com bronquiolite. Neste estudo, a infecção pelo vírus sincicial respiratório foi associada a níveis mais elevados de mediadores inflamatórios, como o interferon gama.

É importante ressaltar que a amostragem com nasossorção permite a inclusão de um grupo controle saudável em estudos em bebês. A broncosorção também foi usada no estudo de desafio do rinovírus em indivíduos saudáveis e asmáticos alérgicos. Este estudo demonstrou aumentos significativos nos mediadores inflamatórios interferon gama, ITAC, IL-10 e IL-5 nas vias aéreas inferiores durante a infecção por rinovírus.

A inclusão dessa técnica nos estudos das vias aéreas inferiores cria a possibilidade de medir os níveis de mediadores, que podem ser indetectáveis por métodos convencionais, como o lavado broncoalveolar. Em conclusão, o fluido de revestimento mucoso pode ser obtido de forma não invasiva e tem um potencial empolgante para medir as respostas inflamatórias na infecção e inflamação. Os métodos de eluição devem ser adaptados de acordo com a natureza das amostras e os parâmetros a medir.

Em particular, o MLF pode ser usado para medir citocinas e quimiocinas da mucosa, infecções virais, carga viral, infecções bacterianas e fúngicas e o microbioma e anticorpos da mucosa. Finalmente, os métodos de amostragem e eluição de mucosa exigirão desenvolvimento personalizado e validação cuidadosa para projetos individuais.