Criando e aplicando uma referência para facilitar a discussão e a classificação das proteínas em diversos grupos

O objetivo geral deste procedimento é usar um software de planilha padrão para desenvolver uma referência para proteínas divergentes em um grupo que carece de critérios coerentes de nomenclatura e classificação. Este método pode ajudar a esclarecer as relações entre proteínas relacionadas que têm nomenclatura confusa ou inconsistente, como a superfamília alfa-beta estabilizada com cisteína de peptídeos defensivos que inclui defesas de invertebrados. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma representação visual simples das proteínas de interesse.

Para começar, identifique as características definidoras do grupo de proteínas de interesse. Por exemplo, a dobra alfa-beta CS na estrutura da solução de defesa contra insetos e ajuda de phormia terraenovae define a superfamília alfa-beta CS. Essa dobra também inclui um motivo menor chamado hélice estabilizada por cisteína, que é identificado por CXXXC a montante de um CXC.

As quatro cisteínas formam duas ligações dissulfeto. Para completar o motivo alfa-beta CS, uma terceira ligação dissulfeto é formada por um par adicional de cisteínas. Em última análise, é fundamental conhecer pelo menos algumas características importantes relacionadas à estrutura ou função da proteína.

Sem isso, não há base para gerar uma referência. Agora, insira esses recursos de definição em uma planilha. Use colunas para os recursos conservados e para representar os espaços entre esses recursos.

Mantenha as colunas largas o suficiente para caber nos números e dê a elas uma largura consistente. Nas linhas, descreva as sequências. Para indicar uma sequência como um recurso, preencha a caixa do recurso com cor, usando a função de preenchimento.

Em seguida, para indicar o espaçamento entre os recursos, insira o número de aminoácidos na caixa entre. Agora, adicione sequências representativas que foram previamente estabelecidas como membros do grupo com base em bancos de dados estruturais e resultados publicados. Conforme necessário, adicione recursos que provavelmente definirão um subgrupo de sequências, como uma cisteína extra.

Se faltarem recursos em uma determinada sequência, deixe a caixa vazia e combine-a com caixas que representam aminoácidos intermediários. Para fazer isso, use a função Mesclar e Centralizar. Uma vez que as sequências representativas tenham sido inseridas, identifique grupos de sequências claramente relacionadas.

Em seguida, resuma as características desses grupos. Quando o número de aminoácidos entre os recursos variar, use um hífen para indicar um intervalo ou barras para indicar alguns números específicos. Conforme necessário, anote criativamente os recursos que podem ser relevantes ou não são comuns o suficiente para serem incluídos na referência.

Por exemplo, como as cisteínas são importantes na superfamília, a presença de cisteínas adicionais pode ser rotulada. Às vezes, ao adicionar sequências recém-identificadas à planilha, as sequências de uma espécie se enquadram em vários grupos diferentes da superfamília, como para tardígrados. Depois de concluídas, as linhas da planilha podem ser classificadas para destacar a variação dentro de uma espécie ou a variação entre grupos taxonômicos.

Esta demonstração usa o software MEGA 6 disponível gratuitamente. No entanto, outros softwares podem ser usados de forma semelhante. Para iniciar um novo alinhamento, selecione Editar/Criar alinhamento na guia Alinhar.

Em seguida, selecione Criar um novo alinhamento, na caixa exibida e clique em OK. Em seguida, selecione Proteína. Agora, selecione Inserir sequência do arquivo, no menu Editar, para importar as sequências. As sequências devem estar no formato FASTA.

As cores de fundo que refletem diferentes tipos de aminoácidos são mostradas por padrão e podem ser desativadas com um botão de alternância, no menu Exibir. Depois que todas as sequências forem inseridas, clique no ícone do braço flexionado e, em seguida, em Alinhar proteína para alinhar as sequências usando o algoritmo muscular. Se a mensagem, Nada selecionado para alinhamento.

Selecionar tudo? aparecer, escolha OK. Alguns parâmetros podem ser alterados na janela pop-up, mas para esta demonstração, os padrões serão suficientes. Agora, verifique o alinhamento com base nas características importantes da superfamília de proteínas.

A barra superior mostra um asterisco em qualquer posição em que o aminoácido seja completamente conservado. O alinhamento inicial identifica três das quatro cisteínas conservadas. Uma sequência está claramente desalinhada.

Para corrigir uma sequência desalinhada, realce os traços e pressione a tecla Delete sem excluir acidentalmente os aminoácidos. Em seguida, mova os aminoácidos para o alinhamento adequado adicionando espaços. Depois de alinhar a sequência manualmente, observe que a última cisteína do motivo CXXXC é conservada em todo o alinhamento.

O ajuste manual geralmente é necessário para priorizar os recursos mais importantes das sequências. O alinhamento da planilha da superfamília alfa-beta CS previamente estabelecida revelou cinco padrões básicos de formação de ligações. As sequências de tardígrados recém-identificadas caíram no espectro completo desses padrões.

Em seguida, análises filogenéticas foram usadas para examinar como esse grupo de proteínas pode ter evoluído. No entanto, as sequências são geralmente curtas e altamente divergentes. Assim, as árvores resultantes foram mal resolvidas e ofereceram pouca visão.

O alinhamento de sequências múltiplas foi otimizado usando a referência, mas ainda houve baixa resolução na análise de máxima verossimilhança e na análise filogenética bayesiana. A maioria dos clados tinha apenas baixos níveis de suporte. No entanto, cinco pequenos grupos foram apoiados em pelo menos uma das duas árvores.

Sequências com diferentes números de cisteína dentro de um grupo taxonômico podem estar mais intimamente relacionadas do que sequências com o mesmo padrão de diferentes grupos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar um software de planilha para gerar uma visualização simples de características importantes da proteína. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que determinar as características mais relevantes para o grupo de proteínas é muitas vezes um processo iterativo, e a revisão da referência provavelmente será necessária.

Novas sequências sempre podem ser adicionadas a uma planilha, e é fácil ter várias versões que permitem adicionar novos recursos que podem ser úteis para classificação e análise. Embora o alinhamento da planilha permita fácil visualização de características estruturais e funcionais, outros métodos, como a análise filogenética, podem ser realizados para fornecer informações adicionais sobre as relações evolutivas.