Name: Uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a identificar microproteínas usando PhyloCSF no UCSC Genome Browser. Este protocolo acessível permite analisar regiões genômicas sem necessidade de treinamento prévio em bioinformática.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (HL-141630 e HL-160569) e da Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).

O protocolo descrito abaixo detalha as etapas para carregar e navegar nas faixas do navegador PhyloCSF no Navegador genoma UCSC (gerado por Mudge et al.49). Para dúvidas gerais sobre o Navegador de Genoma da UCSC, um extenso Guia do Usuário do Navegador genoma pode ser encontrado aqui: <a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</a>.
1. Carregando o PhyloCSF Track Hub para o navegador de genoma UCSC
<ol><li>Abra uma janela do navegador de internet e navegue até o Navegador de Genoma do UCSC (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>).</li>
	<li>Sob o título De ferramentas , selecione a opção Track Hubs . NOTA: A opção Track Hubs também pode ser encontrada na guia Meus dados .</li>
	<li>Na guia Centros Públicos , digite PhyloCSF na caixa de termos 'Pesquisa' . Clique no botão 'Pesquisar Centros públicos' .</li>
	<li>Conecte-se ao PhyloCSF clicando no botão Conectar para o Nome do Hub PhyloCSF (Descrição: potencial de codificação de proteínas evolutivas medida pelo PhyloCSF). NOTA: Este Track Hub será carregado para numerosos conjuntos, incluindo humano (hg19 e hg38) e mouse (mm10 e mm39).</li>
	<li>Depois de clicar em conectar, aguarde ser redirecionado para a página do Gateway do Navegador de Genoma do UCSC (<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a>).</li>
</ol>2. Navegar para genes de interesse usando identificadores genéticos
<ol><li>Selecione a espécie e o conjunto do genoma para consultar. Para consultar uma espécie diferente (por exemplo, mouse), selecione a espécie de interesse sob o título Procurar/Selecionar Espécies clicando no ícone apropriado ou digitar a espécie na caixa de texto que diz: Digite espécie, nome comum ou ID de montagem. NOTA: O conjunto está listado diretamente no título "Encontrar posição ". Normalmente, o padrão é a Assembleia Humana (por exemplo, dez de 2009 [GRCh37/hg19]).</li>
	<li>Escolha o conjunto para pesquisar no título 'Encontrar posição' usando o menu suspenso.</li>
	<li>Digite a posição, o símbolo genético ou os termos de pesquisa na caixa "Posição/Termo de Pesquisa " e clique em Ir para navegar até um gene de interesse no Navegador genoma.</li>
	<li>Se a pesquisa resultou em várias correspondências, aguarde ser redirecionada para uma página que exija a seleção de uma posição de interesse. Clique no gene de interesse apropriado.</li>
</ol>3. Navegar para regiões genômicas de interesse usando informações de sequência
<ol><li>Navegue até o Navegador de Genoma do UCSC (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>) e selecione a Ferramenta de Alinhamento semelhante a BLAST (BLAT) sob as nossas ferramentas que se dirigem para consultar uma sequência específica de DNA ou proteína. Como alternativa, passe o cursor sobre a guia Ferramentas e selecione a opção Blat ou siga este link: <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a>.</li>
	<li>Selecione as espécies (Genoma) e a Montagem de interesse usando os menus suspensos.</li>
	<li>Defina o tipo Desaída usando o menu suspenso.</li>
	<li>Cole a sequência de interesse na caixa de texto BLAT Search Genoma e clique em Enviar.</li>
	<li>Clique no link do navegador sob o título ACTIONS para navegar até a região genômica de interesse.</li>
</ol>4. Identificando sORFs conservados usando dados de faixa PhyloCSF
<ol><li>Escaneie visualmente a área genômica de interesse para pontuar positivamente as regiões de PhyloCSF (Figura 1). NOTA: Para obter uma explicação detalhada de como interpretar visualmente os escores do PhyloCSF no Navegador de Genoma do UCSC, consulte a seção de resultados representativos abaixo.</li>
	<li>Use o recurso zoom para ampliar regiões de interesse para examinar características de sequência e procurar códons de início/parada. Para ampliar manualmente, segure a tecla shift e clique e segure o botão do mouse enquanto arrasta ao longo da região de interesse. Alternativamente, use os botões de zoom e zoom na parte superior da página para navegar (1,5x, 3x, 10x ou opções de zoom base estão disponíveis). NOTA: Antes de usar os botões de zoom-in/zoom , é necessário reposicionar o gene para que a região de interesse esteja no meio da tela. Para realizar esta ação, clique na imagem e arraste-a para a esquerda ou para a direita para mover a região genômica horizontalmente conforme desejado ou use as setas de movimento na parte superior da página.</li>
	<li>Aproxime-se até que a sequência nucleotídeo (base) esteja visível. NOTA: A sequência de nucleotídeos aparecerá diretamente acima da pontuação de PhyloCSF suavizada.</li>
	<li>Escaneie visualmente a sequência de nucleotídeos perto do início e fim das regiões phyloCSF de pontuação positiva para identificar códons de início putativo (ATG) e parar (TGA/TAA/TAG). NOTA: Se o gene de interesse estiver no fio negativo do DNA, os códons de início e parada serão o complemento inverso (ou seja, CAT para o códon inicial e TCA/TTA/CTA para o códon de parada).</li>
</ol>5. Visualização de regiões homólogas em outros genomas
<ol><li>Passe o mouse sobre a posição Exibir na parte superior da página e clique na opção Em Outros Genomas (Converter). </li>
	<li>Defina o genoma de interesse usando o menu suspenso abaixo do título Novo Genoma .</li>
	<li>Selecione o conjunto genômico de interesse usando o menu suspenso no título Nova montagem e clique no botão Enviar .</li>
	<li>Uma vez que o navegador retorne uma lista de regiões do novo conjunto com semelhança, clique no link de posição cromossomómero para navegar até a região homólogoa de interesse. NOTA: O percentual de bases totais (nucleotídeos) e o vão coberto pela região serão definidos para cada região listada. Quanto maior o percentual de bases correspondentes, maior a conservação para a região de interesse.</li>
	<li>Siga as mesmas estratégias de navegação detalhadas na Seção 4 para analisar a sequência.</li>
</ol>6. Gerando alinhamentos de sequência de várias espécies para microproteínas de interesse
<ol><li>Clique no gene de interesse na faixa GENCODE no Navegador de Genoma UCSC (indicado na Figura 1A com uma caixa azul) para navegar até a página de descrição do gene.</li>
	<li>Em título Sequência e Links para Ferramentas e Bancos de Dados , clique no link na tabela que lê Outras Espécies FASTA.</li>
	<li>Clique nas caixas associadas à espécie de interesse para selecioná-las. Clique em Enviar. Copie e cole as sequências que aparecem na parte inferior da página no formato FASTA em um documento de processamento de texto.</li>
	<li>Abra uma segunda janela de navegador e navegue até a ferramenta Clustal Omega Multiple Sequence Alignment 52 no site53,54: <a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a>.</li>
	<li>Cole os arquivos de sequência que ainda estão na área de transferência na caixa no PASSO 1 que lê sequências em qualquer formato suportado. Role até a parte inferior da página e clique em Enviar. Veja abaixo os resultados alinhados (na fonte preta) para símbolos que indicam o grau de conservação de cada aminoácido (os símbolos são definidos na Tabela 1). NOTA: Pode levar vários minutos para gerar o alinhamento.</li>
	<li>Para ver as propriedades aminoácidos na cor, clique no link Mostrar cores diretamente acima das sequências para colorir os aminoácidos de acordo com suas propriedades (definidas na Tabela 2).</li>
	<li>Copie e cole o alinhamento de sequência em um programa de processamento de palavras ou slideshow para gerar uma figura ou arquivo de ilustração (por exemplo, Figura 2). NOTA: Use uma fonte monoespaçada para o alinhamento, como o Courier.</li>
	<li>Para ver outras saídas da página de resultados Domô Clustal , clique nas guias apropriadas (ou seja, Árvore Guia ou Árvore Filogenética).</li>
	<li>Clique na guia Resultados Para obter opções para visualizar as informações de sequência usando o Jalview, um programa gratuito especializado em edição, visualização e análise de alinhamento de sequência múltipla55, ou para acessar links diretos para MView e Simple Phylogeny56.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui apresentado fornece instruções detalhadas sobre como interrogar regiões genômicas de interesse para potencial de codificação de microproteínas usando PhyloCSF no Navegador de Genoma UCSCfácil de usar 48,49,50,51. Como detalhado acima, PhyloCSF é um poderoso algoritmo de genômica comparativa que integra modelos filogenéticos e frequências de substituição de codon para identifica...

A identificação do conjunto completo de elementos de codificação no genoma tem sido um objetivo importante desde o início do Projeto Genoma Humano, e continua sendo um objetivo central para a compreensão dos sistemas biológicos e da etiologia das doenças de base genética 1,2,3,4. Os avanços nas técnicas de NGS levaram à produção de sequências de genomas inteiras para um grande número de organismos, incluindo vertebrados, invertebrados, leveduras e plantas5. Além disso, métodos de sequenciamento transcricional de alto rendimento revelaram ainda a complexidade do transcriptome celular, e identificaram milhares de novas moléculas de RNA com funções de codificação de proteínas e não codificação 6,7. A decodificação dessa vasta quantidade de informações sequenciais é um processo contínuo, e os desafios permanecem com esforços abrangentes de anotação genética8.
O recente desenvolvimento de métodos de criação de perfil translacional, incluindo o perfil ribossomo 9,10 e o sequenciamento poli-ribossomo11, forneceram evidências indicando que centenas de eventos de tradução nãocanônica mapeiam para sORFs não anotados atualmente em todo o genoma, com potencial para gerar pequenas proteínas chamadas microproteínas ou micropeptídeos12,13, 14,15,16, 17. As microproteínas emergiram como uma nova classe de proteínas versáteis anteriormente negligenciadas por métodos de anotação genética padrão devido ao seu pequeno tamanho (<100 aminoácidos) e à falta de características genéticas clássicas de codificação de proteínas 8,12,18,19,20. Microproteínas foram descritas em praticamente todos os organismos, incluindo levedura21,22, moscas 17,23,24 e mamíferos 25,26,27,28, e têm mostrado desempenhar papéis críticos em diversos processos, incluindo desenvolvimento, metabolismo e sinalização de estresse 19,20,29, 30,31,32,33,34. Assim, é imperativo continuar a minerar o genoma para membros adicionais desta classe há muito negligenciada de pequenas proteínas funcionais.
Apesar do reconhecimento generalizado da importância biológica das microproteínas, essa classe de genes permanece muito sub-representada nas anotações do genoma, e sua identificação precisa continua sendo um desafio contínuo que tem dificultado o progresso no campo. Várias ferramentas computacionais e métodos experimentais foram recentemente desenvolvidos para superar as dificuldades associadas à identificação de sequências de codificação de microproteínas (discutidas extensivamente em várias revisões abrangentes 8,35,36,37). Muitos estudos recentes de identificação de microproteínas 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 têm confiado fortemente no uso de um algoritmo chamado PhyloCSF 48,49 , uma poderosa abordagem comparativa de genômica que pode ser aproveitada para distinguir regiões conservadas de codificação de proteínas do genoma daquelas que não são codificadas.
O PhyloCSF compara as frequências de substituição de codon (CSF) usando alinhamentos de nucleotídeos de várias espécies e modelos filogenéticos para detectar assinaturas evolutivas de genes codificadores de proteínas. Esta abordagem empírica baseada em modelos baseia-se na premissa de que as proteínas são conservadas principalmente no nível de aminoácidos em vez da sequência de nucleotídeos. Portanto, substituições sinônimos de codon, que codificam o mesmo aminoácido, ou substituições de codon a aminoácidos com propriedades conservadas (ou seja, carga, hidroofobidade, polaridade) são pontuadas positivamente, enquanto substituições não-sinônimos, incluindo substituições missense e sem sentido, pontuam negativamente. O PhyloCSF é treinado em dados de genoma inteiro e provou ser eficaz na pontuação de porções curtas de uma sequência de codificação (CDS) isoladamente da sequência completa, o que é necessário ao analisar microproteínas ou exons individuais de genes padrão de codificação de proteínas48,49.
Notavelmente, a recente integração dos hubs de trilha PhyloCSF no Navegador de Genoma 49,50,51 da Universidade da Califórnia Santa Cruz (UCSC) permite que pesquisadores de todas as origens acessem facilmente uma interface fácil de usar para consultar regiões genômicas de interesse para o potencial de codificação de proteínas. O protocolo descrito abaixo fornece instruções detalhadas sobre como carregar os hubs de rastrear PhyloCSF no Navegador de Genoma da UCSC e, posteriormente, interrogar regiões genômicas de interesse para sondar regiões de codificação de proteínas de alta confiança (ou a falta delas). Além disso, no caso em que um escore phyloCSF positivo é observado, as etapas são delineadas para analisar melhor o potencial de codificação de microproteínas e gerar eficientemente alinhamentos de várias espécies das sequências de aminoácidos identificadas para ilustrar a conservação da sequência de espécies cruzadas. Por fim, vários recursos e ferramentas adicionais disponíveis ao público são introduzidos na discussão para levantamento de características identificadas de microproteínas, incluindo estruturas de domínio previstas e insights sobre a função putativa de microproteínas.

<table><tbody><tr><td>Website</td><td>Website Address</td><td>Requirements</td><td></td></tr><tr><td>Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a></td><td>Web browser</td><td>Programa de alinhamento de múltiplas sequências para o alinhamento eficiente de sequências FASTA (ou seja, para comparação entre espécies de microproteínas identificadas)</td></tr><tr><td>COXPRESSdb</td><td><a href="https://coxpresdb.jp">https://coxpresdb.jp</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Fornece relações gênicas co-reguladas para estimar as funções gênicas</td></tr><tr><td>Perguntas frequentes sobre ferramentas de bioinformática EMBL-EBI</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ">https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ</a></td><td>Perguntas</td><td>frequentes (FAQs) do navegador da Web para ferramentas EMBL-EBI. Inclui a chave de codificação de cores para alinhamentos de sequências de proteínas</td></tr><tr><td>Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI), Ferramentas e Recursos de Dados</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/services/all">https://www.ebi.ac.uk/services/all</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Lista abrangente de sites, ferramentas e recursos de dados disponíveis gratuitamente</td></tr><tr><td>Expasy - Portal</td> <td>Suíço de Recursos de Bioinformática<a href="https://www.expasy.org">https://www.expasy.org</a></td><td>Navegador</td><td>da Web Conjunto de ferramentas e recursos de bioinformática para análise de sequência de proteínas que é mantido pelo Instituto Suíço de Bioinformática (SIB)</td></tr><tr><td>National Center for Biotechnology Information (NCBI) Pesquisa</td> <td>de Domínio Conservado<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Ferramenta de pesquisa para identificar domínios conservados dentro de sequências de nucleotídeos de proteínas ou codificantes</td></tr><tr><td>Pfam 35</td><td><a href="http://pfam.xfam.org">http://pfam.xfam.org</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Banco de dados da família de proteínas (Pfam), fornece alinhamentos e classificação de famílias e domínios de proteínas</td></tr><tr><td>Descrição do PhyloCSF Track Hub</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5QedaCd4ir8aZ65ryaD&amp; db=mm10& c=chr2& g=hub_109801_PhyloCSF_smooth"> https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth</a></td><td>Descrição</td><td>detalhada das trilhas do PhyloCSF suavizado e do PhyloCSF Track Hub &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>SignalP 6.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? Sinal P-6.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Prevê a presença de peptídeos de sinal e a localização de seus locais de clivagem</td></tr><tr><td>TMHMM - 2.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Previsão de hélices transmembranares em proteínas</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser BLAT Search</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a></td><td>Web browser</td><td>Ferramenta usada para encontrar regiões genômicas usando informações de DNA ou sequência de proteínas</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser Gateway</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Link direto para o UCSC Genome Browser Gateway</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser Home</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a></td><td>Web browser</td><td>Site inicial do UCSC Genome</td></tr><tr><td>Browser UCSC Genome Browser Track Data Hubs</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs</a></td><td>Navegador da Web</td><td>Link direto para o banco de dados Track Data Hubs/Public Hubs para pesquisar e carregar o</td>Guia do usuário do navegador de</tr><tr><td>genoma PhyloCSF Tracks</td> <td>UCSC<a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</ a></td><td>Navegador da Web</td><td>Guia do usuário abrangente detalhando como navegar no UCSC Genome Browser</td></tr><tr><td>WoLF PSORT</td><<td>a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp</a></td><td>Web browser</td><td>Ferramenta de previsão de localização subcelular de proteínas</td></tr></tbody></table>

uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

O sequenciamento de última geração (NGS) impulsionou o campo da genômica para a frente e produziu sequências de genomas inteiros para inúmeras espécies animais e organismos modelo. No entanto, apesar dessa riqueza de informações sequenciais, esforços abrangentes de anotação genética têm se mostrado desafiadores, especialmente para pequenas proteínas. Notavelmente, os métodos convencionais de anotação de proteínas foram projetados para excluir intencionalmente proteínas putativas codificadas por quadros de leitura aberto curtos (sORFs) com menos de 300 nucleotídeos de comprimento para filtrar o número exponencialmente maior de sORFs não codificadores espúrios em todo o genoma. Como resultado, centenas de pequenas proteínas funcionais chamadas microproteínas (<100 aminoácidos em comprimento) foram incorretamente classificadas como RNAs não codificantes ou negligenciadas inteiramente.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado para aproveitar ferramentas bioinformáticas gratuitas e disponíveis publicamente para consultar regiões genômicas para potencial de codificação de microproteínas com base na conservação evolutiva. Especificamente, fornecemos instruções passo a passo sobre como examinar o potencial de conservação e codificação de sequências usando as Frequências de Substituição de Codon Filogenéticas (PhyloCSF) no navegador de genoma da Universidade da Califórnia Santa Cruz (UCSC). Além disso, detalhamos etapas para gerar eficientemente alinhamentos de várias espécies de sequências de microproteínas identificadas para visualizar a conservação da sequência de aminoácidos e recomendar recursos para analisar características de microproteínas, incluindo estruturas de domínio previstas. Essas ferramentas poderosas podem ser usadas para ajudar a identificar sequências putativas de codificação de microproteínas em regiões genômicas não anônicas ou para excluir a presença de uma sequência de codificação conservada com potencial translacional em uma transcrição de interesse não codificada.

Aqui usaremos a mitoregulina de microproteína validada (Mtln) como exemplo para demonstrar como um sORF conservado irá gerar uma pontuação PhyloCSF positiva que pode ser facilmente visualizada e analisada no Navegador de Genoma da UCSC. Mitoregulina foi anteriormente anotada como um RNA não codificado (anteriormente iD gene humano LINC00116 e gene do rato ID 150001K16Rik). Os métodos comparativos de genômica e análise de conservação de sequências desempenharam um papel crítico em sua descoberta inicial ...

O protocolo descrito aqui fornece instruções detalhadas sobre como analisar regiões genômicas de interesse para potencial de codificação de microproteínas usando PhyloCSF no Navegador de Genoma UCSC fácil de usar. Além disso, várias ferramentas e recursos são recomendados para investigar mais as características sequenciais das microproteínas identificadas para obter informações sobre suas funções putativas.

Uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

O protocolo descrito aqui fornece instruções detalhadas sobre a análise de regiões genômicas de interesse para o potencial de codificação de proteínas usando filoCSF no navegador de genoma UCSC amigável. O PhloCSF pode identificar efetivamente quadros de leitura abertos conservados com potencial de codificação de micro proteínas em regiões genômicas que atualmente são anotadas como não codificadas. Os métodos descritos aqui são facilmente utilizados e podem ser implementados por pesquisadores de todas as origens sem treinamento prévio ou experiência em bioiformática ou genômica comparativa.Para começar, abra uma janela do navegador de internet e navegue até o navegador de genoma da Universidade da Califórnia Santa Cruz ou UCSC. Sob o título de nossas ferramentas, selecione a opção track hubs. Nos hubs públicos, o tipo phyloCSF na caixa de termos de pesquisa.Em seguida, clique no botão de "procurar centros públicos". Conecte-se ao phyloCSF clicando no botão de conexão para o nome do hub phyloCSF. Depois de clicar em conectar, aguarde redirecionar para a página do gateway do navegador do genoma do UCSC.Para consultar uma espécie diferente, selecione as espécies de interesse sob o título de espécies navegá-lo clicando no ícone apropriado ou digite a espécie na caixa de texto que diz, digite o nome comum da espécie ou o ID de montagem.Usando o menu suspenso, escolha o conjunto para pesquisar sob posição definida, em seguida, digite o símbolo do gene de posição ou termos de pesquisa na posição ou caixa de termo de pesquisa e clique em ir para navegar a um gene de interesse no navegador genoma. Se a pesquisa resultou em várias correspondências, aguarde ser redirecionada para uma página que exija a seleção de uma posição de interesse, clique no gene de interesse apropriado. Depois de navegar para o navegador de genoma do UCSC selecione a ferramenta de alinhamento semelhante à explosão ou blat sob as nossas ferramentas indo para consultar um DNA específico ou sequência de proteínas.Alternativamente, passe o cursor sobre a guia ferramentas e selecione a opção blat ou siga o link dado. Usando o menu suspenso selecione a espécie, o genoma e a montagem de interesse. Em seguida, defina o tipo de consulta, cole a sequência de interesse na caixa de texto do genoma de pesquisa blat e clique em enviar.Em seguida, clique no link do navegador sob as ações que vão para navegar até a região genômica de interesse. Escaneie visualmente a área genômica de interesse para pontuar positivamente as regiões de FiloCSF. Use o recurso zoom para ampliar regiões de interesse para examinar características de sequência e procurar os códons de partida e parada.Para ampliar manualmente a tecla shift e clicar e segurar o botão do mouse enquanto arrasta ao longo da região de interesse. Alternativamente, use o zoom e zoom de botões na parte superior da página para navegar. Aproxime-se até que o nucleotídeo ou a sequência de base esteja visível.Escaneie visualmente a sequência de marés nucleares perto do início e fim das regiões filoCSF de pontuação positiva para identificar o início punitivo e parar os códons. Passe o cursor do mouse sobre o título de exibição na parte superior da página e clique na opção de conversão de outros genomas e, em seguida, defina o genoma de interesse usando o menu suspenso abaixo do novo título de genoma. Selecione o conjunto genômico de interesse sob o novo título de montagem e clique no botão enviar.Uma vez que o navegador retorna uma lista de regiões no novo conjunto com semelhança. Clique no link de posição cromossômica para navegar até a região homólogoa de interesse. Siga as estratégias de navegação descritas anteriormente para analisar a sequência.Para navegar até a página de descrição do gene, clique no gene de interesse na faixa de código de geração no navegador de genoma UCSC. Sob a sequência e links para ferramentas e bancos de dados, clique no link na tabela que lê outras espécies mais rapidamente. Clique nas caixas associadas à espécie de interesse para selecioná-las.Em seguida, clique em enviar. Copie e cole as sequências que aparecem na parte inferior da página em formato mais rápido em um documento de processamento de texto. Em seguida, abra uma segunda janela de navegador e navegue até a ferramenta de alinhamento de sequência múltipla ômega clustal no site do European Bioinformatics Institute.Cole os arquivos de sequência na área de transferência na caixa na primeira etapa que lê sequências em qualquer formato suportado. Role até a parte inferior da página e clique em enviar. Observe abaixo os resultados alinhados para símbolos que indicam o grau de conservação de cada aminoácido.Para ver as propriedades do aminoácido e a cor clique no link de cores do show diretamente acima das sequências para colorir os aminoácidos de acordo com suas propriedades. Em seguida, copie e cole o alinhamento de sequência em um programa de processamento de palavras ou slide show para gerar uma figura ou arquivo de ilustração. Para ver outras saídas da página de resultados ômega clustal, clique na árvore guia das guias ou na árvore genética phylo.Por fim, clique na guia do visualizador de resultados para obter opções para visualizar as informações de sequência usando jalview ou para acessar links diretos para mview e filogenia simples. Uma análise phyloCSF representativa do gene mitoregulina indica uma região de conservação de alta sequência correspondente a uma micro proteína validada. A sequência completa de codificação de mitoregulina está contida dentro do exon um e pontua muito bem no phyloCSF menos uma faixa.Um códon de partida conservado pode ser observado no início da região de pontuação positiva no filoCSF menos uma faixa. A região de pontuação positiva no primeiro exon de mitoregulina começa diretamente sobre um códon de início e termina no codon stop. O alinhamento de sequência múltipla da micro proteína mitoregulina para oito espécies diferentes é mostrado aqui.A análise do longo ar quente de RNA não codificado mostrou uma pontuação negativa em todo o gene em todas as seis faixas indicando uma falta de conservação de sequências e apoiando que o ar quente é corretamente anotado como um RNA não codificador. A análise phyloCSF do mouse um, oito, um, zero, zero, cinco, oito, i 24 rike gene mostrou que um quadro de leitura aberto conservado abrange três exons e a pontuação phyloCSF positiva salta da faixa mais duas na exon um para a faixa de três mais em exon dois, e depois de volta para a faixa mais dois em exon três. A análise phyloCSF do lócus de um gene de atender também foi efetivamente usada para identificar múltiplos quadros de leitura abertos de codificação distintas dentro de uma única molécula de RNA.É importante notar que, embora um escore positivo de filoCSF seja altamente sugestivo da capacidade de codificação de micro proteínas, esta linha de evidências não pode ficar sozinha e deve ser validada experimentalmente. Uma vez identificado um período de micro proteína, a sequência de aminoácidos pode ser analisada para domínios conservados ou características de sequência para fornecer insights sobre sua função. O PhyloCSF tem sido efetivamente usado para identificar novas micro proteínas em regiões genômicas anteriormente consideradas não codificadas e continuará a ser uma ferramenta útil em futuros estudos de identificação de micro proteínas.

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JoVE Journal

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Biologia

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Nós fornecemos um protocolo passo a passo para dividir-BioID, um ensaio de fragmentos-complementação de proteínas com base na técnica de criação de etiquetas de proximidade BioID. Ativado na interação das duas proteínas determinadas, permite a análise proteômica de contexto-dependente da proteína em seu ambiente nativo do celular. O método é simples e econômica e só requer equipamentos de laboratório padrão.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

A metaproteômica clínica oferece insights sobre o microbioma humano e suas contribuições para a doença. Aproveitamos o poder computacional da plataforma Galaxy para desenvolver um fluxo de trabalho de bioinformática modular que facilita a análise metaproteômica complexa baseada em espectrometria de massa e a caracterização de diversos tipos de amostras clínicas relevantes para estudos de doenças.

Um fluxo de trabalho de metaproteômica clínica implementado na plataforma Galaxy Bioinformatics para analisar as interações hospedeiro-microbioma subjacentes à doença humana

Aprenda a identificar microproteínas usando PhyloCSF no UCSC Genome Browser. Este protocolo acessível permite analisar regiões genômicas sem necessidade de treinamento prévio em bioinformática.

Uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências

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