Um protocolo para Computer-Based Estrutura de Proteínas e de Previsão de Função

O objetivo deste procedimento é prever computacionalmente estruturas tridimensionais e função biológica de moléculas de proteínas a partir de suas sequências de aminoácidos. Isso é feito prevendo primeiro a estrutura secundária das proteínas por aprendizado de máquina. As sequências e a estrutura secundária prevista são então combinadas com as estruturas resolvidas na biblioteca PDB para identificar os melhores modelos de estrutura possíveis.

Esse procedimento é chamado de threading. Seguindo o procedimento de threading, o programa IT AER dividirá os modelos em fragmentos com base nos alinhamentos do modelo de sequência e, em seguida, remontará os fragmentos em modelos de comprimento total na terceira etapa. Modelos atômicos completos são construídos por refinamentos de nível atômico para otimizar as redes de ligações de hidrogênio e remover sobreposições.

A última etapa do procedimento é identificar a função biológica das proteínas, combinando as estruturas de previsão com proteínas de função conhecida na biblioteca de funções. A principal vantagem do ITER sobre o método de modelagem de estrutura existente é a abordagem de montagem de fragmentos de estrutura inerente, que pode conduzir consistentemente os alinhamentos de threading para mais perto do estado nativo. Esses modelos de estrutura de alta qualidade também formam a base de anotações funcionais baseadas em estrutura precisas para promover o uso do ITER na comunidade científica.

Nosso laboratório disponibilizou um site onde as sequências de proteínas podem ser submetidas ao iter. Este site atua como um nexo com o qual os usuários em todo o mundo podem registrar uma interface para cluster de computadores, que gerencia e executa simulações do ITER. Um trabalho de simulação ITER consiste em mais de uma dúzia de subsimulações menores.

Essas simulações, quando executadas em um único computador com um único núcleo de processador, podem levar mais de cem horas. O cluster de computadores do laboratório Zang pega e distribui essas sub-simulações em centenas de computadores e é capaz de executar mais de 2000 simulações. Simultaneamente com nosso cluster de computadores, somos capazes de completar centenas de simulações de degustação todos os dias.

Mesmo com essa capacidade, muito trabalho precisa ser feito para otimizar o sistema e minimizar o tempo de espera para nossos usuários de AER de TI online. Para começar com o experimento de modelagem de estrutura e função, faça logon na página da Web do AER de TI. Os endereços URL de todas as páginas relevantes discutidas aqui podem ser encontrados no protocolo escrito.

Copie e cole a sequência de aminoácidos no formulário fornecido ou carregue diretamente a sequência clicando no botão Procurar. Forneça um endereço de e-mail e um nome para o trabalho. Os usuários podem, opcionalmente, especificar restrições externas de contato ou distância de resíduos.

Adicione um modelo adicional ou exclua algumas proteínas modelo durante o processo de modelagem da estrutura. Para enviar a sequência, clique no botão executar taser. Verifique o status do trabalho enviado visitando a página da fila do taser de TI.

Clique na guia de pesquisa e use o número de ID do trabalho ou a sequência de consulta para pesquisar o trabalho enviado. Após a conclusão da modelagem de estrutura e função, um e-mail de notificação contendo uma imagem das estruturas previstas e um link da web será enviado para o endereço de e-mail fornecido. Clique neste link para ver e baixar os resultados.

Comece a análise da estrutura examinando a previsão da estrutura secundária, que é exibida como H para hélice alfa, S para fita beta ou C para bobina. Além disso, considere a pontuação de confiança da previsão para cada resíduo. Procure regiões com estruturas longas de previsões regulares de estrutura secundária para estimar a região central da proteína.

A classe estrutural da proteína também pode ser analisada com base na distribuição dos elementos da estrutura secundária. Visualize a acessibilidade prevista do solvente para determinar as regiões enterradas e expostas ao solvente. Na consulta, os valores de acessibilidade prevista ao solvente variam de uma pontuação de zero para um resíduo enterrado a uma pontuação de nove para um resíduo exposto.

Regiões contendo principalmente resíduos enterrados podem ser usadas para delinear a região central da proteína, enquanto regiões com resíduos expostos a solventes e hidrofílicos são potenciais locais de hidratação ou funcionais. Para visualizar as estruturas terciárias previstas da proteína de consulta, role para baixo até o JMO Appt interativo exibido à esquerda. Clique no miniaplicativo para alterar a aparência da estrutura exibida.

Amplie uma região específica, selecione tipos de resíduos específicos no modelo previsto ou calcule as distâncias dos resíduos. Analise as pontuações de confiança da modelagem estrutural para estimar a qualidade das estruturas previstas. Os valores de Csco estão normalmente na faixa de cinco a dois negativos, em que uma pontuação mais alta reflete um modelo de melhor qualidade.

A pontuação estimada de TM e RMSD do primeiro modelo é mostrada como precisão estimada do modelo um. Clique no link mais sobre csco. Para analisar o tamanho do cluster csco e a densidade do cluster de todos os modelos, analise os 10 principais modelos de threading da proteína de consulta, conforme identificado por programas de threading de baixo mets.

Ao rolar para baixo na página de resultados, exiba o Z-score normalizado para analisar a qualidade dos alinhamentos de threading. Alinhamentos com um csco normalizado maior que um, refletem um alinhamento confiante e são mais propensos a ter a mesma dobra que a proteína de consulta. Examine a identidade da sequência na região alinhada ao rosqueamento e em toda a cadeia para avaliar a homologia entre a consulta e as proteínas molde.

A alta identidade de sequência é um indicador de relação evolutiva entre a consulta e as proteínas molde. Visualize o resíduo alinhado ao encadeamento mostrado em cores para identificar visualmente os resíduos ou motivos conservados na consulta e as proteínas do modelo Uma identidade de sequência mais alta na região alinhada ao encadeamento em comparação com o alinhamento de toda a cadeia também indica a presença de motivos ou domínios estruturais conservados na consulta. Avalie a cobertura do alinhamento de rosqueamento inspecionando o alinhamento.

Se a cobertura do alinhamento superior for baixa e confinada a apenas uma pequena região da proteína de consulta ou ausente por um longo segmento da sequência de consulta, isso indica que a proteína de consulta contém mais de um domínio. Nesse caso, é recomendável dividir a sequência e modelar os domínios individualmente. Veja a próxima tabela da página de resultados para determinar os 10 principais análogos estruturais do primeiro modelo previsto, conforme identificado pelo programa de alinhamento estrutural, TM align.

Uma pontuação TM maior que 0,5 indica que o análogo e o modelo detectados têm uma topologia semelhante e podem ser usados para determinar a classe estrutural ou a família de proteínas da proteína de consulta. Aqueles com uma pontuação de TM inferior a 0,3 significam uma semelhança de estrutura aleatória. Analise a identidade da sequência e o RMSD na região estruturalmente alinhada para avaliar a conservação dos motivos espaciais no modelo e no análogo estrutural.

Inspecione visualmente os pares de resíduos coloridos e alinhados no alinhamento para identificar esses resíduos e motivos estruturalmente conservados. Observe a tabela de números EC previstos para ver os cinco principais OGs enzimáticos potenciais da proteína de consulta. O nível de confiança da previsão do número de EC usando esses modelos é mostrado como a pontuação EC com base na análise de benchmarking.

A similaridade funcional entre a consulta e a proteína molde pode ser interpretada de forma confiável usando uma pontuação EC maior que 1,1. Em seguida, procure o consenso de função entre os modelos, que têm uma dobra semelhante à proteína de consulta. Se vários modelos tiverem o mesmo número de EC e a pontuação de EC for maior que 1,1, o nível de confiança da previsão será muito alto.

No entanto, se a pontuação EC for alta, mas houver falta de consenso entre os acertos identificados, a previsão se torna menos confiável e recomenda-se que os usuários consultem a ontologia genética. As previsões de termos visualizam a tabela de termos de ontologia gênica prevista para identificar os 10 principais homólogos de proteína de consulta na biblioteca PDB anotada com termos de ontologia genética, cada proteína é geralmente associada a vários termos de ontologia gênica que descrevem suas funções moleculares, processos biológicos e localização celular. Clique em cada termo para visitar o site do amigo e analisar sua definição e linhagem.

Analise a coluna de pontuação de homologia funcional para acessar a semelhança funcional entre a consulta e as proteínas modelo. O nível de confiança da transferência de anotação funcional dessas proteínas também pode ser estimado. Veja a previsão de consenso da tabela de termos de ontologia genética para analisar a concordância de função entre os modelos.

Essas funções comuns são usadas para prever os termos de ontologia genética da proteína de consulta e para avaliar o nível de confiança das previsões de termos geográficos. Por fim, role para baixo até a parte inferior da página para ver as 10 principais previsões de locais de ligação de ligantes para a proteína de consulta Os locais de ligação previstos são classificados com base no número de confirmações de ligantes previstas que compartilham um bolso de ligação comum. O melhor local de ligação identificado já é exibido no aplicativo JM OL.

Clique nos botões de opção para analisar outras previsões e visualizar os resíduos de interação do ligante. A pontuação BS revela semelhança local entre o modelo e o local de ligação dos modelos. Uma pontuação BS maior que 1,1 indica alta sequência e semelhança estrutural perto do local de ligação previsto.

No modelo, em comparação com o local de ligação conhecido no modelo, a TI é uma página da Web principal que contém links para outros recursos úteis. O recurso de fórum permite que o usuário crie uma conta online e busque ajuda de outros usuários do ITER em relação à modelagem de estrutura ou para ajudar a interpretar os resultados. O recurso de download permite que os usuários baixem iter e pacotes relacionados e os instalem em seus computadores.

Isso ajuda a reduzir o tempo necessário para realizar os experimentos de modelagem. O recurso de fila permite que o status de todos os trabalhos enviados seja visto na página Q de TI. Os usuários também podem inspecionar visualmente a imagem de estruturas modeladas para trabalhos concluídos.

Nesta página, também mostrada na pontuação TM esperada do CSCO e no RMSD esperado do primeiro modelo e na data de envio mostrada aqui, há um trecho da página de resultados do AER de TI mostrando a sequência de consulta formatada mais rápida, a estrutura secundária prevista e as pontuações de confiança associadas e a acessibilidade ao solvente prevista dos resíduos. A região central analisada e o local de hidratação potencial na consulta são destacados em retângulos ciano e vermelho, respectivamente. Aqui são mostradas as previsões da estrutura terciária para as proteínas de consulta.

Os modelos previstos são exibidos em uma saída interativa do aplicativo JML, permitindo que o usuário altere a exibição da molécula. Os modelos também podem ser baixados clicando nos links de download, a pontuação de confiança para estimar a qualidade do modelo é relatada como o csco. Um exemplo da página de resultados itta A mostrando os 10 principais modelos e alinhamentos de threading identificados pelos programas de threading Loomis é apresentado.

A qualidade dos alinhamentos de rosqueamento é avaliada com base no escore Z normalizado, onde um valor maior que um reflete um alinhamento confiável. Os resíduos alinhados no modelo que são idênticos aos resíduos de consulta correspondentes são destacados em cores para indicar a presença de um resíduo ou motivo conservado. Por outro lado, a falta de alinhamento na maioria dos principais modelos indica a presença de vários domínios na proteína de consulta e os resíduos não alinhados correspondem às regiões do vinculante de domínio.

Esta tabela exibe os 10 principais análogos estruturais identificados e alinhamentos estruturais identificados pelo Programa de alinhamento estrutural alinhado com TM. A classificação dos análogos é baseada na pontuação TM do alinhamento estrutural. Uma pontuação de TM maior que 0,5 indica que as duas estruturas comparadas têm uma topologia semelhante.

Enquanto uma pontuação de TM inferior a 0,3 significa uma semelhança entre duas estruturas aleatórias. Os pares de resíduos estruturalmente alinhados são destacados em cores com base em sua propriedade de aminoácidos, enquanto as regiões não alinhadas são indicadas por um traço. Aqui está um exemplo da página de resultados do ITR mostrando homólogos enzimáticos identificados da proteína de consulta na biblioteca PDB.

O nível de confiança da predição do número de EC é analisado com base no escore de EC, onde um escore de EC maior que 1,1 indica similaridade funcional entre a consulta e a proteína modelo. A tabela de previsão de termos de ontologia genética para a proteína de consulta inclui homólogos funcionais para a proteína de consulta na biblioteca de modelos de ontologia de genes classificados com base em sua pontuação de homologia funcional. Características funcionais comuns desses acertos de pontuação máxima são derivadas para gerar as previsões finais do termo de ontologia do gene para a proteína de consulta.

A qualidade dos termos de ontologia genética prevista é estimada com base na pontuação geográfica, onde uma pontuação geográfica maior que 0,5 indica uma previsão confiável mostrada aqui como um exemplo da página de resultados do IT AZA mostrando as 10 principais previsões do local de ligação do ligante de proteína usando o algoritmo de cofator. A classificação dos locais de ligação previstos é baseada no número de confirmações de ligantes previstas que compartilham um bolso de ligação comum. Na consulta, a pontuação BS é uma medida da sequência local e da semelhança da estrutura entre o local de ligação previsto e os modelos e é útil para analisar a conservação dos bolsões do local de ligação.

Embora o ISER seja um dos algoritmos mais eficientes para a previsão de estrutura e função de proteínas, é importante lembrar que é apenas uma previsão de algoritmos de computador. Quaisquer dados experimentais ou insights de função, por exemplo, informações de ligação de contatos residuais serão extremamente úteis para aumentar a precisão das previsões. O servidor AER de TI possui um portal para incluir essas informações durante o procedimento de modelagem Para acomodar o crescente interesse nele.

Aer, o laboratório Zang lançou o software IT AER gratuitamente para pesquisa não comercial. Estamos desenvolvendo ativamente um AER de TI aprimorado e um degustador de olhos, e na esperança de que sua disponibilidade leve a uma aplicação em larga escala fora do laboratório Zang e beneficie e estimule mais pesquisas na comunidade científica.