Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web
16 de julho de 2017
É apresentado um protocolo para a investigação on-line sobre a relação proteína-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web.
O objetivo geral do Bio3D-web é permitir a análise interativa da diversidade de sequência, estrutura e conformação de famílias de proteínas. O Bio3D-web é um novo aplicativo web que pode nos ajudar a compreender as relações entre sequência, estrutura e dinâmica dentro de grandes famílias de proteínas. A principal vantagem do Bio3D-web é que ele fornece análise online interativa e reprodutível de sequência, estrutura e dinâmica, sem exigir conhecimento prévio de programação por parte do usuário.
Para inserir uma estrutura para análise, obtenha o ID PDB da adenilato quinase pesquisando no banco de dados de proteínas. Insira o ID PDB de quatro caracteres da adenilato quinase ou cole uma sequência proteica na caixa de texto do painel de entrada de estrutura ou sequência. Clique no botão azul de seleção de próxima ocorrência no primeiro painel, ou simplesmente role para baixo até o painel B, seleção de ocorrência, para continuar a análise.
Certifique-se de que o controle deslizante do número limite total de estruturas incluídas esteja definido em seu valor máximo para incluir todas as estruturas acima do limite estabelecido. Reduza o limite de pontuação de inclusão (BitScore) para incluir hits mais distantes ou aumente-o para excluir. Certifique-se de que os hits selecionados representem estruturas relevantes ao inspecionar os detalhes da tabela, como nome do PDB, espécie e ligantes ligados.
Clique na aba "align" para realizar o alinhamento de sequência das estruturas selecionadas na aba de pesquisa. Pode haver surgimento de erros de alinhamento, especialmente ao analisar proteínas mais distantes, como quando a similaridade de sequência está abaixo de 30%. Verifique sempre cuidadosamente e corrija o alinhamento de sequência na aba "align". Revise o resumo do alinhamento no painel A, resumo do alinhamento.
Certifique-se de que as regiões de interesse estão alinhadas e não mascaradas por lacunas em uma ou mais estruturas. Clique no botão azul próximo análise para realizar a análise de agrupamento baseada em sequência das estruturas coletadas. Em seguida, clique no botão azul próxima conservação para calcular a conservação de resíduos por coluna.
Selecione os conjuntos de estruturas alinhadas para gerar um gráfico da conservação de resíduos em cada posição do alinhamento. Realize a sobreposição de estruturas acessando a aba de ajuste. Certifique-se de que as estruturas proteicas estejam sobrepostas em regiões correspondentes e relevantes mediante inspeção visual.
Clique e arraste o mouse sobre a estrutura para rotacioná-la e use a rolagem para ampliar ou reduzir. Ajuste a coloração das estruturas clicando nas opções de cor. Em seguida, clique no botão azul "próxima análise" para realizar o agrupamento baseado em estrutura das estruturas PDB coletadas.
Ative o mapa de calor do RMSD no menu suspenso de opções do gráfico. Clique no botão azul RMSF para visualizar a variabilidade estrutural de cada resíduo, com os principais elementos de estrutura secundária exibidos nas regiões marginais do eixo X. Realize a análise de componentes principais acessando a guia PCA.
Para visualizar os componentes principais, marque a caixa de seleção mostrar trajetória do CP para visualizar os movimentos descritos pelos componentes principais com a ferramenta de visualização no navegador. Certifique-se de que o componente principal um está selecionado no primeiro menu suspenso. Para visualizar os movimentos descritos por outros componentes principais, escolha o CP desejado no menu suspenso escolher componente principal.
Projete as estruturas individuais em dois componentes principais selecionados clicando no botão azul próximo gráfico. Certifique-se de que o CP no eixo X esteja definido como um e o CP no eixo Y como dois. Para projetar as estruturas em outros componentes principais, ajuste a numeração dos CPs conforme necessário.
Clique em qualquer ponto individual do gráfico para rotular as estruturas. Alternativamente, destaque uma ou mais estruturas na tabela de anotação de conformadores PCA abaixo do gráfico. Calcule as contribuições dos resíduos para as componentes principais individuais clicando no botão azul próximo contribuições dos resíduos.
Plote as contribuições para componentes principais adicionais incluindo o número do CP no campo de texto escolha o componente principal. Clique na aba eNMA para iniciar o cálculo do modo normal. Ajuste o número de estruturas reduzindo ou aumentando o valor de corte para inclusão ou exclusão de estruturas.
Clique no botão verde executar ensemble NMA para iniciar o cálculo da análise de modos normais. Role para baixo até o segundo painel da guia eNMA, chamado visualização dos modos normais, para visualizar os modos normais. Clique no botão azul próximas flutuações para calcular as flutuações por resíduo das estruturas selecionadas para a análise de modos normais em ensemble.
Ative o agrupamento por RMSD para colorir os perfis de flutuação com base no agrupamento por RMSD. Ative a caixa de seleção linhas de dispersão para traçar os perfis de flutuação agrupados separadamente uns dos outros. Em seguida, clique no botão azul próximo PCA versus NMA para calcular a similaridade entre os modos normais individuais e os componentes principais.
Clique no botão azul "próximo" na parte inferior para gerar um relatório com os resultados da análise, as entradas definidas pelo usuário e as opções de parâmetros. O relatório pode ser baixado em formatos compartilháveis PDF, Word e HTML. O relatório também inclui um link para revisitar a sessão de análise em um momento posterior, que pode ser compartilhado com colaboradores.
Mostradas aqui estão estruturas PDB disponíveis da adenilato quinase superpostas ao núcleo invariável identificado. As estruturas são coloridas de acordo com o agrupamento baseado no RMSD fornecido na aba de ajuste. A visualização dos componentes principais está disponível na aba PCA para caracterizar as principais variações conformacionais no conjunto de dados.
Aqui, a trajetória correspondente ao primeiro componente principal é mostrada em representação de tubo, evidenciando o movimento de fechamento em larga escala da proteína. As estruturas são projetadas sobre seus dois primeiros componentes principais em um gráfico de conformeros, mostrando uma representação de baixa dimensionalidade da variabilidade conformacional. Cada ponto ou estrutura é colorido de acordo com critérios especificados pelo usuário, neste caso, os resultados de agrupamento baseados em PCA.
A análise de modo normal na aba eNMA sugere dinâmicas locais e globais aprimoradas para estruturas no estado aberto em comparação com o estado fechado. O Bio3D-web pode ser usado para explorar conjuntos de sequências e estruturas e ajudar a compreender tendências gerais na família de proteínas de interesse em minutos. O Bio3D-web me ajudou a orientar a análise estrutural da superfamília de quinesinas.
O Bio3D-web fornece um fluxo de trabalho completo para investigação totalmente personalizada das relações entre sequência, estrutura e dinâmica. Esse fluxo de trabalho oferece funcionalidades para o mapeamento de relações interconformacionais com ACP e comparação quantitativa da dinâmica local e global em grandes conjuntos de estruturas heterogêneas usando NMA de ensemble. Prevê-se que a maioria dos pesquisadores utilize o Bio3D-web para compreender tendências gerais em sua família de proteínas de interesse, o que pode então orientar análises especializadas adicionais.
O Bio3D-web é, portanto, projetado como uma ferramenta geradora de hipóteses, com relatórios sumários compartilháveis que incluem todos os parâmetros definidos pelo usuário. Os resultados do Bio3D-web também podem ser baixados e são totalmente compatíveis com o pacote Bio3D-R para análises mais aprofundadas. Muitas estruturas estão agora disponíveis para uma determinada família de proteínas, frequentemente determinadas em diferentes condições.
A comparação dessas grande quantidade de estruturas pode nos informar sobre mecanismos estruturais essenciais para sua função, como ligação de ligantes, catálise e regulação alostérica. O Bio3D-web é amplamente acessível e fácil de usar, sem necessidade de instalação de softwares dedicados ou aprendizado de uma nova linguagem de programação. O Bio3D-web é compatível com todos os principais navegadores.
O código-fonte completo e as instruções de configuração para instalação local estão disponíveis gratuitamente.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para utilizar o Bio3D-web, uma aplicação web projetada para a análise interativa de sequência, estrutura e dinâmica de proteínas. Ele permite que pesquisadores explorem relações dentro de grandes famílias de proteínas sem necessidade de conhecimentos de programação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Dinâmica proteica
- Bioinformática
- Biologia estrutural
Contexto
- Compreender as relações entre sequência, estrutura e dinâmica de proteínas é fundamental para a pesquisa biológica.
- O Bio3D-web facilita a análise de famílias de proteínas por meio de uma plataforma interativa.
- O aplicativo permite análises reprodutíveis sem necessidade de experiência prévia em programação.
- Ele oferece suporte a diversas análises, incluindo alinhamento de sequências, agrupamento e análise de componentes principais.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma ferramenta fácil de usar para analisar sequências e estruturas de proteínas.
- Aprimorar a compreensão da diversidade conformacional em famílias de proteínas.
- Permitir que pesquisadores visualizem e interpretem eficazmente dados complexos de proteínas.
Métodos Utilizados
- Inserção de estruturas proteicas usando IDs do PDB ou sequências.
- Realização de alinhamento de sequência e análise de agrupamento.
- Execução de análise de componentes principais (PCA) para visualização de movimento.
- Geração de relatórios em diversos formatos para compartilhamento e análises posteriores.
Resultados Principais
- O Bio3D-web permite análise detalhada da dinâmica e estrutura de proteínas.
- Recursos interativos aumentam o envolvimento e a compreensão do usuário.
- A análise de modos normais revela diferenças dinâmicas entre estados de proteínas.
- Ferramentas de visualização ajudam a caracterizar variações conformacionais principais.
Conclusões
- O Bio3D-web é um recurso valioso para pesquisadores que estudam famílias de proteínas.
- A plataforma simplifica análises complexas, tornando-as acessíveis a um público mais amplo.
- Aplicações futuras podem expandir-se para incluir análises de proteínas mais diversas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O Bio3D-web permite que pesquisadores de biofármacos explorem rapidamente as relações entre sequência, estrutura e dinâmica em famílias de proteínas, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao fornecer análises interativas e reprodutíveis sem barreiras de programação, o sistema acelera a geração de hipóteses e orienta o desenvolvimento de ensaios e os esforços de identificação de compostos líderes. A ferramenta aumenta a confiança preditiva ao revelar padrões de dinâmica funcional e conservação essenciais para priorizar alvos terapeuticamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Identifica características estruturais e dinâmicas conservadas entre homólogos para esclarecer sítios funcionais e mecanismos alostéricos.
- Valor Operacional: Permite a investigação rápida de famílias de proteínas utilizando apenas IDs do PDB ou sequências, reduzindo a dependência de expertise em bioinformática.
- Valor Científico: Mapeia relações entre conformações por meio da ACP para distinguir estados funcionais relevantes para ligação de ligantes ou catálise.
- Valor Operacional: Apoia a análise de modos normais de conjunto para comparar dinâmicas entre estados de proteínas, fornecendo subsídios para hipóteses mecanicistas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera mapas de resíduos conservados que podem orientar a seleção de epítopos ou o direcionamento de sítios ativos no planejamento de ensaios.
- Valor Operacional: Produz relatórios compartilháveis com parâmetros padronizados, facilitando o alinhamento entre equipes quanto aos insumos estruturais para campanhas de triagem.
- Valor Científico: Revela pontos críticos dinâmicos por meio da análise de flutuação de resíduos, ajudando a avaliar a druggabilidade do alvo e a flexibilidade do sítio de ligação.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade da superposição e do alinhamento estrutural, essencial para leituras de ensaios consistentes entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona variações de sequência a alterações estruturais e dinâmicas, apoiando a avaliação da relevância de biomarcadores em variantes associadas a doenças.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho contínuo, desde a análise em nível de família até acompanhamentos especializados, permitindo continuidade translacional.
- Valor Científico: Destaca as diferenças conformacionais entre estados funcionais, auxiliando na validação do mecanismo de ação.
- Valor Operacional: As saídas são compatíveis com o Bio3D-R, permitindo transição contínua para validação computacional mais profunda em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O Bio3D-web insere-se no continuum da descoberta inicial, apoiando a validação de alvos por meio de informações estruturais que orientam a identificação de compostos iniciais e a priorização pré-clínica, reduzindo a incerteza mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre conservação de sequência e dinâmica estrutural para esclarecer a função do alvo e reduzir riscos associados a pressupostos mecanicistas.
- Triagem: Prepara entradas estruturais padronizadas e perfis de conservação que aprimoram o design de ensaios e a preparação para triagem de compostos.
- Análises: Fornece saídas quantitativas, incluindo escores de conservação de resíduos, projeções de componentes principais e flutuações de modos normais, para comparação objetiva.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica estrutural aos estados funcionais, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a validação de mecanismos ao analisar variantes relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável e compartilhável para análise contínua de famílias de proteínas em diferentes projetos e equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao revelar regiões evolutivamente conservadas e dinamicamente relevantes.
- Valor Operacional: Elimina as barreiras de instalação de software e programação, permitindo ampla adoção entre equipes multidisciplinares.
- Valor Estratégico: Reduz o tempo para obtenção de insights na geração de hipóteses estruturais, melhorando a eficiência do capital em projetos de fase inicial.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização de alvos ajustada ao risco ao fornecer evidências estruturais e dinâmicas para decisões de prosseguir ou não prosseguir.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com conceitos de biologia estrutural, como RMSD, conservação e modos normais, para interpretar corretamente as saídas.
- Depende da disponibilidade e qualidade das estruturas do PDB para a família de proteínas-alvo, o que pode limitar a aplicabilidade em alvos pouco caracterizados.
- Necessita de consenso entre equipes sobre cortes estruturais, parâmetros de alinhamento e métodos de agrupamento para garantir comparações reprodutíveis.
- O desempenho pode variar com grandes conjuntos estruturais; os usuários devem ajustar os limiares de inclusão com base em limites computacionais e objetivos analíticos.
- É mais adequado para geração de hipóteses do que para validação estrutural definitiva, exigindo acompanhamento com métodos experimentais ou computacionais de alta resolução.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:40
Structure Search and Selection (SEARCH)
6:52
Results: Bio3D-web Analysis of Adenylate Kinase
1:46
Multiple Sequence Alignment Analysis (ALIGN)
2:51
Structure Fitting and Analysis (FIT)
3:52
Principle Component Analysis (PCA)
5:24
Ensemble Normal Mode Analysis (eNMA)
8:01
Conclusion
