El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho

El objetivo general del ensayo de reconstitución de organoides es el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales Lgr5 positivo en las células de Paneth a través de su modificación genética o bioquímica seguida de la reconstitución en organoides que se renuevan automáticamente. Este método permite abordar cuestiones específicas clave en el campo de las células madre intestinales, como la modificación genética o bioquímica en células madre y de nicho. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de otros ensayos que utilizan criptas completas, emplea células madre y de nicho clasificadas, lo que permite el análisis específico del tipo de célula.

La demostración en video de este método es fundamental, especialmente cuando se trata de los pasos de disociación de tejidos y manejo de células. Si no se ejecutan correctamente, estos pasos conducirán a una mala viabilidad de la celda, especialmente después de la clasificación de hechos. Comience este procedimiento con la preparación de los materiales y el sacrificio de un ratón Lgr5 sobre un fondo C57BL/6J como se describe en el protocolo de texto.

Disecciona el peritoneo longitudinalmente con unas tijeras. Sujeta el estómago con las pinzas y córtalo transversalmente por la mitad con unas tijeras intestinales a partir de este punto. Saque el intestino y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS.

Comience colocando la punta roma en el estómago y empújela suavemente a través del píloro. Proceda cortando con las tijeras y tirando con las pinzas. Una vez abierto longitudinalmente todo el intestino delgado, lávelo en PBS frío sosteniéndolo con las pinzas y enjuagándolo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.

Una vez que se hayan eliminado todos los restos de heces, proceda a aplanar el intestino en una tabla de cortar, con el lado lumenal hacia arriba. El lado lumenal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte externa. Con un portaobjetos de vidrio, retire suavemente las vellosidades raspando el intestino aplanado.

Realice el paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido. Luego, corte el intestino delgado con una cuchilla quirúrgica estéril en pedazos de dos a cinco milímetros. Coloque los fragmentos del intestino delgado en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS helado.

Limpie los fragmentos de tejido, eliminando las impurezas restantes, pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repita el paso hasta que el PBS esté completamente limpio. A continuación, agregue 15 mililitros de PBS frío para llevar el volumen final total de PBS a 25 mililitros.

Añadir dos milimolares de EDTA e incubar durante 45 minutos en un rodillo a cuatro grados centígrados. Después de desechar el PBS EDTA, agregue 10 mililitros de PBS y separe las criptas pipeteando bruscamente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo. Luego, recoge el sobrenadante.

Repita este paso cuatro veces. Agregue medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mililitros. Granular las células por centrifugación.

Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo antes de peletizar las criptas por centrifugación. Para la preparación de una sola célula, primero deseche el sobrenadante de las criptas peletizadas y vuelva a suspenderlas en un mililitro de enzimas similares a la tripsina junto con 50 microlitros de DNasa. Incubar las células en un baño de agua a 32 grados centígrados durante dos minutos.

Después de agregar 10 mililitros de medio de cultivo, disocie las criptas en células individuales pipeteando bruscamente hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces. Filtre la solución a través de un colador de 40 micras para eliminar los grumos y otras impurezas. Luego, granule las celdas individuales a 300 veces la gravedad durante cinco minutos.

Para la citometría de flujo, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de una solución salina tamponada de X Hank con un 2% de suero fetal de vaca por cada millón de células. A la suspensión celular, agregue anticuerpos marcados con Brilliant Violet 421 para el marcador de linaje CD31, CD45 y Ter119 a una concentración de uno a 100. Además, agregue anti-CD24 APC y anti-CD117 PE a una concentración de uno a 250.

Después de 30 minutos, clasifique las células madre Lgr5 positivas y las células de Paneth en tubos separados de baja unión. Centrifugar las celdas clasificadas a 300 veces la gravedad durante cinco minutos. Luego, resuspenda las células en 100 microlitros de medio con los componentes descritos en el protocolo de texto.

Para tratar las células, utilice cinco microlitros de reactivo de transfección mediado por liposomas en un volumen total de 100 microlitros de medio de cultivo y ARN interferente pequeño a una concentración de 100 nanomolares. Incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados para el ARN interferente pequeño, o durante el tiempo necesario para la modificación elegida. Lavar las células dos veces en 500 microlitros de medio de cultivo.

Después de centrifugar las células a 300 veces la gravedad durante cinco minutos, vuelva a suspenderlas en 10 microlitros de medio de cultivo. A continuación, agrupe los dos componentes celulares en un volumen total de 20 microlitros antes de centrifugar a 300 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coincubar las células positivas de Paneth y Lgr5 durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Retire 10 microlitros del sobrenadante y déjelos en un poco de líquido para evitar aspirar la pelletización de la célula. Luego, agregue 30 microlitros de membrana basal reconstituida a las células para un volumen total de 40 microlitros. Vuelva a suspender las células y colóquelas en una placa precalentada de 96 pocillos.

Después de 10 minutos, agregue 200 microlitros de medio completo. Cambie el medio cada 48 horas. Finalmente, cuente la multiplicidad de organoides en el día cinco.

La pequeña eliminación mediada por ARN interferente del gen APC murino en células madre Lgr5 positivas y la activación resultante de la vía de señalización canónica Wnt/beta-catenina afecta positivamente a la multiplicidad de organoides en comparación con sus homólogos no tratados o el control de secuencia codificada. La constitución de la activación de Wnt también rescata el requerimiento de células de Paneth como se informó anteriormente. Además, estos organoides aparecen como esferas huecas, un fenotipo bien descrito para los organoides mutantes de APC o estimulados por Wnt cuando se comparan con la morfología de los obtenidos de los dobletes de células Paneth-Lgr5.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar esta técnica, es importante seguir todos los pasos y tiempos de incubación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer la cripta intestinal, preparar una digestión de una sola célula y reconstituir células madre y de nicho para generar organoides.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las células madre intestinales diseccionaran los efectos específicos de las células madre o de nicho en el intestino delgado o el intestino grueso del ratón. Aunque este método se ha establecido para el análisis funcional del nicho de células madre intestinales, también se puede aplicar a otros nichos de células madre somáticas como la glándula mamaria o el folículo piloso. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales para analizar la expresión de proteínas del genoma en los organoides, como QPCR o Western blot.