Name: Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a transducir organoides intestinales con partículas lentivirales de alto título para análisis genético. Este método permite modificar epitelio intestinal primario de manera estable y reproducible.

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J. Heijmans cuenta con el apoyo de un estipendio de la Fundación Holandesa contra el Cáncer (KFW). G.R. van den Brink cuenta con el apoyo financiero del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013)/Acuerdo de subvención del Consejo Europeo de Investigación número 241344 y por una beca VIDI de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (GvdB).

1. Preparación de polietilenimina (PEI) como reactivo de transfección <ol><li> Disolver aproximadamente 150 mg de PEI en 100 ml de H 2 O. </li><li> Ajuste solución a pH 7,4 mediante la adición de HCl hasta que la solución se vuelva clara y revuelva hasta que se disuelva por completo. Esto puede tomar entre 10 y 60 min y añadir agua a una concentración final de 1 mg / ml. </li><li> Cuando clara, filtrar la solución PEI a través del filtro de 0,22 micras estéril y guárdelo en un congelador a -80ºC en alícuotas de 5 ml. </li></ol> 2. Producción de partículas de Lentiviral Día 1: <ol><li> Células HEK293T de Split a 60% -80% de confluencia en 162 cm 2 matraz grande o placa de Petri en medio de cultivo línea celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina y suplemento de glutamina 2 mM). </li></ol> Día 2: <ol start="2"><li> Preparar la solución de transfección de ADN que contiene 45 g de ADN plasmídico total sumandovectores lentivirales de embalaje (7 g de pVSVg; 5 g de pRSV rev; 13 g de pMDL) y 20 g de plásmido lentiviral que codifican el gen de interés o shRNA de interés. Ajustar a un volumen de 1 ml usando DMEM. </li><li> Preparar la solución de transfección PEI mediante la adición de 90 l de 1 mg / ml de PEI a 930 l de DMEM y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir solución de transfección de ADN a la solución de PEI. Vortex o invertir un número de veces e incubar durante 5 min a temperatura ambiente para obtener solución de transfección de ADN. </li><li> Gotear 2 ml de la solución de transfección de ADN en las células HEK293T y se incuba durante 4 h en una incubadora de cultivo celular humidificado en 37 ° C. </li><li> Después de 4 horas, refrescar el medio de cultivo para eliminar PEI. No es necesario lavar las células antes de añadir nuevo medio. NOTA: PEI es citotóxicos e incubación veces más que 4 horas pueden causar daño a las células HEK293T. </li></ol> Día 4: <ol start="7"><li> Reemplace supernatant con el nuevo medio de cultivo. Mantenga sobrenadante (que contiene virus); esto será usado en la etapa 2.10. </li><li> Ponga sobrenadante en un matraz de 15 ml. Para eliminar las células muertas, centrifugar durante 5 min a 500 x g. </li><li> Empuje sobrenadante a través de 0,45 micras filtro utilizando una jeringa grande 60 ml. Guarde la noche a 4 ° C. </li></ol> Día 5: <ol start="10"><li> Recoger el segundo lote de sobrenadante; centrífuga y filtro como en los pasos 2.8 a 2.9. </li><li> Reúnase el sobrenadantes de pasos 2.9 y 2.10 en tubos de ultracentrífuga y centrifugar a 50.000 xg en una ultracentrífuga durante 90 min. </li><li> Sacar cápsulas que contienen los tubos de ultracentrífuga muy cuidadosamente y poner en una campana de flujo laminar, recordando la orientación del tubo dentro de la centrífuga. </li><li> Abrir cápsula sosteniendo el tubo de ultracentrífuga y medio decantar cuidadosamente de tal manera que la pastilla está en el lado superior del tubo. Desde bolitas virales pueden ser difíciles de visualizar, recordar en quélado del tubo de un pellet se habrá formado. Tome una micropipeta y quitar el último bit de medio, mientras que teniendo cuidado de no agitar el sedimento marrón opaco que es visible en el lado de la parte inferior del tubo de ultracentrífuga. </li><li> Resuspender este precipitado en 500 l de medio de cultivo suplementado con organoide nicotinamida 10 mM, 10 mM Chir99021, 10 mM Y27632 y 8 mg / ml de polibreno. Resuspensión en este medio es importante, ya que el virus de título elevado se usa para transduct directamente organoides. </li><li> Opcionalmente: congelar el virus en este medio en alícuotas en dos lotes de 250 l en -80 ° C. </li></ol> 3. de Lentiviral Transducción de organoides Día 0: <ol><li> Dividir un total de 0,95 cm 2 y de organoides dos días antes de transducción en un nuevo pozo, con el objetivo de obtener unos 50 pequeños organoides. Dividir organoides acuerdo con el protocolo previamente publicado 1 (Figura 3A, B). </li><li> Suplemento organoid medio de cultivo con 10 mM Chir99021 y nicotinamida 10 mM para obtener criptas proliferativas hiper quística (Figura 3C). NOTA: criptas quísticas desarrollarán mejor cuando organoides recién divididas se cultivan en presencia de Chir99021. </li></ol> Día 2: <ol start="3"><li> Organoides Cosecha de la pipeta hacia arriba y abajo de la matrigel y medio, alterando de esta manera la mezcla con una micropipeta p1000. Colocar la mezcla en un tubo de 15 ml. </li><li> Interrumpir adicionalmente usando una pipeta Pasteur en el que la abertura distal se ha reducido por fusión. Organoides centrífuga para sedimentar durante 5 min a 100 x g. NOTA: Dependiendo del tamaño de la centrífuga, utilice una velocidad centrífuga diferente. Es necesario encontrar la velocidad exacta en la que interrumpen organoides se separan de la mezcla. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tripsina 1x precalentado (similar al 0,25% de tripsina). Resuspender organoides en tripsina y se incuba3 min en un baño a 37 ° C. </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de 3,5 ml de medio de cultivo línea celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina y glutamina). Centrifugar durante 5 min a 500 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante dejar pellet en aproximadamente 20 l de medio. La transferencia de los organoides en esta última pequeña cantidad de medio a un pozo en una placa de 48 pozos. </li><li> Añadir alta lentivirus título en medio de transducción tal como se describe en el paso 2.14, volver a suspender y continuar con el paso 3.10. Al encontrarse con baja eficacia de transducción, paso 3.9 se puede añadir. NOTA: Para la transducción eficiente, por lo general añadir una alícuota de 250 l de alta lentivirus título a un pocillo de organoides. Esto representa el 50% de todo el lentivirus cosechado de una sola producción, como se describe en el paso 2 de este protocolo. </li><li> Opcionalmente: para mejorar la eficacia de transducción, realice espinoculación poniendo los 48 y la placa que contiene organoides en un pre-calentado centrífuga de 326; C y giran a 600 xg durante 1 hr. </li><li> Ponga la mezcla organoide-virus en cultivo incubadora y se incuba durante 1 hora a 37 ° C en una incubadora de cultivo para permitir la transducción. </li><li> Opcionalmente: para mejorar aún más la eficacia de transducción, incubar organoides de 3 horas adicionales a 37 ° C en una incubadora de cultivo. </li><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo organoide y resuspender la mezcla organoide-virus, transferir a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga en una microcentrífuga durante 5 min a 850 xg para sedimentar organoides. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 l de Matrigel enfriado con hielo. Dado que el material se solidifica cuando se vuelve más caliente, utilizar puntas de pipeta que se enfrían por pipeteando arriba y abajo PBS enfriado con hielo para un número de veces. </li><li> Ponga la gotita en el medio de un pozo en una placa de 48 pocillos e incubar en la cultura incubadora a 37 ° C durante 15 min para solidificar. </li><li> Después de 15 min, añadir cuidadosamente 250 l de medio de cultivo suplementado con organoideNicotinamida 10 mM, 10 mM y 10 mM Chir99021 Y27632. Fragmentos de organoides alteradas pequeñas formarán en pequeños organoides quísticas dentro de las 24 horas. </li></ol> Día 5: <ol start="16"><li> Actualizar medio y complementar con un antibiótico de selección (por puromicina, utilice 4 g / ml). </li></ol> Día 7: <ol start="17"><li> Reemplace medio de medio de cultivo organoid norma, complementado con la selección de antibióticos. NOTA: en ciernes será completa 2-3 semanas después de la retirada Chir99021. Después de la selección, organoides pueden ser cultivadas sin selección de antibióticos. </li></ol> 4. organoide Preparación de ARN para RT-PCR cuantitativa o Microarray <ol><li> Para la preparación de ARN, utilizar un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Retire el medio de organoides y añadir 350 l de tampón RLT, complementados con β-mercaptoetanol recta en la cúpula de matrigel contiene organoides. Resuspender las material en RLT pipeteando usando micropipeta p1000. </li><li> Realizar más de preparación de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Opcionalmente: aumentar el rendimiento de ARN mediante amplificación usando el sistema Ovation Pico WTA, requiriendo de entrada inicial de 50 g de ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Opcionalmente: para el control de calidad antes de RNA microarrays, las muestras se ejecutan en un Bioanalyzer 2100 utilizando un chip de ARN total de nano eucariota, con el objetivo de un número de integridad del ARN (RIN) de 8,5 o más (Figura 5) de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol> 5. organoides de transformación de parafina y inmunohistoquímica <ol><li> Antes de iniciar el organoid incrustar pre-calentar un bloque de aluminio con agujeros de montaje de vidrio tubos de diámetro 12 mm de incubadora a 70 ° C para mantener el líquido de parafina. </li><li> Tome un solo pozo con organoides completamente desarrollados y eliminar el medio, dejando los organoides incrustados intacta. </li><li> Añadir 1 mlde paraformaldehído al 4% en PBS directamente al pozo y fijar a 4 ° C en cualquier lugar de 1 hora a la noche. </li><li> Reemplazar paraformaldehído con 1 ml de PBS enfriado con hielo. Opcionalmente: mantener organoides fijos en PBS hasta 1 semana a 4 ° C después de este paso. </li><li> Resuspender organoides fijos en 1 ml de PBS y colocar en vial de vidrio. </li><li> Deje organoides se hunden hacia abajo durante 1 min, se decanta PBS y se reemplazan con etanol al 70% en el que un par de gotas de solución de eosina se disuelven para permitir la visualización de organoides todo el proceso de incrustación. </li><li> Deja organoides en etanol al 70% a temperatura ambiente. Después de 30 min, eliminar el etanol 70% en cuidadosamente decantación, ser capaz de visualizar los organoides por el ojo a causa de leve del color rosáceo eosina. Reemplace solución incrustar con etanol al 96%. </li><li> Repita el paso 5.7, cada vez que la sustitución de la solución de la incrustación con la siguiente. Pase organoides a través de las siguientes soluciones a continuación: etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 96%, 100% ethanol, etanol 100%, xileno, xileno. </li><li> Decantar el último lavado xileno y verter la parafina en el tubo. Poner el tubo inmediatamente en el bloque de aluminio pre calentado a 70 ° C durante 30 min y reemplazar parafina con parafina nuevo limpio. </li><li> Vierta de parafina apagado y pipeta organoides en el molde de bloque de parafina utilizando una pipeta precalentado Pasteur con gran abertura. Mantenga pipeta Pasteur de tibia con un mechero Bunsen. Coloque todos los organoides en el molde bloque de parafina en una pequeña capa de parafina líquida. </li><li> En lo posible, trate de manipular todos los organoides hacia el centro del molde bloque de parafina utilizando una aguja de disección calentado. Mantenga disección aguja caliente usando un mechero Bunsen. </li><li> Cuando localización de organoides en el molde es satisfactorio, coquilla ligeramente para solidificar la capa de parafina. </li><li> Termina el bloque mediante el vertido de más de parafina en la parte superior y añadir una cinta de incrustación histológico estándar. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo de vídeo actual describe la transducción lentiviral de organoides de epitelio intestinal primaria y análisis de aguas abajo de estos organoides utilizando técnicas de ARN cuantitativos e inmunohistoquímica. Transducción lentiviral se realiza a menudo en las células adherentes o flotantes en placas de cultivo. Dado que la estructura tridimensional de organoides los hace difíciles de penetrar por las partículas virales, se utiliza un número de métodos para aumentar la eficacia. Pr...

El epitelio intestinal es uno de los tejidos corporales que proliferan más rápidamente, lo que ha causado a atraer amplio interés de la investigación sobre células cancerosas y madre. En 2009 se publicó una técnica para generar culturas de larga duración de las pequeñas criptas intestinales en matrigel, conservando una estructura dimensional 3 1. Estas estructuras, denominadas organoides intestinales, pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándar, y la zona medio suplementado con un número de factores de crecimiento definidos, incluyendo la BMP-noggin inhibidor de la vía de señalización (Nog), el potenciador de la vía Wnt de señalización rspondin 1 (Rspo1) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) encuentran todos para mejorar la proliferación intestinal 2-4. Organoides superan las líneas tradicionales de células de cáncer en los aspectos que son no mutado, han mantenido jerarquía de células madre, muestran la polarización celular intacta y la diferenciación de exposiciones en todos los linajes de células que se encuentran en la naciente pequeña intepitelio estinal. Puesto que pueden ser transducidas para llevar a transgenes o la interferencia de ARN construye 5, que se utilizan para estudiar elementos genéticos específicos, que prevalezca experimentos usando ratones transgénicos en facetas de costo y la velocidad. La expresión transgénica en organoides se puede realizar utilizando cualquiera retroviral murino o vectores lentivirales 6,7. Debido a las limitaciones de los retrovirus murinos, capaces de transducir células mitóticas exclusivamente 8, la transducción lentiviral se utiliza con más frecuencia para las células que son difíciles de infectar, tales como organoides. Virally transducidas y que expresan establemente organoides transgénicos pueden ser utilizados para una multitud de análisis aguas abajo, incluyendo ARN análisis cuantitativos e inmunohistoquímica. En conjunto, la cultura de organoides de células epiteliales intestinales primarias se ha convertido en una técnica rutinaria que es fácil de implementar, sin requisitos específicos de laboratorio, y se ha convertido en la novela de serie en cecultura ll en la investigación sobre el epitelio intestinal. Técnicas de transducción viral y análisis de aguas abajo posterior en organoides son tediosos para realizar y ayudar experimentos organoides generamos este protocolo de vídeo, que muestra los métodos para la transducción lentiviral de organoides cultivadas. Tenemos, además, muestra cómo el procesamiento correcto de organoides puede aumentar el rendimiento y, por tanto, mejorar el rendimiento de análisis de aguas abajo usando técnicas de ARN o inmunohistoquímica. En el protocolo, se utilizaron exclusivamente organoides que se derivan de pequeñas criptas intestinales, aunque las técnicas descritas pueden aplicarse a organoides colon también.

<table><tbody><tr><td>Polietileno Imina</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para ternera</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Avanzado DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>ratón Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polibreno</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA system</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído Sigma</td><td></td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>vial de vidrio cónico 12&nbsp; mm x 75&nbsp; milímetros 5&nbsp; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Amarillento</td><td>VWR</td><td>1.159.350.025</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para la de lentiviral transducción y análisis de aguas abajo de intestinal organoides

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Las estructuras de las criptas-vellosidades intestinales, denominadas organoides, pueden mantenerse en cultivo sostenido tridimensionalmente cuando se complementan con los factores de crecimiento adecuados. Dado que los organoides son muy similares al tejido original en términos de diferenciación homeostática de células madre, polaridad celular y presencia de todos los tipos de células terminalmente diferenciadas conocidas en el epitelio intestinal adulto, sirven como un recurso esencial en la investigación experimental sobre el epitelio. La posibilidad de expresar transgenes o ARN interferente utilizando vectores lentivirales o retrovirales en organoides ha aumentado las oportunidades para el análisis funcional del epitelio intestinal y las células madre intestinales, superando a los transgénicos tradicionales de ratón en velocidad y costo. En el protocolo de video actual mostramos cómo utilizar la transducción de organoides del intestino delgado con vectores lentivirales ilustrados por el uso de transgenes inducibles por doxicilina, o ARN de horquilla corta inducible por IPTG para la sobreexpresión o la eliminación de genes. Además, teniendo en cuenta que el cultivo de organoides produce recuentos celulares diminutos que incluso pueden reducirse mediante un tratamiento experimental, explicamos cómo procesar organoides para análisis posteriores dirigidos a RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica. Las técnicas que permiten la expresión de transgenes y la eliminación de genes en organoides intestinales contribuyen al potencial de investigación que tienen estas estructuras epiteliales intestinales, estableciendo el cultivo de organoides como un nuevo estándar en el cultivo celular.

Transducción lentiviral organoid La técnica de la transducción organoid utilizando lentiviral partículas depende de la correcta manipulación de los organoides antes y durante la transducción. Organoides (Figura 3A) se cultivaron y se fueron interrumpidas en criptas individuales (Figura 3B). Como se informó anteriormente, estas criptas individuales, cuando se cultivan en presencia del inhibidor de GSK3 Chir99021 se convirtieron en criptas quísticas <...

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

El objetivo general de este procedimiento es generar organoides estables transducidos a partir de epitelio intestinal primario de ratón para su análisis posterior en organoides intestinales. Esto se logra primero transfectando células HEK 293T con vectores de empaquetamiento lentivirales y un plásmido lentiviral que codifica el gen de interés, con el fin de producir partículas lentivirales de alto título. El segundo paso consiste en tratar previamente los organoides intestinales de ratón cultivados con una serie de factores de crecimiento para obtener criptas quísticas hiperproliferativas.A continuación, transduzca los organoides con lentivirus de alto título y incube los organoides transducidos en matrigel. El paso final consiste en incluir los organoides transducidos completamente desarrollados en parafina para el análisis inmunohistoquímico posterior. En definitiva, la transducción de organoides con lentivirus se utiliza para generar alteraciones genéticas en un modelo in vitro del epitelio intestinal que es confiable, reproducible y rápido.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las líneas celulares de cáncer, es que los organoides representan una jerarquía de células madre no mutadas y desplazadas. En cuanto a la polarización celular, pueden diferenciarse en todos los tipos celulares distintos del epitelio intestinal delgado. Además, los organoides transducidos pueden utilizarse para estudiar elementos genéticos específicos, superando así el uso de ratones transgénicos en aspectos de costo y velocidad.La producción de partículas lentivirales es un protocolo de cinco días que comienza con la división de células HEC 2 93 T hasta alcanzar una confluencia del 60 al 80 % en un matraz de 162 centímetros cuadrados con medio de cultivo celular. Incubar las células durante la noche en un incubador de cultivo celular humedecido a 37 grados Celsius al día siguiente. Preparar la solución de transfección de ADN y la solución de transfección de polietilenoamina o PEI según se describe en el texto del protocolo.Agregue la solución de transfección de ADN a la solución de PEI y vortexee o invierta varias veces e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Dripee dos mililitros de la solución de transfección de ADN más PEI sobre las células HEC 293T e incube durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Después de cuatro horas.Renueve el medio de cultivo. Para eliminar el PEI, incube las células durante dos días a 37 grados Celsius el día cuatro, recoja el sobrenadante en un tubo de 50 mililitros. Añada medio de cultivo nuevo a las células y devuelva el frasco al incubador. Centrifugue el sobrenadante recolectado a 500 G durante cinco minutos.Para eliminar las células muertas, utilice una jeringa grande de 60 mililitros para pasar el SUPERNATANTE a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Almacene el sobrenadante filtrado durante la noche a cuatro grados Celsius y, al día siguiente, recupere, centrifugue y filtre el segundo lote de sobrenadante como se indicó para el primer lote.Reúna los dos lotes de sobrenadante en tubos para ultracentrífuga. Centrifugue a 50,000 GS durante 90 minutos. Cuando finalice la centrifugación, retire con mucho cuidado las cápsulas que contienen los tubos de ultracentrífuga y colóquelas en una cabina de flujo laminar.Abra la cápsula que contiene el tubo de ultracentrífuga y vierta cuidadosamente el medio, dejando el precipitado en el lado superior del tubo. Es importante recordar en qué lado del tubo se habría formado el precipitado, ya que puede ser difícil visualizarlo. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar la última cantidad de medio, teniendo cuidado de no agitar el precipitado marrón opaco que es visible en el lateral de la parte inferior del tubo de ultracentrífuga.Re-suspender este precipitado en 500 microlitros de medio de cultivo de organoides suplementado con inhibidores de nicotinamida quinasa y poli cerebro resus. La suspensión en este medio es importante ya que se utilizará directamente un virus de alto título para la transducción de organoides dos días antes de la transducción. Dividir un pocillo completo de 0,95 centímetros cuadrados de organoides en un nuevo pocillo de una placa de 48 pocillos.Tras seguir un protocolo publicado previamente. El objetivo es obtener aproximadamente 50 organoides pequeños en cultivo de organoides. Medio suplementado con un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa y nicotinamida.Para obtener criptas quísticas hiperproliferativas. Incube los organoides durante dos días y, el día de la cosecha trasducción, recolecte los organoides con una micropipeta P1000. Pipetee el gel Matrigel y el medio hacia arriba y hacia abajo, interrumpiendo así la mezcla.Coloque la mezcla en un tubo de 15 mililitros. Disgregue aún más la mezcla utilizando una pipeta de PEs cuya abertura distal se haya reducido mediante fusión. Pelié los organoides centrifugando a 100 G durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y añada 500 microlitros de tripsina precalentada 1x; resuspenda los organoides e incúbelos durante tres minutos.En un baño de agua a 37 grados Celsius, inactivar la tripsina añadiendo 3,5 mililitros de medio de cultivo de la línea celular y centrifugar durante cinco minutos a 500 G. Eliminar el sobrenadante, dejando el precipitado en aproximadamente 20 microlitros de medio. Transferir los organoides en esta pequeña cantidad residual de medio a un pocillo.En una placa de 48 pocillos, agregue el lentivirus de alto título previamente preparado en medio de transducción a los organoides y resuspenda. Incube la mezcla de organoides y virus durante una hora a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo para permitir la transducción. Después de una hora, agregue un mililitro de medio de cultivo de organoides a la mezcla de organoides y virus, resuspenda y transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 850 ×g durante cinco minutos.Para obtener el precipitado de los organoides, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado. En 20 microlitros de gel de matrigel frío con hielo, coloque la gota en el centro de un pocillo. En una placa de 48 pocillos, incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos.Para que la gota solidifique después de 15 minutos. Añada cuidadosamente 250 microlitros de cultivo de organoides. Medio suplementado con nicotinamida e inhibidores de quinasas.Precaliente un bloque de aluminio en una incubadora a 70 grados Celsius para mantener el parafina líquido. Retire el medio de un solo pocillo con organoides completamente desarrollados, dejando los organoides embebidos intactos, y agregue un mililitro de paraformaldehído al 4 % en PBS directamente al pocillo. Reemplace el paraformaldehído con un mililitro de PBS.Re-suspenda los organoides fijados en el PBS y transfiera a un vial de vidrio. Deje que los organoides sedimenten al fondo durante un minuto. A continuación, aspire el PBS y reemplace con etanol al 70 %, en el que se han disuelto unas cuantas gotas de solución de eosina.Para permitir la visualización de los organoides durante todo el proceso de inclusión, deje los organoides en etanol al 70% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Elimine el etanol al 70% pipeteando cuidadosamente. Los organoides pueden visualizarse a simple vista debido al color rosado de la eosina.Sustituya la solución de inclusión por etanol al 96% y deje a temperatura ambiente durante 30 minutos de esta manera. Posteriormente, pase los organoides a través de etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 96%, etanol al 100%, etanol al 100%, xileno y xileno. Deseche la última lavada de xileno y vierta parafina en el vial de vidrio.Coloque inmediatamente el vial en el bloque de aluminio precalentado a 70 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, reemplace la parafina con parafina nueva y limpia utilizando un PE o pipeta precalentados. Vierta la parafina y use una varilla o pipeta precalentada con una abertura grande para transferir los organoides al molde del bloque de parafina, sumergiéndolos en una capa de parafina líquida.Caliente una aguja de disección con un mechero Bunsen y manipule todos los organoides lo más posible hacia el centro del molde de parafina. Cuando la localización de los organoides en el molde sea satisfactoria, enfríe ligeramente el molde para solidificar la capa de parafina. Termine el bloque vertiendo más parafina por encima y agregue una casete de inclusión histológica estándar.En este protocolo, los organoides del epitelio intestinal fueron transducidos con lentivirus. Los organoides normales crecen como estructuras de criptas villosas K, con una serie de criptas que emergen de un dominio vellositario compartido. Tras el tratamiento de estos organoides con el inhibidor GSK tres B, CHIR 9 9 0 21, la proliferación aumenta y las criptas se vuelven quísticas tras la transducción del organoide.Mediante la sobreexpresión de EGFP utilizando lentivirus, los organoides expresan EGFP fluorescente, por lo que no se requieren pasos de mejora de la transducción que podrían realizarse cuando la eficacia de transducción es baja, como la inoculación o la incubación prolongada con el virus, ya que estos pasos no aumentarán la eficacia, que ya es elevada. Posteriormente, estos organoides se procesan para técnicas de ARN e inmunohistoquímica. Esta imagen representativa es una sección de un organoide intestinal de ratón, teñida para BRDU tras la incubación con BRDU durante una hora antes de la fijación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transducir organoides a partir de epitelio intestinal primario utilizando partículas lentivirales o retrovirales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

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