Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides
20 de abril de 2015
En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.
El objetivo general de este procedimiento es generar organoides transducidos de forma estable a partir del epitelio intestinal primario de ratón para el análisis posterior de organoides intestinales. Esto se logra mediante la primera seccionamiento de células T HEC 2 93 con vectores de empaquetamiento lentiviral y plásmido lentiviral, codificando el gen de interés para producir partículas lentivirales de alto título. El segundo paso es el tratamiento previo de organoides intestinales de ratón cultivados con una serie de factores de crecimiento para obtener criptas hiperproliferativas quísticas.
A continuación, transducir los organoides con el lentivirus de alto título e incubar los organoides transducidos en matrigel. El paso final es incrustar organoides transducidos completamente desarrollados en parafina para el análisis inmunohistoquímico posterior. En definitiva, la transducción de organoides lentivirales se utiliza para generar alteraciones genéticas en un modelo in vitro del epitelio intestinal que es fiable, reproducible y rápido.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las líneas celulares cancerosas, es que los organoides son una jerarquía de células madre desplazadas no mutadas. En el texto de la polarización celular, puede diferenciarse en todos los diferentes tipos de células del epitelio del intestino delgado. Además, los organoides transducidos se pueden utilizar para estudiar elementos genéticos específicos, superando así el uso de ratones transgénicos y las facetas de costo y velocidad.
La producción de partículas lentivirales es un protocolo de cinco días que comienza con la división de las células T HEC 2 93 a un 60 a 80% de fluidez en un matraz de 162 centímetros cuadrados en medio de cultivo celular. Incubar las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados al día siguiente. Prepare la solución de transfección de ADN y la solución de transfección de polietileno amina o PEI como se describe en el texto del protocolo.
Agregue la solución de transfección de ADN al vórtice de la solución de PEI o invierta varias veces e incube durante cinco minutos. A temperatura ambiente. Gotee dos mililitros de la solución de TRANSFECCIÓN DE ADN más PEI en las células T HEC 2 93 e incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados después de cuatro horas.
Refresque el medio de cultivo. Para eliminar el PEI, incube las células durante dos días a 37 grados centígrados el cuarto día, recoja el sobrenadante en un tubo de 50 mililitros. Agregue un nuevo medio de cultivo a las celdas y devuelva el matraz a la incubadora, centrífugue el sobrenadante recolectado a 500 Gs durante cinco minutos.
Para eliminar las células muertas, utilice una jeringa grande de 60 mililitros para empujar el SUPERNAT a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Almacene el supernat filtrado durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Recoja la centrífuga y filtre el segundo lote de sobrenadante como se muestra para el primer lote.
Agrupe los dos lotes de sobrenadante en tubos ultracentrífugos. Centrífuga a 50.000 GS durante 90 minutos. Cuando se complete la centrifugación, con mucho cuidado, retire las cápsulas que contienen los tubos ultracentrífugos y colóquelos en una campana de flujo laminar.
Abra la cápsula que sujeta el tubo ultracentrífugo y decante el medio con cuidado con el pellet en la parte superior del tubo. Es importante recordar qué lado del tubo se habría formado la apelación, ya que los gránulos virales pueden ser difíciles de visualizar. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar el último trozo de medio teniendo cuidado de no agitar la bolita marrón opaca que se ve en el lateral de la parte inferior del tubo de ultracentrífuga.
Vuelva a suspender este pellet en 500 microlitros de medio de cultivo de organoides suplementado con inhibidores de la nicotinamida quinasa y poly brain resus. La suspensión en este medio es importante ya que el virus de alto título se utilizará directamente para la transducción de organoides dos días antes de la transducción. Divida un pocillo completo de 0,95 centímetros cuadrados de organoides en un nuevo pocillo de una placa de 48 pocillos.
Siguiendo un protocolo previamente publicado. El objetivo es obtener aproximadamente 50 organoides pequeños en cultivo de organoides. Medio suplementado con un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa y nicotinamida.
Para obtener criptas quísticas hiperproliferativas. Incubar los organoides durante dos días el día de la transducción, cosechar los organoides con una micropipeta P 1000. Pipetear el gel de matra y el medio hacia arriba y hacia abajo, interrumpiendo así la mezcla.
Coloca la mezcla en un tubo de 15 mililitros. Altere aún más la mezcla con un PEs su pipeta en la que la abertura distal se haya disminuido derritiendo los organoides mediante la centrifugación a 100 Gs durante cinco minutos. A continuación, retirar el sobrenadante a 500 microlitros de precalentar uno x tripsina y volver a suspender los organoides incubar durante tres minutos.
En un baño de agua a 37 grados centígrados, inactive la tripsina agregando 3,5 mililitros de centrífuga de medio de cultivo de línea celular durante cinco minutos. A 500 Gs.Retirar el super natan para dejar el pellet en aproximadamente 20 microlitros de medio. Transfiera los organoides de esta última pequeña cantidad de medio a un pozo.
En una placa de 48 pocillos. Añadir a los organoides el lentivirus de alto título previamente preparado en medio de transducción y volver a suspender. Incubar la mezcla de virus organoide durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo para permitir la transducción después de una hora, agregar un mililitro de cultivo de organoides, medio a la mezcla de virus organoides, resuspender y transferir la mezcla a una centrífuga de tubo de microcentrífuga a 850 GS durante cinco minutos.
Para pellet los organoides, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet. En 20 microlitros de gel matra helado, pon la gota en el centro de un pozo. En una placa de 48 pocillos e incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Para que la gota se solidifique después de 15 minutos. Agregue con cuidado 250 microlitros de cultivo de organoides. Medio suplementado con nicotinamida e inhibidores de la quinasa.
Precalentar un bloque de aluminio en una incubadora a 70 grados centígrados para mantener la parafina líquida. Retire el medio de un solo pocillo con organoides adultos, dejando intactos los organoides incrustados, y agregue un mililitro de aldehído Paraform al 4% en PBS directamente al pocillo. Reemplace el aldehído paraformado con un mililitro de PBS.
Vuelva a suspender los organoides fijados en el PBS y transfiéralos a un vial de vidrio. Deje que los organoides se hundan hasta el fondo durante un minuto. A continuación, pipetee el PBS y reemplácelo con etanol al 70% en el que se disuelven un par de gotas de solución de eoína.
Para permitir la visualización de los organoides durante todo el proceso de incrustación, deje los organoides en etanol al 70% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire el etanol al 70% pipeteando cuidadosamente. Los organoides se pueden visualizar a simple vista debido al color rosado de la eoína.
Reemplace la solución de inclusión con etanol al 96% y déjela a temperatura ambiente durante 30 minutos de esta manera. Posteriormente, pase los organoides a través de 70% de etanol, 90% de etanol, 96% de etanol, 100% de etanol, 100% de etanol, xileno y xileno. Decantar el último lavado de xileno y verter parafina en el frasco de vidrio.
Coloque el vial inmediatamente en el bloque de aluminio precalentado a 70 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, reemplace la parafina con parafina nueva y limpia con un precalentamiento, PE o pipeta. Vierta la parafina y use una plaga precalentada o una pipeta con una abertura grande para pipetear los organoides en el molde de bloques de parafina en una capa de parafina líquida.
Caliente una aguja de disección con un mechero Bunsen y manipule todos los organoides tanto como sea posible hacia el centro del molde de bloques de parafina. Cuando la localización de los organoides en el molde sea satisfactoria, enfríe ligeramente el molde para solidificar la capa de parafina. Termine el bloque vertiendo más parafina encima y agregue un casete de inclusión histológica estándar.
En este protocolo, se transducieron organoides del epitelio intestinal con lentivirus. Los organoides normales crecen como estructuras vellosas de cripta K con una serie de criptas que salen de un dominio de vellosidades compartido. Tras el tratamiento de estos organoides con el inhibidor de GSK tres B, CHIR 9 9 0 21, la proliferación aumenta y las criptas se vuelven quísticas después de la transducción de organoides.
Al utilizar la sobreexpresión de EGFP lentiviral, los organoides expresan pasos fluorescentes de mejora de la transducción de EGFP que se pueden realizar cuando la eficacia de la transducción es baja, como la inoculación o la incubación viral prolongada, ya que estos pasos no aumentarán la ya alta eficacia. Posteriormente, estos organoides se procesan para técnicas de ARN e inmunohistoquímica. Esta imagen representativa es una sección de un organoide intestinal de ratón, teñida para BRDU después de la incubación con BRDU durante una hora antes de la fijación.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transducir organoides del epitelio intestinal primario utilizando partículas lentivirales o retrovirales.
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Resumen
Este protocolo en video ofrece una explicación detallada de la transducción lentiviral en organoides derivados del epitelio intestinal primario. Describe el procesamiento y el análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativa, microarreglos de ARN e inmunohistoquímica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Ingeniería genética
Antecedentes
- La transducción lentiviral es un método utilizado para introducir material genético en células.
- Los organoides son estructuras tridimensionales que imitan la arquitectura y funcionalidad de órganos.
- Los organoides de epitelio intestinal primario son valiosos para estudiar la biología intestinal.
- Las técnicas de análisis posterior son esenciales para validar modificaciones genéticas.
Objetivo del estudio
- Generar organoides transducidos de manera estable para la investigación sobre el epitelio intestinal.
- Permitir alteraciones genéticas en un modelo in vitro.
- Facilitar estudios confiables y reproducibles de la biología intestinal.
Métodos Utilizados
- Transfección de células HEC 293T con vectores de empaquetamiento lentivirales.
- Producción de partículas lentivirales de alto título.
- Pretatamiento de organoides con factores de crecimiento.
- Transducción de organoides con lentivirus e incubación en matrigel.
- Inclusión de organoides en parafina para inmunohistoquímica.
Resultados principales
- Generación exitosa de organoides intestinales modificados genéticamente.
- Validación de la eficiencia de transducción mediante RT-PCR cuantitativa.
- Análisis de la expresión génica utilizando microarreglos de ARN.
- Caracterización inmunohistoquímica de las estructuras de los organoides.
Conclusiones
- La transducción lentiviral es un método eficaz para modificar organoides intestinales.
- Este enfoque proporciona un modelo confiable para estudiar la biología del epitelio intestinal.
- Los métodos descritos pueden aplicarse a diversos estudios genéticos en organoides.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transducción lentiviral de organoides intestinales permite una genómica funcional rápida y rentable en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, reduciendo la dependencia de modelos de ratones transgénicos. Este enfoque facilita la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos al permitir manipulaciones genéticas precisas en un sistema que mantiene la jerarquía de células madre intestinales, la polaridad y los tipos celulares diferenciados. El protocolo proporciona un flujo de trabajo escalable para generar alteraciones genéticas estables adecuadas para análisis cuantitativos posteriores, acelerando el descubrimiento en biología gastrointestinal y áreas terapéuticas relacionadas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la expresión inducible de transgenes o el silenciamiento mediado por shRNA en organoides intestinales.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas al modelar perturbaciones genéticas en una arquitectura epitelial similar a la natural.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los resultados de la modulación de dianas al mantener la diferenciación homeostática y la polaridad celular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce poblaciones de organoides transducidos adecuadas para lecturas de RT-PCR cuantitativa, microarreglos de ARN e inmunohistoquímica.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de organoides mediante un pretratamiento con factores de crecimiento para generar criptas quísticas hiperproliferativas que permitan una transducción constante.
- Preparación para ensayos: Permite plataformas confiables de cribado de compuestos o genético utilizando reporteros fluorescentes o inmunohistoquímicos como EGFP.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la biología del epitelio intestinal relevante para la enfermedad, lo que favorece la extrapolación a modelos in vivo.
- Utilidad Preclínica: Facilita el análisis alineado con biomarcadores mediante procesamiento posterior para la detección de proteínas y ácidos nucleicos.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite ciclos iterativos de modificación genética para reducir los riesgos de los blancos antes de la validación in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir estudios de perturbación genética que orientan la selección de dianas y la optimización de compuestos iniciales, cuyos resultados se incorporan a la validación preclínica mediante perfiles moleculares e histológicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis mediante la sobreexpresión inducible o la inhibición de genes de interés en un sistema epitelial polarizado.
- Cribado: Proporciona una eficiencia de transducción adecuada para lecturas escalables mediante qPCR, microarreglos o IHC, sin necesidad de marcadores de selección.
- Análisis: Genera datos cuantitativos de expresión de ácidos nucleicos y proteínas para comparar condiciones genéticas y evaluar el impacto fenotípico.
- Investigación Traducional: Conecta modificaciones genéticas con lecturas funcionales en un contexto similar al tisular, favoreciendo la correlación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la modulación mediada por lentivirus en múltiples dianas en modelos de enfermedades intestinales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva mediante la modelización de efectos genéticos en un sistema epitelial no transformado y fisiológicamente preciso.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de producción de lentivirus y pretratamiento de organoides.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al acelerar los plazos de validación de dianas en comparación con enfoques transgénicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en resultados funcionales en un sustrato tisular relevante para el ser humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la producción de vectores lentivirales, cultivo de organoides y procesamiento histológico.
- Depende del acceso a infraestructura de ultracentrifugación, microscopía de fluorescencia e inclusión en parafina.
- Necesita una estandarización entre equipos en las unidades de virología, cultivo celular e histología para obtener resultados consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a organoides colónicos o sistemas derivados de modelos de enfermedad.
- Está limitado por el rendimiento de los organoides y su sensibilidad a los pasos de disociación enzimática durante el procesamiento.
