Name: Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a generar, mantener y caracterizar organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas. Este protocolo mejora la reproducibilidad y escalabilidad en investigación gastrointestinal.

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<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
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<table><tbody><tr><td>Solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1%</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo Corning de 15 ml</td><td>Halcón</td><td>21008-918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>30% Sacarosa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hecho en PBS.</td></tr><tr><td>5% Suero de burro normal</td><td>Laboratorio de investigación inmunológica de Jackson</td><td>017-000-121</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo Corning de 50 ml</td><td>Halcón</td><td>21008-951</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Accutasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1110501</td><td>Solución de desprendimiento celular; alícuota 5 ml de Accutasa en tubos de 10 ml con un total de 20 tubos y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.</td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Sistemas de guiado celular</td><td>GFH6-100x10</td><td>Reconstituir el polvo liofilizado a 100 &micro; g/ml en PBS estéril que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Alícuota 38 &micro; L de Activina A en tubos de microcentrífuga preenfriados y almacenar a -80 ° C (Los tubos caducan a los 12 meses de la fecha de recepción).</td></tr><tr><td>Activina día 1 medio (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Use aminoácidos no esenciales (NEAA, Corning 11140050) y almacene a 4 °C. Medio básico del día 1: 500 ml de RPMI 1640 y 500 ml de NEAA. Cuando prepare Activin día 1 medio, agregue 13 ml de medio básico día 1, 13 &micro; l de Activina A (100 &micro; g/mL), y 2 &micro; l de BMP4 (100 &micro; g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Activina día 2 medio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03D</td><td>Use aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 2: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 1 ml de suero al 0,2%. Al preparar Activin Day 2 medium, agregue 12.5 mL de basic day 2 medium y 12.5 &micro; L de Activina A (100 &micro; g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Activina día 3 medio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03D</td><td>Use aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 3: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 10 ml de suero al 2%. Cuando prepare Activin día 3 medio, agregue 12,5 ml de día básico 3 y 12,5 &micro; L de Activina A (100 &micro; g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-Cabra</td><td>Thermo Scientific</td><td>Referencia A11055</td><td>Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Conejo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Referencia A21206</td><td>Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Donkey anti-Ratón</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10036</td><td>Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey anti-Ratón</td><td>Thermo Scientific</td><td>Referencia A31571</td><td>Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)</td></tr><tr><td>Molde base</td><td>Pescador</td><td>22-363-552</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Medio intestinal básico (DMEM avanzado)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Al preparar el medio intestinal básico, agregue 500 ml de DMEM, 500 ml de N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml de B27 (Gibco), 500 ml de L-glutamina para obtener 2 ml de L-glutamina (Corning A2916801), 5 ml de 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco 15-140-122) y 7,5 ml de L&nbsp; 1 M HEPES para obtener 15 mM HEPES. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Sistema de detección de PCR en tiempo real Biorad CFX96 Touch</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td>Se pueden utilizar otros sistemas qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Solución de recuperación celular</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Solución degradante de ECM</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>4000410</td><td>Reconstituya agregando 2,15 ml de DMSO a 10 mM. Preparar 50 &micro; L alícuotas y almacenar a -20 °C. Almacene el polvo a 4 ° C; C, protegido de la luz.</td></tr><tr><td>CTRL HIO medio de patrón</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Medio intestinal básico y 100 ng/mL EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Dilución 1:100 (anticuerpo secundario)</td></tr><tr><td>Monocapa DE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>La monocapa se generó en pasos anteriores (Sección 4.4).</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td>Vuelva a suspender el polvo liofilizado en DMEM avanzado (Gibco MT15090CV) a una concentración final de 1 mg / ml. Filtre la solución para la esterilización aspirando con un tubo de esterilización con filtro Millipore. Hacer 10 mL de alícuotas (1 mg/mL) y almacenar a -20 &deg; C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.</td></tr><tr><td>FEAG</td><td>Thermo Scientific</td><td>236-EG-01M</td><td>Al preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 &micro; g/ml en PBS estéril. A continuación, agregue 2 ml de PBS estéril a 1 mg de EGF y haga 500 &micro; g/ml de solución de EGF. Alícuota 100 &micro; L de EGF en 20 tubos.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Placas Petri de 6 cm con tapa transparente</td><td>Pescador</td><td>FB0875713A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Elevador de celda Fisherbrand</td><td>Pescador</td><td>08-100-240</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Viales roscados de vidrio transparente clase B con cierres adjuntos</td><td>Pescador</td><td>03-338B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipeta de Pasteur de Vidrio de Borosilicato Desechable Fisherbrand</td><td>Pescador</td><td>13-678-2D0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Medio de montaje deslizante Fluoromount G</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>N/A</td></tr><tr><td>DMEM avanzado de Gibco</td><td>Gibco</td><td>12-491-023</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cabra anti-E-Cadherina</td><td>R& Sistemas D</td><td>AF648</td><td>Dilución 1:400 (anticuerpo primario)</td></tr><tr><td>Cabra anti-SOX17</td><td>R& Sistemas D</td><td>AF1924</td><td>Dilución 1:500 (anticuerpo primario)</td></tr><tr><td>Medio de patrón HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Medio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL BMP2. Al preparar BMP2, agregue 1 ml de BSA estéril de 4 mM HCl al 0,1% a los viales de BMP2 (100 &micro; g). Alícuota 25 &micro; L de solución de BMP4 en 4 tubos. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Células madre pluripotentes humanas (hPSC)</td><td>Instalación de células madre pluripotentes</td><td>N/A</td><td>Células sembradas en una placa de 24 pocillos recubierta de Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>Solución helada de paraformaldehído al 4% (PFA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato helada (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>El pH debe ser de 7,4.</td></tr><tr><td>Lápiz de barrera hidrofóbica ImmEdge</td><td>Laboratorios Vector</td><td>101098-065</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)</td><td>Centro de células madre pluripotentes (Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati)</td><td>N/A</td><td>Se pueden usar otras líneas hESC o iPSC, pero el protocolo debe optimizarse para cada línea celular.</td></tr><tr><td>Micrótomo de Leica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>microscopio confocal</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Matriz calificada por Matrigel hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Prepare 4 alícuotas de Matrigel que correspondan a volúmenes suficientes para hacer suficiente Matrigel diluido para 4 platos de 6 pocillos.</td></tr><tr><td>Medio de inducción del intestino posterior medio (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Aminoácidos no esenciales (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 &micro; M CHIR99021 y 500 ng/mL FGF4. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.</td></tr><tr><td>Esferoides del intestino posterior medio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de vacío desechables estériles MilliporeSigma Steriflip</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ratón anti-CDX2</td><td>BioGenex</td><td>MU392-UC</td><td>Dilución 1:300 (anticuerpo primario)</td></tr><tr><td>Ratón anti-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento completo mTeSR1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>85870</td><td>Agregue 100 ml de suplemento de mTeSR (85870) en un medio mTeSR de 400 ml (85870) y alícuotas en tubos de 50 ml para evitar la contaminación. Almacenar a 4&deg; C hasta su uso.</td></tr><tr><td>Solución transparente de Murray (también conocida como BABB)</td><td>Murray's</td><td>N/A</td><td>Benzoato de bencilo 1:2 y alcohol bencílico.</td></tr><tr><td>Medio de patrón NOG HIO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Medio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 &micro; g de NOGGIN en 250 &micro; l PBS estéril con BSA al 0,1%).</td></tr><tr><td>ARN de NucleoSpin</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Se pueden usar otros kits de aislamiento de ARN.</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 24 pocillos (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de superficie Nunclon delta de 24 pocillos recubierta con Matrigel</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos recubierta con&nbsp; Matrigel.</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento para HIO, CTRL HIO y HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Medio intestinal básico y 100 ng/mL EGF (concentración final)</td></tr><tr><td>Solución salina de tampón de fosfato, 0,5 % Tritón X (PBS-T)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Imprimaciones</td><td>Tecnologías integradas de ADN, Inc. (IDT)</td><td>N/A</td><td>Los cebadores se enumeran en la Tabla 2 del protocolo.</td></tr><tr><td>Conejo anti-CDX2</td><td>Marca de celda</td><td>EPR22764Y</td><td>Dilución 1:100 (anticuerpo primario)</td></tr><tr><td>Conejo anti-SATB2</td><td>Marca de celda</td><td>EP281</td><td>Dilución 1:100 (anticuerpo primario)</td></tr><tr><td>Proteína BMP-4 humana recombinante</td><td>R& Sistemas D</td><td>314-BP-010</td><td>Reconstituir el polvo liofilizado a 100 &micro; g/ml en HCl estéril 4 mM que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue 4,17 ml de solución de HCl a 45,83 ml de agua molecular para un total de 50 ml de 1 M de HCl. Luego agregue 200 &micro; L de 1 M de HCl a 49,8 mL de agua de grado molecular por un total de 50 mL de 4 mM de HCl. A continuación, agregue 0,05 g de BSA a 50 ml de HCl 4 mM y filtre para que quede estéril. Alícuotas estériles 4 mM HCl 0,1% BSA a 33 tubos de microcentrífuga totalizando y almacenando a -20 °C. Añadir 100 °C; l de BSA estéril 4 mM HCl 0,1% a los viales BMP4 (10 &micro; g) para hacer solución BMP4 a 100 &micro; g/ml.</td></tr><tr><td>Proteína FGF-4 humana recombinante</td><td>R& Sistemas D</td><td>235-F4-01M</td><td>Reconstituir a 100 &micro; g/ml en PBS estéril que contiene albúmina sérica bovina al 0,1%. Agregue 0,05 g de BSA en 50 ml de PBS para hacer un 0,1% de BSA. Filtro 0.22 &micro; M BSA para esterilizar el BSA. Alícuota 10 mL de BSA al 0,1% en 5 tubos. Agregue 1 mg de FGF-4 en 10 ml de BSA estéril al 0,1%. Alícuota 250 &micro; L en tubos de microcentrífuga 40 preenfriados y almacenar a -80 °C.</td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>La concentración final es de 10 mM (10 mmol/L). Volver a suspender en DMSO a 10 mM y esterilizar con filtro. Agregue 3 ml de PBS estéril a cada vial. Aliqout 100 &micro; L de inhibidor de ROCK en 30 tubos y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-754-250</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compuesto Tissue Tek O.C.T</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

La generación exitosa de esferoides durante la etapa de inducción del intestino medio/posterior es indicativa de un patrón exitoso. Realice la tinción de FI para CDX2 en esferoides flotantes y en la monocapa para confirmar que el patrón es correcto. Aunque la tinción en la etapa definitiva del endodermo (DE) puede indicar la eficacia de la inducción de DE, la generación de esferoides no es posible sin una inducción eficiente de DE. Para probar la eficiencia de la inducción de DE, realice la tinción de FI y/o RT-qPCR para...

Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

El siguiente protocolo describe una generación de organoides intestinales y colónicos humanos a partir de células madre pluripotentes humanas. Esta técnica permitirá al usuario interrogar las vías involucradas en el patrón intestinal. Esta técnica permite al usuario generar organoides específicos de la región que son isogénicos. Este protocolo podría proporcionar información sobre los factores que regulan el establecimiento y mantenimiento de patrones intestinales.[Narrador] Comience colocando una matriz extracelular o una placa de 24 pocillos recubierta de ECM dentro de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos para permitir que alcance la temperatura ambiente. Coloque la solución completa de desprendimiento de células medianas mTeSR1 y el DMEM avanzado dentro de un baño de perlas a 37 grados Celsius y déjelos calentar durante 30 minutos. Prepare el medio de recubrimiento en un tubo cónico de 50 mililitros agregando 13 mililitros de mTeSR1 y 13 microlitros de proteína quinasa asociada a Rho Y-27632 de 10 milimolares o inhibidor de ROCK. Para recolectar células de la placa de seis pocillos, aspire el medio de tres a cuatro pocillos y lave una vez con dos mililitros de DMEM avanzado por pocillo. Aspire el DMEM avanzado y dispense un mililitro de la solución de disociación celular en cada pocillo. Incube la placa durante cinco a siete minutos dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% y 37 grados Celsius. Disocie cualquier grupo de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo cuatro o cinco veces con una pipeta de cinco mililitros para preparar la suspensión celular. Agregue dos mililitros de DMEM avanzado en cada pocillo. Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces y transfiérelo a un tubo cónico de 15 mililitros. Gire las celdas a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspire el medio del tubo sin aspirar el gránulo celular. Y agregue seis mililitros del medio preparado de mTeSR1 más inhibidor de ROCK. Vuelva a suspender suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Luego transfiera la suspensión al resto del medio inhibidor mTeSR1 y ROCK dentro del tubo de 50 mililitros. Vuelva a suspender vigorosamente de cuatro a cinco veces y cuente las células con un hemocitómetro. Aspire la ECM de la placa de 24 pocillos justo antes de colocar las celdas. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces, y dispense 0,5 mililitros de la suspensión celular en cada pocillo. Mueva suavemente la placa tres veces en el sentido de las agujas del reloj, tres veces en el sentido contrario a las agujas del reloj, tres veces hacia adelante y hacia atrás, y tres veces de lado a lado para dispersar uniformemente las células. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius e incube durante 24 horas. Después de 24 horas, aspire el medio gastado. Agregue 0,5 mililitros por pocillo de mTeSR1 e incube nuevamente durante 24 horas en las mismas condiciones. Prepare el medio completo de Activin del primer día diluyendo los 100 microgramos por mililitro de solución madre de Activin A y 100 microgramos por mililitro de BMP4 en el medio de Activin del primer día en un tubo cónico. Caliente el medio en un baño de perlas a 37 grados centígrados. Aspire el medio mTeSR1 de la placa de 24 pocillos y agregue 0,5 mililitros de medio Activin día uno por pocillo. Coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius e incube durante 24 horas. Revise las celdas después de 24 horas. Prepare el medio completo del segundo día de Activin diluyendo la solución madre de 100 microgramos por mililitro de Activin A en el medio del segundo día de Activin en un tubo cónico y coloque el tubo en un baño de perlas a 37 grados Celsius. Retire la placa de diferenciación de 24 pocillos de la incubadora de dióxido de carbono y retire el medio gastado. Dispense 0,5 mililitros de medio de Activin del día dos precalentado por pocillo y vuelva a colocar la placa dentro de la incubadora de dióxido de carbono durante 24 horas. Prepare el medio completo del tercer día de Activina diluyendo la solución madre de 100 microgramos por mililitro de Activina A en el medio del tercer día de Activina en un tubo cónico y coloque el tubo en un baño de perlas a 37 grados Celsius. Retire el medio gastado y dispense 0,5 mililitros de medio de Activin día tres por pocillo. Para comenzar con la diferenciación del endodermo definitivo en esferoides del intestino posterior medio, agregue 25 mililitros de medio de inducción del intestino posterior medio con FGF4 en un tubo cónico de 50 mililitros y colóquelo en un baño de perlas a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para preparar el medio de inducción completo del intestino posterior medio, agregue 7,5 microlitros de CHIR99021 después de que el medio esté tibio. Retire el medio gastado, dispense 0,5 mililitros de medio de inducción del intestino posterior medio por pocillo e incube a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de que se produzca la condensación de las células dentro de la monocapa al día siguiente, reemplace el medio gastado con un medio de inducción fresco del intestino posterior medio y vuelva a colocar la placa para incubación durante 24 horas. Para evitar desechar los esferoides flotantes mientras cambia el medio, transfiera el medio viejo a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante un minuto. Vuelva a suspender los esferoides en 12,5 mililitros de medio de inducción fresco del intestino medio-posterior, agregue 0,5 mililitros por pocillo en la misma placa de 24 pocillos e incube durante 24 horas en la incubadora. En el cuarto día de inducción del intestino posterior, coseche los esferoides flotantes de los pocillos de la placa recolectando el medio en un tubo de 15 mililitros, seguido de centrifugación a 300 G durante un minuto. La eficiencia de la inducción definitiva del endodermo se evaluó mediante la realización de tinción de inmunofluorescencia para FOXA2 y SOX17. Se encontró que la expresión de ARNm del factor HOX HOXD3 anterior era la más alta en los organoides intestinales humanos o HIO tratados con Noggin, menor en el factor de crecimiento epitelial o HIO tratados con EGF, y más baja en los organoides colónicos humanos o HCO tratados con BMP. Por el contrario, se encontró que las expresiones de ARNm de HOXA13 y HOXD13 eran bajas en HIO y altas en HCO. Se realizó tinción de inmunofluorescencia para SATB2, CDX2 y CDH1 para determinar si el epitelio HCO estaba correctamente modelado.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Describimos un método para establecer enteroides humanos a partir de criptas del intestino delgado y colonoides a partir de criptas de colon recogidas tanto de tejido quirúrgico como de biopsias. En este artículo metodológico, presentamos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento exitoso de enteroides y colonoides humanos.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

Generación de organoides intestinales derivados de hiPSC para aplicaciones de modelización del desarrollo y de enfermedades

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

Describimos un protocolo para aislar criptas murinas del intestino delgado y cultivar organoides 3D intestinales de las criptas. Además, describimos un método para generar organoides a partir de una sola célula madre intestinal en ausencia de un nicho celular subepitelial.

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides intestinales de ratas y usarlos en varias aplicaciones posteriores. Las ratas suelen ser un modelo preclínico preferido, y el robusto sistema de organoides intestinales satisface la necesidad de un sistema in vitro para acompañar los estudios in vivo .

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

Los organoides se han convertido en herramientas valiosas para el modelado de enfermedades. La matriz extracelular (ECM) guía el destino de las células durante la generación de organoides, y el uso de un sistema que se asemeje al tejido nativo puede mejorar la precisión del modelo. Este estudio compara la generación de organoides intestinales humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas en ECM de origen animal e hidrogeles libres de xeno.

Estudio comparativo de matrices de membrana basal para el mantenimiento de células madre humanas y la generación de organoides intestinales

Los organoides intestinales humanos deben ser inervados para recapitular mejor la estructura y función del intestino humano nativo. Aquí, presentamos un método para incorporar un sistema nervioso entérico en estas construcciones.

Inervación de organoides intestinales humanos

Aquí, describimos un protocolo para generar organoides intestinales apicales a partir de cultivos de organoides estándar incrustados en matriz. También describe la posterior incorporación de EdU en células en proliferación activa y la cuantificación semiautomática de células EdU positivas.

Generación de organoides intestinales apicales y evaluación de la tasa de proliferación de organoides mediante el marcaje EdU

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Aprenda a generar, mantener y caracterizar organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas. Este protocolo mejora la reproducibilidad y escalabilidad en investigación gastrointestinal.

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Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

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