Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

El siguiente protocolo describe una generación de organoides intestinales y colónicos humanos a partir de células madre pluripotentes humanas. Esta técnica permitirá al usuario interrogar las vías involucradas en el patrón intestinal. Esta técnica permite al usuario generar organoides específicos de la región que son isogénicos. Este protocolo podría proporcionar información sobre los factores que regulan el establecimiento y mantenimiento de patrones intestinales.

[Narrador] Comience colocando una matriz extracelular o una placa de 24 pocillos recubierta de ECM dentro de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos para permitir que alcance la temperatura ambiente. Coloque la solución completa de desprendimiento de células medianas mTeSR1 y el DMEM avanzado dentro de un baño de perlas a 37 grados Celsius y déjelos calentar durante 30 minutos. Prepare el medio de recubrimiento en un tubo cónico de 50 mililitros agregando 13 mililitros de mTeSR1 y 13 microlitros de proteína quinasa asociada a Rho Y-27632 de 10 milimolares o inhibidor de ROCK. Para recolectar células de la placa de seis pocillos, aspire el medio de tres a cuatro pocillos y lave una vez con dos mililitros de DMEM avanzado por pocillo. Aspire el DMEM avanzado y dispense un mililitro de la solución de disociación celular en cada pocillo. Incube la placa durante cinco a siete minutos dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% y 37 grados Celsius. Disocie cualquier grupo de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo cuatro o cinco veces con una pipeta de cinco mililitros para preparar la suspensión celular. Agregue dos mililitros de DMEM avanzado en cada pocillo. Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces y transfiérelo a un tubo cónico de 15 mililitros. Gire las celdas a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspire el medio del tubo sin aspirar el gránulo celular. Y agregue seis mililitros del medio preparado de mTeSR1 más inhibidor de ROCK. Vuelva a suspender suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Luego transfiera la suspensión al resto del medio inhibidor mTeSR1 y ROCK dentro del tubo de 50 mililitros. Vuelva a suspender vigorosamente de cuatro a cinco veces y cuente las células con un hemocitómetro. Aspire la ECM de la placa de 24 pocillos justo antes de colocar las celdas. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces, y dispense 0,5 mililitros de la suspensión celular en cada pocillo. Mueva suavemente la placa tres veces en el sentido de las agujas del reloj, tres veces en el sentido contrario a las agujas del reloj, tres veces hacia adelante y hacia atrás, y tres veces de lado a lado para dispersar uniformemente las células. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius e incube durante 24 horas. Después de 24 horas, aspire el medio gastado. Agregue 0,5 mililitros por pocillo de mTeSR1 e incube nuevamente durante 24 horas en las mismas condiciones. Prepare el medio completo de Activin del primer día diluyendo los 100 microgramos por mililitro de solución madre de Activin A y 100 microgramos por mililitro de BMP4 en el medio de Activin del primer día en un tubo cónico. Caliente el medio en un baño de perlas a 37 grados centígrados. Aspire el medio mTeSR1 de la placa de 24 pocillos y agregue 0,5 mililitros de medio Activin día uno por pocillo. Coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius e incube durante 24 horas. Revise las celdas después de 24 horas. Prepare el medio completo del segundo día de Activin diluyendo la solución madre de 100 microgramos por mililitro de Activin A en el medio del segundo día de Activin en un tubo cónico y coloque el tubo en un baño de perlas a 37 grados Celsius. Retire la placa de diferenciación de 24 pocillos de la incubadora de dióxido de carbono y retire el medio gastado. Dispense 0,5 mililitros de medio de Activin del día dos precalentado por pocillo y vuelva a colocar la placa dentro de la incubadora de dióxido de carbono durante 24 horas. Prepare el medio completo del tercer día de Activina diluyendo la solución madre de 100 microgramos por mililitro de Activina A en el medio del tercer día de Activina en un tubo cónico y coloque el tubo en un baño de perlas a 37 grados Celsius. Retire el medio gastado y dispense 0,5 mililitros de medio de Activin día tres por pocillo. Para comenzar con la diferenciación del endodermo definitivo en esferoides del intestino posterior medio, agregue 25 mililitros de medio de inducción del intestino posterior medio con FGF4 en un tubo cónico de 50 mililitros y colóquelo en un baño de perlas a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para preparar el medio de inducción completo del intestino posterior medio, agregue 7,5 microlitros de CHIR99021 después de que el medio esté tibio. Retire el medio gastado, dispense 0,5 mililitros de medio de inducción del intestino posterior medio por pocillo e incube a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de que se produzca la condensación de las células dentro de la monocapa al día siguiente, reemplace el medio gastado con un medio de inducción fresco del intestino posterior medio y vuelva a colocar la placa para incubación durante 24 horas. Para evitar desechar los esferoides flotantes mientras cambia el medio, transfiera el medio viejo a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante un minuto. Vuelva a suspender los esferoides en 12,5 mililitros de medio de inducción fresco del intestino medio-posterior, agregue 0,5 mililitros por pocillo en la misma placa de 24 pocillos e incube durante 24 horas en la incubadora. En el cuarto día de inducción del intestino posterior, coseche los esferoides flotantes de los pocillos de la placa recolectando el medio en un tubo de 15 mililitros, seguido de centrifugación a 300 G durante un minuto. La eficiencia de la inducción definitiva del endodermo se evaluó mediante la realización de tinción de inmunofluorescencia para FOXA2 y SOX17. Se encontró que la expresión de ARNm del factor HOX HOXD3 anterior era la más alta en los organoides intestinales humanos o HIO tratados con Noggin, menor en el factor de crecimiento epitelial o HIO tratados con EGF, y más baja en los organoides colónicos humanos o HCO tratados con BMP. Por el contrario, se encontró que las expresiones de ARNm de HOXA13 y HOXD13 eran bajas en HIO y altas en HCO. Se realizó tinción de inmunofluorescencia para SATB2, CDX2 y CDH1 para determinar si el epitelio HCO estaba correctamente modelado.