Name: Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a fabricar dispositivos de órgãos-em-microplaqueta com eletrodos integrados para medir diretamente a resistência elétrica transendotelial em modelos da barreira hematoencefálica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Reconhecemos, com gratidão, Johan Bomer para fabricação do molde e Mathijs Bronkhorst para discussões frutuosas e assistência com a representação de dados.
Esta pesquisa foi financiada por: SRO biomédica Microdevices de L.I. Segerink, MIRA Instituto de engenharia biomédica e técnicos de medicina, Universidade de Twente; SRO órgãos em Chips de A.D. van der Meer, MIRA-Instituto de engenharia biomédica e técnicos de medicina, Universidade de Twente; e VESCEL, ERC Advanced Grant para r. van den Berg (grant, n. º 669768).

1. fabricação do órgão-em-microplaqueta dispositivo <ol><li>fazer uma réplica PDMS de um molde com os desenhos do canal, fabricado usando técnicas padrão de fotolitos e obter as peças PDMS do chip microfluidic.
	G <ol><li>pesa aproximadamente 27 PDMS base agente e agente de cura de 2,7 g; a proporção em massa deve ser de 10:1. Isto é bom para uma laje PDMS espessura de 3 mm em um molde com diâmetro de 130 mm (5 polegadas). Esses componentes homogeneiza.</li>
		<li>Desgaseificar a mistura em um dessecador por aproximadamente 45 min para remover as bolhas de ar.</li>
		<li>Enquanto isso, preparar o molde para a mistura líquida de PDMS por colagem fita desobstruída ao redor do molde ou coloque o molde em um suporte adequado da bolacha.</li>
		<li>Despeje a mistura PDMS desgaseificada sobre o molde. Se qualquer ar bolhas manteve-se na mistura de PDMS ou na superfície do molde, desgaseificar isso novamente por aproximadamente 30 min.</li>
		<li>Curar a mistura PDMS em estufa a 60 ° C por 4 h. permitir arrefecer.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo cruzado, puxe o PDMS curado do molde; o molde pode ser reutilizado imediatamente para tornar mais réplicas PDMS.</li>
		<li>Corte a réplica PDMS em parte superior separada e partes de microplaqueta inferior usando linhas de corte no PDMS.</li>
		<li>Quatro buracos na parte superior usando um soco biópsia afiada com diâmetro de 1 mm para formulário de entradas e saídas. Soco de dentro para fora para evitar que restos PDMS coletando no chip. Cobrir as partes da microplaqueta com fita transparente para protegê-los contra poeira.</li>
		<li>Corte membranas de policarbonato de Transwell inserções em quadrados de aproximadamente 3 × 3 mm 2.</li>
	</ol></li> <li>Montar uma membrana porosa escapamento livre entre as duas partes PDMS para montar um dispositivo de duas camadas interfaceada com uma membrana porosa. 
	Nota: Este protocolo é uma adaptação de Griep et al. 19 e Chueh et al. 26 <ol><li>Prepare uma argamassa PDMS/tolueno usando 0,7 g de agente de base de PDMS, 0,07 g de agente de cura e 540 µ l de tolueno, resultando em uma relação de peso de 5:3. Vórtice da argamassa completamente.</li>
		<li>Spin-casaco 200 µ l de argamassa para uma lamela de vidro a 1500 rpm por 60 s (Ramp a 1000 rpm/s) para adquirir uma camada fina e uniforme de argamassa.</li>
		<li>Transferir uma fina camada de argamassa de lamela na parte inferior e uma parte superior do chip com um rolo de tinta. Colocar a parte de baixo em um prato de forno.</li>
		<li>Com um conjunto de pinças, mergulhe as bordas de uma membrana para a argamassa de rotação-revestido e colocá-lo cuidadosamente no meio da parte inferior</li>
		<li>Coloque cuidadosamente a parte superior na parte inferior prestando atenção ao alinhamento. 
		Nota: Não faça pressão sobre o chip e não deslize a parte superior sobre a parte inferior para evitar que a argamassa de entrar os canais de entupimento da membrana.</li>
		<li>Cobrir as entradas de fichas com fita transparente para impedir que a poeira de entrar o chip e coza-os a 60 ° C por 3 h.</li>
	</ol></li> <li>Integrar os canais do lado eletrodos. 
	Nota: Este protocolo é uma adaptação de Griep et al. 19 e Douville et al. 18 <ol><li>cortar o fio de platina em pedaços de aproximadamente 2 cm. Clean submergindo-los em acetona por 30 min. Enxágue com água e etanol e deixar para secar.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo cruzado, colocar um chip num prato de plástico. Inserir os canais de eletrodo de um chip usando um par de pinças de quatro fios de platina e dobre-as para baixo sobre o prato plástico para permitir a fixação ao prato em uma etapa posterior. Insira os fios 0,7-1 mm dentro do canal de cultura, além da junção do canal em forma de T.</li>
		<li>Aplicar uma gota de cola UV-curable na entrada do canal do elétrodo e permitir que a cola encher o canal em torno do eletrodo por forças capilares.</li>
		<li>Ligar UV e cura a cola quando atingir o final do canal eletrodo. 
		Atenção: Não olhe para a fonte de luz UV, como isso pode prejudicar seus olhos.</li>
		<li>Se fixam os quatro eléctrodos integrados para o prato de plástico com um adesivo epóxi de dois componentes. Isto permite uma manipulação mais fácil dos eletrodos durante as medições sem o risco de puxar os eléctrodos do chip.</li>
		<li>Cobrir os chips com fita transparente e cozê-los em 60 ° C durante 2 h. deixe esfriar e armazenar a livre de poeira até o uso. Desta forma eles podem ser armazenados com segurança para um mês.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cultura de células endoteliais derivado do cérebro no chip <ol><li>revestir os chips para promover a fixação da célula.
	<ol><li>Preencher ambos os canais com fosfato tampão salino (PBS) para molhá-las antes de introduzir os reagentes. Verifique sob um microscópio se existem quaisquer bolhas de ar nos canais. Em caso afirmativo, remova-os por lavagem com PBS extra.</li>
		<li>Preencher ambos os canais com 30 µ l de 20 µ g/mL de fibronectina humana em PBS. Incube a 37 ° C por 3 horas. Verificar se há bolhas de ar e, se necessário, lave os canais com PBS e refil com solução de fibronectina.</li>
		<li>Lave as batatas com o meio de crescimento endotelial e incube-os a 37 ° C e 5% de CO 2 na incubadora por 2 h.</li>
		<li>Medir a TEER as fichas em branco, conforme descrito na etapa 3 para garantir que todos os eléctrodos estão em contacto directo com fluido nos canais. Em fichas de vazias, os valores típicos de TEER são 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>Células de sementes para o canal superior.
	<ol><li>Remover o meio de cultura de um frasco de cultura (área de cultura de 2 de 75 cm) com uma monocamada confluente de humanas células endoteliais microvasculares cerebrais (hCMEC/D3).</li>
		<li>Lavar as células com PBS. Adicionar 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 para 2-5 minutos até que as células têm retirado o frasco de cultura.</li>
		<li>Desativar a tripsina com meio de cultura suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS). Contar as células e calcular o número total de células em suspensão.</li>
		<li>Entretanto, Centrifugar as células hCMEC/D3 a 390 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet celular no volume apropriado de meio de crescimento endotelial (EGM-2) para chegar a uma concentração de 5 x 10 6 células/mL. Isso resulta em uma densidade de semeadura de 2 x 10 5 células/cm 2 no chip.</li>
		<li>Lentamente Pipetar 30 µ l de suspensão de células bem misturado para o canal superior e remova a pipeta a partir da entrada em um movimento fluente, enquanto ainda exercer pressão.</li>
		<li>Verificar a densidade de semeadura sob um microscópio. Uma distribuição uniforme das células em todo o canal superior deve ser alcançada.</li>
		<li>Incubar os chips em 37 ° C e 5% CO 2 pelo menos 1 h. expulsar quaisquer células não-inscritos com meio de cultura endotelial.</li>
	</ol></li> <li>Manter a cultura endotelial em-microplaqueta.
	<ol><li>Duas vezes por dia, insira pontas de pipeta cheia de meio de cultura como reservatórios das enseadas e substituir o médio dentro do chip pelo fluxo movido a gravidade. 
		Nota: Para evitar bolhas de ar de entrar os microcanais de destruir a camada de células, certifique-se de fazer contato de fluido-fluido entre a ponta da pipeta e o líquido em cima do chip antes de inserir a ponta uma enseada. Isto pode ser facilitado pela adição de uma pequena gota no em / tomada antes da introdução da pipeta.</li>
		<li>Também adicionar pipeta ponta reservatórios nos estabelecimentos para impedir a secagem dos canais.</li>
		<li>Incubar os chips em 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	</ol></li></ol> 3. Medições de TEER no chip <ol><li>Configurar the aparelhos de medição de TEER, consistindo de um bloqueio no amplificador e um circuito de cabo de sonda, como foi especificado na Van der Helm et al. 16 como alternativa, potentiostats ou impedância analisadores também são adequados para as medições de TEER baseados na impedância.</li>
	<li>Tirar o chip de incubadora e permitem atingir a temperatura ambiente pelo menos 10 min. remover qualquer líquido do prato plástico ao redor dos eléctrodos para evitar eletrodo ponte fora do chip.</li>
	<li>Levar o espectro de impedância de 200 Hz a 1 MHz para cada combinação de dois eletrodos, resultando em 6 espectros de impedância por chip em apenas 5-10 min. verificar se os espectros de impedância tem as magnitudes esperadas e formas para validar a medição de TEER, como é descrito na seção resultados.</li>
	<li>Colocar o chip de volta na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 depois de terminar a medição.</li>
	<li>Processar os espectros de impedância obtidas para chegar a um valor normalizado de TEER.
	Resistência <ol><li>get a medida <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> entre eletrodos <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, conforme indicado na Figura 2B e D, do planalto resistivo de 10 kHz em espectros de impedância correspondente.</li>
		<li>Calcular a TEER usando as resistências medidas seis correspondente a único chip simultaneamente aponta usando a equação da Figura 2 16: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> nesta equação, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg"> é a área da cultura, através do qual a resistência foi medida, &lt; img alt = " Equação 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt; é a resistência da barreira celular e a membrana, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg"> são a resistência os valores medidos através da barreira celular e <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> e <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> são os valores de resistência medidos na canais em linha reta. 16 a equação é derivada de circuito equivalente, ilustrado na Figura 2.</li>
	</ol></li> <li>Subtrair a TEER em branco da TEER em todos os pontos de tempo para obter o desenvolvimento da TEER no tempo.</li></ol>

<ol><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-4614-9105-7">Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series</a>. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+Measurement+Techniques+for+In+Vitro+Barrier+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Brown, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recreating+blood-brain+barrier+physiology+and+structure+on+chip%3A+A+novel+neurovascular+microfluidic+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).</li>
<li>Deosarkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Dynamic+Neonatal+Blood-Brain+Barrier+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).</li>
<li>Ferrell, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+bioreactor+with+integrated+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+electrodes+for+evaluation+of+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells.</a> Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Partyka, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+regulates+transport+in+a+compliant+3D+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier.</a> Biomaterials. 115, 30-39 (2017).</li>
<li>Van der Helm, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+transendothelial+electrical+resistance+in+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips.</a> Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22422217">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB).</a> Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).</li>
<li>Douville, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+two-layered+channel+system+with+embedded+electrodes+to+measure+resistance+across+epithelial+and+endothelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chemi%22%5BJournal%5D)">Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers.</a> Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+ON+CHIP%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnol Bioeng. , (2016).</li>
<li>Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier.</a> Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400515301672">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996109002083">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Weksler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Chueh, B. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leakage-free+bonding+of+porous+membranes+into+layered+microfluidic+array+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems.</a> Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).</li>
<li>Golowasch, J., Nadim, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGolowasch%2C+J+%22Encyclopedia+of+Computational+Neuroscience%22">Encyclopedia of Computational Neuroscience</a>. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste manuscrito, a engenharia de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta e a determinação direta da resistência transendothelial eléctrica (TEER) de uma barreira celular cultivada no dispositivo foram apresentados. O método apresentado de integrar eletrodos sem equipamento de salas limpas e a determinação de TEER direta usando quatro eletrodos é aplicável a qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos microfluidic. O layout de microplaqueta e geometria podem ser adaptados para atender os requisitos dos experimentos envisioned, contanto que os quatro eléctrodos são separados em dois compartimentos. Os quatro eletrodos podem mesmo ser convenientemente inseridos nas enseadas de fichas existentes, desde que eles são fixados no lugar para a duração das seis medições. O método de ligação livre de vazamento pode ser otimizado para diferentes membranas e geometrias de canal, alterando a relação PDMS/tolueno. Um teor mais elevado de tolueno resulta em uma camada mais fina spin-revestido de argamassa26 e pode ser mais apropriado para canais mais rasas e mais estreitos na parte PDMS. Um resultados de tolueno menor conteúdo em um almofariz mais espesso camada26 e podem ser mais apropriado para delimitar mais espessas membranas entre as partes PDMS.
Como pode ser visto nos espectros de impedância esquemática na Figura 2A e os espectros experimentais na Figura 2E e 2F, as medições de impedância são influenciadas pela capacitância da dupla camada na interface eletrodo-médio. Devido ao pequeno tamanho dos eletrodos dentro os microcanais, a capacitância da dupla camada pode dominar sobre o planalto resistivo da barreira celular nos espectros de impedância, complicando a quantificação de TEER o. Para superar isso, os eletrodos podem ser inseridos mais nos canais de cultura antes de fixação. Isto irá aumentar a área da superfície do eletrodo exposto com meio de cultura e com isso a capacitância da dupla camada aumentará também. Isso resulta em uma mudança da inclinação capacitiva para frequências mais baixas, para que o planalto resistivo da barreira celular pode ser mais facilmente reconhecido e quantificado. Embora a resistência do caminho medido entre dois eletrodos se tornará menor, isso não influenciará a quantificação de TEER o método apresentado a seguir.
Durante a medição através da barreira celular, é possível que o planalto extra resistivo não pode ser reconhecido. Isto pode ser o resultado de uma conexão fluídico entre os dois canais, por exemplo, se a membrana mal delimitada pelo morteiro, levando a um caminho medido próximo a barreira celular. Além disso, pode haver uma ponte elétrica fora o chip se os eléctrodos estão ligados por uma gota de meio de cultura. Isto é geralmente combinado com uma baixa impedância medida e pode ser resolvido removendo esta ponte do meio de cultura. Por último, se não há nenhum planalto resistivo e a impedância medida é ordens de magnitude maior do que o esperado, pode haver uma conexão frouxa na fiação elétrica ou na fonte de energia.
No futuro, a relevância fisiológica do atual BBB-em-chip pode ser aumentada, expondo as células endoteliais para distorcer o stress em níveis fisiológicos, que é relatado para promover tensão de barreira de diferenciação e aumento BBB e é difícil de alcançar em modelos convencionais em vitro . 29 além disso, o canal inferior do dispositivo apresentado fornece um compartimento apropriado para células derivado do cérebro para ser cultivadas co com o endotélio. Isso também é esperado para aumentar a função de barreira e também permite o estudo das interações complexas entre tipos de células relevantes sob condições patológicas. 29
Em conclusão, o órgão-em-microplaqueta dispositivo descrito nesta publicação pode ser fabricado utilizando equipamentos laboratoriais padrão e é mostrado para fornecer medições directas de TEER usando quatro eléctrodos integrados que não impedem a inspeção visual da célula estudada camada. A aplicabilidade deste dispositivo no campo de órgãos em chips foi demonstrada por imitando o BBB neste chip e monitoramento a TEER durante o período de cultura. Uma série de outros órgãos (barreira) pode ser imitada, incluindo outros tipos de células relevantes para este chip. Além disso, o método de medição TEER pode ser facilmente aplicado em outros dois dispositivos baseados no compartimento órgão-em-microplaqueta para chegar a valores TEER reprodutíveis e significativos que podem ser comparados através de dispositivos e sistemas.

Órgãos em chips são rapidamente emergindo como um novo e promissor classe in vitro , modelos de tecido. 1 nesses modelos, as células são cultivadas dentro de dispositivos microfluídicos que são projetados de tal forma que eles imitam o microambiente fisiológica dessas células. 1 , 2 isto resulta em comportamento fisiológico ou patológico mais realista dessas células do que pode ser esperado de modelos convencionais em vitro de design simples e função básica. 3 , 5 , 6 além disso, órgãos em chips fornecem um melhor ambiente controlável do que os modelos na vivo e podem incorporar tecidos saudáveis e doentes, de origem humana para replicar fielmente tanto humana fisiologia e patologia. Os avanços recentemente resumidos no desenvolvimento do sangue – cérebro barreiras em chips (BBBs em chips) mostram que o campo é rapidamente se movendo para a frente. 7
Outra vantagem de órgãos em chips é que eles permitem monitoramento em tempo real e contínua do tecido cultivado dentro do dispositivo por microscopia, análises bioquímicas on-line e sensores integrados. 1 , 2 por exemplo, medir a resistência elétrica transendothelial ou transepitelial (TEER) é um método poderoso para monitorização não invasiva, o desenvolvimento e o rompimento da barreira-formando tecidos. 8 , 9 , 10 TEER é a resistência elétrica através de uma barreira celular e, portanto, é indicativo da integridade da barreira e permeabilidade. 10 em órgãos em chips, barreiras celulares são geralmente cultivadas em uma membrana que separa dois canais fluídico, representando o apical e basolateral compartimentos de tecido essa barreira. Em tais fichas, medições de TEER podem ser convenientemente conduzidas com eletrodos inseridos as entradas e saídas dos dois canais. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 entretanto, inserção manual e reinserção dos eléctrodos podem facilmente resultar em erros de posicionamento e, portanto, variações na resistência medida como por exemplo, as diferenças na resistência dos caminhos mais longos ou mais curtos através de microcanais são significativas em comparação com a resistência de barreira de célula. 16 para eliminar erros de reinserção, dispositivos com eléctrodos integrados têm sido propostos. No entanto, a maioria destes eléctrodos integrados bloquear a vista quando inspecionando a cultura de tecido17,18,19,20,21 e/ou exigir especializados processos de salas limpas para a fabricação. 17 , 22
O dispositivo de órgão-em-microplaqueta descrito nesta publicação, foi aplicada pela primeira em uma publicação anterior,16 combina a estabilidade dos eléctrodos integrados com visibilidade sobre a camada de célula medido e fácil fabricação. O projeto e fabricação deste chip é retratada na Figura 1. Em suma, este dispositivo consiste de duas partes de polidimetilsiloxano (PDMS) com marcas de canal que são ligadas em conjunto escapamento livre com uma membrana de policarbonato com 0.4 µm poros no meio. Quatro eletrodos de fio de platina são inseridos e fixa no lugar com um photocurable adesivo bem fora da área de cultura. Todas estas etapas de fabricação podem ser conduzidas com equipamento geral de laboratório, sem a necessidade de um ambiente de sala limpa. Além disso, seis medições de impedância podem ser feitas usando esses quatro eletrodos, permitindo assim que o isolamento direto de TEER o medido, independente da resistência dos microcanais que antecederam a seção transversal e minimizando a influência de não-biológicos variações no sistema tais como (re) erros de inserção. 16
Para mostrar a aplicabilidade deste dispositivo e as medições de TEER diretas, que a barreira hemato - encefálica (BBB) foi replicada neste chip. Esta barreira biológica é composta de células endoteliais especializadas e regula o transporte entre o sangue e o cérebro para fornecer a homeostase do cérebro. 23 , 24 para imitar o BBB, o canal superior do dispositivo microfluidic foi forrado com células endoteliais microvasculares cerebrais humanas da linha celular hCMEC/D3 (gentilmente cedido pelo Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, França). 25 o método apresentado é, no entanto, mais geralmente aplicável para qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos, permitindo a determinação de TEER direta usando facilmente integrado a eletrodos.
Neste manuscrito, primeiro é descrito o processo de fabricação do dispositivo órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados. Próximo, o procedimento de semeadura e cultura de células endoteliais do cérebro dentro do dispositivo é explicado, bem como as medições de TEER no chip. Na seção de resultados, estão indicadas as medidas de TEER representativas e processamento de dados é esclarecido. Por último, a função de barreira do BBB-em-chip, monitorado durante 3 dias, é apresentada, mostrando a aplicabilidade do dispositivo apresentado e métodos para monitorar TEER.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) agente base e agente de cura: Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Fita Scotch Magic</td><td>Punção de biópsia 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, diâmetro de 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato, 0,4 &micro; tamanho de poro m</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Corte de inserções de cultura Transwell</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>fio de platina, 200 &micro; m de diâmetro</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo curável por UV: Adesivo óptico Norland 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo epóxi: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> hCMEC/D3 <td>Linha de células endoteliais microvasculares cerebrais humanas, gentilmente cedidas pelo Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, França</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasmática humana, 20 &micro; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento endotelial-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Meio basal endotelial-2 (EBM-2) suplementado com EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de rotação: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz UV, 365 nm por 5 s a 350 mW/cm2</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: Centrífuga Allegra X-12R Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>Amplificador lock-in com circuito de cabo de sonda, especializado para medições TEER no chip</td></tr></tbody></table>

fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de transendothelial

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Órgãos em chips, em vitro modelos envolvendo a cultura de tecidos (humanos), dentro de dispositivos microfluídicos, rapidamente são emergentes e promessa de fornecer úteis pesquisa ferramentas para estudar a doença e a saúde humana. Para caracterizar a função de barreira de camadas de células cultivadas dentro dispositivos de órgão-em-microplaqueta, resistência, muitas vezes transendothelial ou transepitelial elétrica (TEER) é medida. Para este fim, eletrodos são geralmente integrados o chip por micromaquinação métodos para fornecer medições mais estáveis do que é alcançado com inserção manual de eletrodos para as entradas do chip. No entanto, esses eletrodos frequentemente dificultam a inspeção visual da camada de célula estudado ou exigem cleanroom caros processos de fabricação. Para superar essas limitações, o dispositivo descrito aqui contém quatro facilmente integrados eletrodos que são colocados e fixo fora da área de cultura, possibilitando a inspeção visual. Usando esses quatro eletrodos que a resistência de seis caminhos de medição pode ser quantificada, da qual a TEER pode ser diretamente isolada, independente da resistência de microcanais cheio de meio de cultura. A barreira hemato - encefálica foi replicada neste dispositivo e seu TEER foi monitorado para mostrar a aplicabilidade do dispositivo. Esse chip, os eléctrodos integrados e o método de determinação de TEER são geralmente aplicáveis em órgãos em chips, para imitar a outros órgãos ou a ser incorporados em sistemas existentes de órgão-em-microplaqueta.

Os resultados esquemáticos da espectroscopia de impedância elétrica através de um chip sem células (linha contínua) e uma barreira celular (linha tracejada) são mostrados na Figura 2A. Podem ser identificadas quatro principais regiões, cada uma dominada por um componente elétrico específico. Abaixo de aproximadamente 1 kHz, domina a capacitância da dupla camada na interface eletrodo-cultura média, caracterizada por uma inclinação negativa para a magnitude de impedância e uma mudança de fase de aproximação-90 °. A frequência em que domina a capacitância da dupla camada, depende da área de eletrodo exposta ao meio de cultura. Planalto resistivo acima de 1 kHz (sem pilhas) ou 100 kHz (com pilhas) com uma mudança de fase, perto de 0 °, corresponde à resistência do meio de cultura dentro dos canais microfluídicos, dependendo do comprimento do canal e área da seção transversal e dentro do membrana, dependendo da porosidade e da espessura. Quando se mede através de uma barreira celular, um planalto extra resistivo entre 1 e 10 kHz é visto assim como um máximo local no diagrama de fase. Esta região é de importância crítica para a determinação da TEER como um claro aumento resultados de impedância quando as células estão presentes no caminho de medição e, portanto, são denominadas "região de interesse". A inclinação extra entre 10 e 100 kHz corresponde a capacitância de barreira de célula, que surge a partir das membranas de bicamada lipídica electricamente isolante e depende da área total da camada de células. 27 os limites das regiões, bem como as magnitudes de impedância dependem do sistema sendo estudado e mudam com, entre outras coisas, dimensões do canal, condutividade do meio de cultura, posição do eletrodo e tipo de célula. Para ler mais sobre a teoria e a prática da espectroscopia de impedância elétrica na barreira-formando tecidos, recomenda-se o artigo de revisão de Benson et al . 28
Dados representativos das medições TEER são mostrados para um chip em branco e um chip com uma camada de células endoteliais do cérebro hCMEC/D3 na Figura 2E e 2F, respectivamente. Em suma, a espectroscopia de impedância foi realizada usando seis medições com quatro eletrodos: duas medições através de canais de cheias de meio de cultura celular (linhas sólidas) e quatro medições através dos canais, bem como a membrana e - se presente - o barreira celular (linhas tracejadas). Esses caminhos de seis medição podem ser identificados no circuito resistivo equivalente da Figura 2B, que é derivado do corte transversal esquemático (Figura 2) e vista superior (Figura 2D). As medições do chip em branco (Figura 2E) mostram a forma típica de espectros de impedância sem células, conforme ilustrado na Figura 2A. As medições através da barreira celular (linhas tracejadas na Figura 2F) assemelham-se os espectros de impedância típica com células na Figura 2A. Nota que tanto a magnitude de impedância e fase de mudança de aumento para 1 MHz. Esta é a resposta típica da instalação de medição em altas frequências e não é de origem experimental.
Para determinar a TEER usando esses espectros de impedância experimental, primeiro a resistência medida microplaqueta é determinada, que é a resistência total da camada de células, canais e membrana. Para este efeito, uma frequência de leitura adequado na região de interesse foi escolhida, que é no máximo local na trama de fase com células e perto de mudança de fase de 0 ° sem células: 10 kHz. Com as seis resistências medidas de 10 kHz, medida entre os quatro eletrodos, o TEER é diretamente calculada usando a equação na Figura 2F.
Para mostrar que o dispositivo apresentado é adequado para a determinação de TEER nos órgãos em chips, o BBB foi replicado dentro do chip e seu TEER foi monitorada durante 3 dias de cultura. Na Figura 3A que média TEER ± erro padrão da média (SEM) é mostrado por quatro BBBs em chips, resultando em um platô de 22 ± Ω 1.3 cm2, que é comparável a TEER desta linha de celular, como relatado na literatura. 29 além disso, após o término do experimento e fluorescência de coloração dos núcleos, pode ser visto que o endotélio cerebral formada uma monocamada contínua dentro do dispositivo (Figura 3B). Mancha da imunofluorescência de proteína junção apertada Zonula Occludens-1 (ZO-1) mostrou que as células endoteliais do cérebro mantiveram seu fenótipo específico BBB e formaram complexos juncionais apertados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
Figura 1: Concepção e montagem do dispositivo órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados. 
(A) vista explodida do chip microfluídicos, consistindo de uma parte superior de PDMS com o canal superior (TC), uma membrana (M) e uma parte inferior parte PDMS com o canal inferior (BC). Quatro eletrodos de fio de platina (E1-4) estão inseridos e nos canais de lado. No canal superior e na parte superior da membrana, as células endoteliais do cérebro hCMEC/D3 foram cultivadas para replicar o BBB. (B) montado chip, de fixo para um prato de plástico. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
Figura 2: Dados de impedância representativa e determinação de TEER. 
(A) impedância esquemático espectro apresentando magnitude de impedância (Ω) e mudança de fase (°) versus frequência (Hz), típica para espectroscopia de impedância elétrica em chips sem células (linha contínua) e com células (linha tracejada). Existem quatro principais regiões, cada uma dominada por: a capacitância da dupla camada em eletrodos, o meio de cultura resistência, a célula barreira e a capacitância de membrana celular. A "região de interesse" indica onde a contribuição da camada de células pode ser quantificada (seta vermelha). (B) circuito resistivo equivalente do chip, mostrando o canal superior resistores R1 e R3, o fundo canal resistores R2 e R4 e a membrana e CE barreira resistor Rm. (C) esquemática seção transversal mostrando as células endoteliais (CE), cultivadas no canal superior. (D) vista superior esquemática do BBB chip mostrando a configuração dos eletrodos e da área de cultura de 0,25 mm2 , através do qual a impedância é medida. (E) espectros de impedância representativo de um chip em branco preenchido com meio de cultura celular. Espectros de impedância representativa (F) de um chip no qual hCMEC/D3 células endoteliais do cérebro foram cultura por 3 dias. (G) a fórmula para calcular TEER partir as resistências medidas entre todas as seis combinações de quatro eletrodos. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. 16 , <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver um maior vers</a>íon desta figura.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
Figura 3: Desenvolvimento de TEER representativa de BBB-em-microplaqueta. 
(A) TEER média ± erro padrão da média (SEM) de quatro BBBs em chips durante um período de cultura de três dias, atingindo um platô em 22 ± 1.3 Ω cm2 (média ± SEM). Para comparação, dados de fichas em branco estão incluídos, mostrando a variação marginal e desvio de 0 Ω cm2 no mesmo período em comparação com a variação e o valor TEER de chips com células. (B) microscopia de fluorescência de núcleos corados revelou uma monocamada contínua do endotélio, tanto no PDMS e a membrana no local indicado no baixo-relevo. (C) imunofluorescência revelou a presença de proteína de junção apertada Zonula Occludens-1, indicando que junções apertadas de BBB específicas entre as células dão origem a TEER o medido. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato - encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como fabricar e usar chips microfluídicos com eletrodos integrados para medições de resistência elétrica transendotelial ou transepitelial, ou medições TEER. Isso é demonstrado usando uma barreira hematoencefálica no chip microfluídico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de Organs-on-Chips, permitindo a medição direta da função de barreira de, por exemplo, tecido da barreira hematoencefálica usando eletrodos integrados.A principal vantagem de nossa técnica é que os eletrodos são facilmente integrados aos sistemas Organ-on-Chip e que os resultados podem ser comparados entre os diferentes sistemas. As implicações dessa tecnologia se estendem para entender a função da barreira hematoencefálica na saúde e na doença, na descoberta de medicamentos e na medicina personalizada. Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre a função da barreira hematoencefálica, ele também pode ser usado no contexto de outros sistemas Organ-on-Chip, como o Lung-on-Chip e o Gut-on-Chip.Para iniciar este procedimento, misture bem 27 gramas de agente base PDMS e 2,7 gramas de agente de cura. Em seguida, desgaseifique a mistura em um dessecador por aproximadamente 45 minutos para remover as bolhas de ar. Enquanto isso, prepare o molde para a mistura líquida de PDMS colando fita adesiva transparente ao redor do molde ou coloque o molde em um suporte de wafer adequado.Despeje a mistura PDMS desgaseificada no molde. Em seguida, cure a mistura PDMS em um forno a 60 graus Celsius por quatro horas e deixe esfriar depois. Em uma coifa de fluxo cruzado, puxe o PDMS curado do molde.Corte a réplica do PDMS em peças separadas de cavacos superior e inferior usando linhas de corte no PDMS. Em seguida, faça quatro furos nas partes superiores usando um punção de biópsia afiado com um milímetro de diâmetro para formar entradas e saídas. Perfure de dentro para fora para evitar que detritos PDMS se acumulem no chip.Em seguida, cubra as peças do chip com fita adesiva transparente para protegê-las contra poeira. Posteriormente, corte as membranas de policarbonato das inserções transwell em quadrados de aproximadamente três por três milímetros quadrados. Depois disso, monte uma membrana porosa sem vazamentos entre duas peças PDMS para montar um dispositivo de duas camadas conectado a uma membrana porosa.Para isso, prepare uma argamassa de tolueno PDMS usando 0,7 gramas de agente base PDMS, 07 gramas de agente de cura e 540 microlitros de tolueno. Vortex a argamassa completamente, em seguida, gire 200 microlitros de argamassa em uma lamínula de vidro a 1500 rpm por 60 segundos para adquirir uma camada fina e uniforme de argamassa. Em seguida, transfira uma fina camada de argamassa da lamínula para a parte inferior do chip com um rolo de tinta.Coloque a parte inferior em um prato próprio para forno e transfira a argamassa para a parte superior do chip. Com um conjunto de pinças, mergulhe as bordas de uma membrana na argamassa revestida e coloque-a cuidadosamente no meio da parte inferior. Em seguida, coloque cuidadosamente a parte superior na parte inferior, prestando atenção ao alinhamento.Cubra as entradas de cavacos com fita adesiva transparente para evitar que a poeira entre no cavaco e asse a 60 graus Celsius por três horas. Ter cuidado é muito importante nesta etapa. Não exerça pressão sobre o cavaco e não deslize a parte superior sobre a parte inferior, para evitar que a argamassa entre nos canais e obstrua a membrana.Para integrar eletrodos nos canais laterais, corte um fio de platina em pedaços de dois centímetros de comprimento. Em seguida, mergulhe-os em acetona por 30 minutos. Em seguida, enxágue-os com água e etanol e deixe-os secar.Em um capô de fluxo cruzado, coloque um chip em um prato de plástico. Insira quatro fios de platina nos canais de eletrodo do chip usando uma pinça e dobre-os no prato de plástico para permitir a fixação no prato na próxima etapa. Insira os fios de 0,7 a um milímetro no canal de cultura após a junção do canal em forma de T.Em seguida, aplique uma gota de cola curável por UV na entrada do canal do eletrodo e deixe a cola preencher o canal por forças capilares. Em seguida, ligue o UV e cure a cola quando ela atingir o final do canal do eletrodo. Fixou os quatro eletrodos integrados ao prato de plástico com um adesivo epóxi de dois componentes.Em seguida, cubra as batatas fritas com fita adesiva transparente e leve ao forno a 60 graus Celsius por duas horas. Deixe-os esfriar e guarde-os sem poeira até o uso. Para revestir os chips para promover a fixação celular, primeiro preencha ambos os canais com PBS antes de introduzir reagentes.Verifique ao microscópio se há bolhas de ar nos canais. Em caso afirmativo, remova-os lavando com PBS extra. Em seguida, preencha ambos os canais com 30 microlitros de 20 microgramas por mililitro de fibronectina humana em PBS.Incube-os a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, lave os chips com meio de crescimento endotelial e incuba-os a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, meça o TEER dos cavacos em branco para garantir que todos os eletrodos estejam em contato direto com o fluido nos canais.Para isso, retire um chip da incubadora e deixe-o atingir a temperatura ambiente por pelo menos dez minutos. Remova qualquer fluido do prato de plástico ao redor dos eletrodos para evitar a ponte elétrica fora do chip. Em seguida, leve o espectro de impedância de 200 hertz a um megahertz para cada combinação de dois eletrodos, resultando em seis espectros de impedância por chip em cinco a dez minutos, a partir dos quais o TEER pode ser determinado diretamente.Verifique se os espectros de impedância têm as magnitudes e formas esperadas para validar a medição TEER. Agora, prepare uma suspensão celular para ser assentada no canal superior, removendo o meio de cultura de um frasco de cultura com monocamada confluente de células hcMEC / D3. Depois disso, lave as células com PBS.Remova o PBS e, em seguida, adicione dois mililitros de 05 por cento de tripsina EDTA e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos até que as células se desprendam do frasco de cultura. Em seguida, desative a tripsina com meio de cultura suplementado com 20% de FBS. Conte as células e calcule seu número total em suspensão.Enquanto isso, centrifugue as células hcMEC / D3 a 390 vezes g por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume apropriado de meio de crescimento endotelial para resultar em uma concentração de cinco milhões de células por mililitro, correspondendo a uma densidade de semeadura de 200 mil células por centímetro quadrado no chip. Em seguida, pipete lentamente 30 microlitros da suspensão de células bem misturadas no canal superior e remova a pipeta da entrada em um movimento fluente enquanto ainda exerce pressão.Verifique a densidade de semeadura ao microscópio. Uma distribuição uniforme de células em todo o canal superior deve ser alcançada. Em seguida, incube os chips a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.Depois, lave todas as células não anexadas com meio de cultura endotelial. Lembre-se de que o TEER é monitorado durante o período de cultura. Estes são o espectro de impedância esquemática típico que mostra a magnitude da impedância e a mudança de fase versus frequência para espectroscopia de impedância elétrica em chips sem células e com células.Existem quatro regiões principais que são dominadas pela capacitância de camada dupla nos eletrodos, a resistência do meio de cultura, a resistência da barreira celular ou a capacitância da membrana celular. A região de interesse indica onde a contribuição da camada celular pode ser quantificada. E esta é a fórmula para calcular o TEER a partir das resistências medidas entre todas as seis combinações de quatro eletrodos.Aqui é mostrado o TEER médio de quatro BBBs em chips durante o período de cultura de três dias, atingindo um platô de 22 mais ou menos 1,3 ohm centímetro quadrado. Para comparação, os dados de chips em branco são incluídos, mostrando variação marginal e desvio de zero ohm centímetro quadrado no mesmo período em comparação com a variação no valor TEER de chips com células. A microcópia de fluorescência dos núcleos corados revelou uma monocamada contínua de endotélio tanto no PDMS quanto na membrana no local indicado na inserção.A imunofluorescência revelou a presença da proteína de junção apertada zonula occludens um, indicando que junções apertadas específicas de BBB entre as células dão origem ao TEER medido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da fabricação e uso de chips com eletrodos integrados para medições TEER em Organs-on-Chips. Esta técnica pode ser usada no campo da pesquisa da barreira hematoencefálica para estudar a entrega direta e as características da doença, por exemplo, na doença de Alzheimer.Após este procedimento, a função de barreira do endotélio cerebral diferenciada das células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de humanos também pode ser monitorada para aplicações em medicina personalizada.

fabrication-validation-an-organ-on-chip-system-with-integrated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resistência elétrica transendotelial (TEER) em células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongos in vitro. Um valor TEER alto indica junções de células endoteliais intactas, enquanto a adição de células T ativadas reduz o valor TEER, refletindo a ruptura da barreira juncional.

Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar um dispositivo microfluídico exclusivo de duas camadas para estudar a regulação eletromecânica da homeostase do tecido epitelial. O dispositivo aplica correntes elétricas fisiológicas estáticas perpendiculares ao plano do tecido, impactando a adesão, proliferação e extrusão célula-célula. Imagens de células vivas e medições de estresse mecânico revelam mecanismos desses processos.

Revelando o controle eletromecânico da homeostase tecidual usando um dispositivo microfluídico de duas camadas

Aprenda a fabricar dispositivos de órgãos-em-microplaqueta com eletrodos integrados para medir diretamente a resistência elétrica transendotelial em modelos da barreira hematoencefálica.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial (Vídeo) | JoVE Journal

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Explorar mais vídeos