Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como fabricar e usar chips microfluídicos com eletrodos integrados para medições de resistência elétrica transendotelial ou transepitelial, ou medições TEER. Isso é demonstrado usando uma barreira hematoencefálica no chip microfluídico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de Organs-on-Chips, permitindo a medição direta da função de barreira de, por exemplo, tecido da barreira hematoencefálica usando eletrodos integrados.

A principal vantagem de nossa técnica é que os eletrodos são facilmente integrados aos sistemas Organ-on-Chip e que os resultados podem ser comparados entre os diferentes sistemas. As implicações dessa tecnologia se estendem para entender a função da barreira hematoencefálica na saúde e na doença, na descoberta de medicamentos e na medicina personalizada. Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre a função da barreira hematoencefálica, ele também pode ser usado no contexto de outros sistemas Organ-on-Chip, como o Lung-on-Chip e o Gut-on-Chip.

Para iniciar este procedimento, misture bem 27 gramas de agente base PDMS e 2,7 gramas de agente de cura. Em seguida, desgaseifique a mistura em um dessecador por aproximadamente 45 minutos para remover as bolhas de ar. Enquanto isso, prepare o molde para a mistura líquida de PDMS colando fita adesiva transparente ao redor do molde ou coloque o molde em um suporte de wafer adequado.

Despeje a mistura PDMS desgaseificada no molde. Em seguida, cure a mistura PDMS em um forno a 60 graus Celsius por quatro horas e deixe esfriar depois. Em uma coifa de fluxo cruzado, puxe o PDMS curado do molde.

Corte a réplica do PDMS em peças separadas de cavacos superior e inferior usando linhas de corte no PDMS. Em seguida, faça quatro furos nas partes superiores usando um punção de biópsia afiado com um milímetro de diâmetro para formar entradas e saídas. Perfure de dentro para fora para evitar que detritos PDMS se acumulem no chip.

Em seguida, cubra as peças do chip com fita adesiva transparente para protegê-las contra poeira. Posteriormente, corte as membranas de policarbonato das inserções transwell em quadrados de aproximadamente três por três milímetros quadrados. Depois disso, monte uma membrana porosa sem vazamentos entre duas peças PDMS para montar um dispositivo de duas camadas conectado a uma membrana porosa.

Para isso, prepare uma argamassa de tolueno PDMS usando 0,7 gramas de agente base PDMS, 07 gramas de agente de cura e 540 microlitros de tolueno. Vortex a argamassa completamente, em seguida, gire 200 microlitros de argamassa em uma lamínula de vidro a 1500 rpm por 60 segundos para adquirir uma camada fina e uniforme de argamassa. Em seguida, transfira uma fina camada de argamassa da lamínula para a parte inferior do chip com um rolo de tinta.

Coloque a parte inferior em um prato próprio para forno e transfira a argamassa para a parte superior do chip. Com um conjunto de pinças, mergulhe as bordas de uma membrana na argamassa revestida e coloque-a cuidadosamente no meio da parte inferior. Em seguida, coloque cuidadosamente a parte superior na parte inferior, prestando atenção ao alinhamento.

Cubra as entradas de cavacos com fita adesiva transparente para evitar que a poeira entre no cavaco e asse a 60 graus Celsius por três horas. Ter cuidado é muito importante nesta etapa. Não exerça pressão sobre o cavaco e não deslize a parte superior sobre a parte inferior, para evitar que a argamassa entre nos canais e obstrua a membrana.

Para integrar eletrodos nos canais laterais, corte um fio de platina em pedaços de dois centímetros de comprimento. Em seguida, mergulhe-os em acetona por 30 minutos. Em seguida, enxágue-os com água e etanol e deixe-os secar.

Em um capô de fluxo cruzado, coloque um chip em um prato de plástico. Insira quatro fios de platina nos canais de eletrodo do chip usando uma pinça e dobre-os no prato de plástico para permitir a fixação no prato na próxima etapa. Insira os fios de 0,7 a um milímetro no canal de cultura após a junção do canal em forma de T.

Em seguida, aplique uma gota de cola curável por UV na entrada do canal do eletrodo e deixe a cola preencher o canal por forças capilares. Em seguida, ligue o UV e cure a cola quando ela atingir o final do canal do eletrodo. Fixou os quatro eletrodos integrados ao prato de plástico com um adesivo epóxi de dois componentes.

Em seguida, cubra as batatas fritas com fita adesiva transparente e leve ao forno a 60 graus Celsius por duas horas. Deixe-os esfriar e guarde-os sem poeira até o uso. Para revestir os chips para promover a fixação celular, primeiro preencha ambos os canais com PBS antes de introduzir reagentes.

Verifique ao microscópio se há bolhas de ar nos canais. Em caso afirmativo, remova-os lavando com PBS extra. Em seguida, preencha ambos os canais com 30 microlitros de 20 microgramas por mililitro de fibronectina humana em PBS.

Incube-os a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, lave os chips com meio de crescimento endotelial e incuba-os a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, meça o TEER dos cavacos em branco para garantir que todos os eletrodos estejam em contato direto com o fluido nos canais.

Para isso, retire um chip da incubadora e deixe-o atingir a temperatura ambiente por pelo menos dez minutos. Remova qualquer fluido do prato de plástico ao redor dos eletrodos para evitar a ponte elétrica fora do chip. Em seguida, leve o espectro de impedância de 200 hertz a um megahertz para cada combinação de dois eletrodos, resultando em seis espectros de impedância por chip em cinco a dez minutos, a partir dos quais o TEER pode ser determinado diretamente.

Verifique se os espectros de impedância têm as magnitudes e formas esperadas para validar a medição TEER. Agora, prepare uma suspensão celular para ser assentada no canal superior, removendo o meio de cultura de um frasco de cultura com monocamada confluente de células hcMEC / D3. Depois disso, lave as células com PBS.

Remova o PBS e, em seguida, adicione dois mililitros de 05 por cento de tripsina EDTA e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos até que as células se desprendam do frasco de cultura. Em seguida, desative a tripsina com meio de cultura suplementado com 20% de FBS. Conte as células e calcule seu número total em suspensão.

Enquanto isso, centrifugue as células hcMEC / D3 a 390 vezes g por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume apropriado de meio de crescimento endotelial para resultar em uma concentração de cinco milhões de células por mililitro, correspondendo a uma densidade de semeadura de 200 mil células por centímetro quadrado no chip. Em seguida, pipete lentamente 30 microlitros da suspensão de células bem misturadas no canal superior e remova a pipeta da entrada em um movimento fluente enquanto ainda exerce pressão.

Verifique a densidade de semeadura ao microscópio. Uma distribuição uniforme de células em todo o canal superior deve ser alcançada. Em seguida, incube os chips a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.

Depois, lave todas as células não anexadas com meio de cultura endotelial. Lembre-se de que o TEER é monitorado durante o período de cultura. Estes são o espectro de impedância esquemática típico que mostra a magnitude da impedância e a mudança de fase versus frequência para espectroscopia de impedância elétrica em chips sem células e com células.

Existem quatro regiões principais que são dominadas pela capacitância de camada dupla nos eletrodos, a resistência do meio de cultura, a resistência da barreira celular ou a capacitância da membrana celular. A região de interesse indica onde a contribuição da camada celular pode ser quantificada. E esta é a fórmula para calcular o TEER a partir das resistências medidas entre todas as seis combinações de quatro eletrodos.

Aqui é mostrado o TEER médio de quatro BBBs em chips durante o período de cultura de três dias, atingindo um platô de 22 mais ou menos 1,3 ohm centímetro quadrado. Para comparação, os dados de chips em branco são incluídos, mostrando variação marginal e desvio de zero ohm centímetro quadrado no mesmo período em comparação com a variação no valor TEER de chips com células. A microcópia de fluorescência dos núcleos corados revelou uma monocamada contínua de endotélio tanto no PDMS quanto na membrana no local indicado na inserção.

A imunofluorescência revelou a presença da proteína de junção apertada zonula occludens um, indicando que junções apertadas específicas de BBB entre as células dão origem ao TEER medido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da fabricação e uso de chips com eletrodos integrados para medições TEER em Organs-on-Chips. Esta técnica pode ser usada no campo da pesquisa da barreira hematoencefálica para estudar a entrega direta e as características da doença, por exemplo, na doença de Alzheimer.

Após este procedimento, a função de barreira do endotélio cerebral diferenciada das células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de humanos também pode ser monitorada para aplicações em medicina personalizada.