Name: Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a comparar ensaios de migração e invasão celular usando câmara de Boyden e ensaio de ferida com microscopia em vídeo. Este método otimizado oferece resultados reproduzíveis para pesquisas em biologia celular.

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Estas técnicas foram desenvolvidas com o apoio do LabEx PRIMES (ANR-11-LABX-0063), o plano Contrat-Etat-região (CPER) no âmbito científico da ETOILE (CPER 2009-2013) e lírica Grant INCa-DGOS-4664.

Nota: Os ensaios de câmara e zero de Boyden sem inclusão de ECM são referidos como o ensaio de migração, e os ensaios mesmos com o ECM é referido como o ensaio de invasão.
1. Boyden câmara de ensaio
Nota: Este protocolo é adaptado para a linha de celular SQ20B, que é derivada de um câncer de laringe recorrente de cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas (HNSCC) e foi obtida por John Little (Boston, MA, USA).
Dia 1
<ol><li>
Célula de semeadura
	<ol>
<li>Semente 10 26 SQ20B células em 12 mL de meio de cultura (CM) em um balão de2 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.<ol>
<li>Para preparar CM para as células SQ20B, suplemento meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com solução salina tampão fosfato (PBS) e adicionar 2,5 mL de ácido de tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,5 g/L). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C e em seguida, pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.</li>
		<li>As sementes das células em balão de2 25 cm, com uma densidade de células de 10 6 células de5 para cada condição a ser avaliada. Incube as celulas por 24h em 3 mL de CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 2
<ol start="2"><li>
Fome de célula e preparação das câmaras revestidas
	<ol>
<li>Morrer de fome as células, substituindo o meio em cada frasco com 3 mL de meio de soro bovino fetal-baixo (FBS) usando 0.1% albumina de soro bovino (BSA) em vez de FBS. Morrer de fome as células por 24 h na incubadora.<ol>
<li>Para preparar a fome CM (s-CM), suplemento DMEM com 0,1% BSA, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para o ensaio de migração, vá para a etapa 1.3.</li>
		<li>Para o ensaio de invasão, 12h antes do dia 3, prepare as câmaras revestidas de Boyden adicionando 500 μL de s-CM para cada câmara revestida. Usar comercialmente preparadas câmaras revestidas de Boyden e mantê-los em 4 ° C antes do uso. Coloque cada câmara Boyden na placa companheiro e defini-la em incubação a 37 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 3
<ol start="3"><li>
Célula semear na câmara Boyden
	<ol>
<li>Utilize a placa de companheiro para preparar o quimiotático. Encha cada um bem da placa 24-bem companheiro com 750 µ l de meio completo com 10% FBS, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.<ol>
<li>Adapte o quimiotático para cada linha de célula e de cada condição de tratamento. Para preparar o quimiotático CM (ca-CM), suplemento DMEM com 10% FCS, hidrocortisona 0,4 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferi a câmara superior para a placa de companheiro pré-carregadas, tendo o cuidado de evitar bolhas.</li>
		<li>Para o ensaio de invasão, Retire cuidadosamente 450 μL de CM de cada câmara de Boyden.</li>
		<li>Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 0,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e em seguida Incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.</li>
		<li>Semente 10 34 SQ20B células em 500 μL de médio de 0,1% BSA, dando uma diluição final de 6 104 células/mL. Nota: A concentração de células deve ser adaptada para cada linha de celular.</li>
		<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 4
<ol start="4"><li>
Fixação da pilha e coloração
	<ol>
<li>Conserte as células antes que o tempo de duplicação específico para essa linha de celular. Fix SQ20B células antes de 24 h.</li>
		<li>Remova cada inserção da placa de companheiro e cuidadosamente, remover as células da câmara superior usando um cotonete. É particularmente importante remover todas as células localizadas na câmara alta.</li>
		<li>Correção e mancha cada inserem individualmente para obter maio-Grunwald Giemsa coloração9 usando o kit de coloração fornecido. Como alternativa, use paraformaldeído 4% em outro prato de companheiro para uma fixação de 30 min.</li>
		<li>Manter as inserções em um prato vazio 24-bem companheiro sob uma capa de laboratório para secar cada câmara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 5
<ol start="5"><li>
Análise microscópica
	<ol>
<li>Insira a placa de companheiro com as inserções em um microscópio de contraste de fase 20 e contar cada célula migrada na parte inferior da membrana. Otimizar a posição do foco certo movendo o objectivo do fundo ao topo e parar a posição na parte inferior da membrana.</li>
		<li>Calcule a relação entre os números de células migradas e semeado de células. Repita cada contagem para cada condição de tratamento em triplicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. risque ferida ensaio: Migração de células
Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.
Dia 1
<ol><li>
Célula de semeadura
	<ol>
<li>Semente de 2 x 106 SQ20B células em 12 mL de CM em um balão de2 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.</li>
		<li>Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 2,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.</li>
		<li>Gere uma amostra pré-diluído em uma densidade de célula de 4 x 105/mL, dando uma densidade final de 10 4 células de4 por 100 μL de cada poço. Esta concentração deve ser adaptada para cada linha de celular e deve estar no intervalo de 1 x 104 6 104 células.</li>
		<li>Células de semente em cada cavidade de uma placa de 96 poços por depositar 100 μL de solução preparada na etapa 2.1.2.</li>
		<li>Deixe a placa à temperatura ambiente por 5 min dispersar as células uniformemente no fundo dos poços.</li>
		<li>Colocar a placa para a incubadora e permitir que as células aderir à placa para 12 a 16 h (máximo) a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 2
<ol start="2"><li>
Coçar a ferida do ensaio
	<ol>
<li>Retire as placas preparadas na etapa 2.1 da incubadora.</li>
		<li>Sob o capô, fazer uma ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.</li>
		<li>Lave as células duas vezes, repetindo a aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C para cada poço.</li>
		<li>Remova o CM com uma pipeta com uma ponta cónica adaptada após as etapas de lavagem.</li>
		<li>Adicione 100 μL de meio específico para cada condição de tratamento para cada poço.</li>
		<li>Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.</li>
		<li>Coloque a placa dentro do rack adaptado do vídeo microscópio.</li>
		<li>Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.</li>
		<li>Programa a agenda de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por bem. Um intervalo máximo de 2-h é necessário para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.</li>
		<li>No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dias 3, 4 e 5
<ol start="3"><li>
Análise de migração usando o vídeo microscópio
	<ol>
<li>Por um período mínimo de 24 h e até 5 dias, monitorar e verificar a migração celular.</li>
		<li>Use uma máscara de célula apropriada adaptada para cada tipo de célula para analisar a migração celular. Para obter uma máscara de célula adaptada para cada linhagem celular, gere uma célula processamento definição do software usando uma coleção de imagens de célula específica.</li>
		<li>Traçar as curvas e exportar os dados para uma planilha, o que pode ser usada para analisar e comparar os resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. risque ferida ensaio: Invasão de célula
Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.
Dia 1
<ol><li>
Célula de semeadura
	<ol>
<li>Use o mesmo protocolo para semeadura de células conforme descrito no passo 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 2
<ol start="2"><li>
Preparando o ECM
	<ol>
<li>Descongelar a matriz para pelo menos 12 h antes de usar a 4 ° C. Certifique-se que os agregados não são visíveis. Se agregados são visíveis, manter a matriz a 4 ° C por um período mais longo, até que desapareçam os agregados. Manter a matriz no gelo. Utilize pontas de pipetas pré-resfriada. Nota: A matriz solidify se não manteve a 4 ° C.</li>
		<li>Relaxa os tubos microcentrifuga no gelo por 5 min.</li>
		<li>CM do refrigerador de refrigeração a 4 ° C e diluir a matriz nos microcentrifuga pré-resfriado tubos para obter uma concentração final de 300 μg/mL.</li>
		<li>Retornar os tubos microcentrifuga com matriz pré-diluído na geladeira a 4 ° C. Nota: Uma grade adaptada para tubos microcentrifuga é útil para manter os tubos em 4° C, durante todo o experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dia 2
<ol start="3"><li>
Coçar a ferida ensaio e tratamento de ECM
	<ol>
<li>Remova a placa preparada na etapa 3.1 da incubadora.</li>
		<li>Sob o capô, certifique-se da ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.</li>
		<li>Lavar as células duas vezes, repetindo o procedimento de aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C.</li>
		<li>Após a segunda lavagem, coloque a placa sobre a incubadora de 4 ° C para equilibrar a sua temperatura por 5 min.</li>
		<li>Remova o meio frio de cada poço com a pipeta de aspiração com uma ponta cónica, cuidando para pipetar cuidadosamente da borda e evite tocar a ferida.</li>
		<li>Adicionar 50 μL de matriz pré-diluído a cada poço usando pontas cônicas pré-resfriado a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 30 min. Nota: Um rack de apoio escaldadas a 37 ° C é útil para acelerar o aquecimento da placa de 96 poços.</li>
		<li>Retirar a placa da incubadora e adicione 100 μL do CM adaptada a cada poço conforme indicado para cada condição de tratamento.</li>
		<li>Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.</li>
		<li>Coloque a placa dentro do rack adaptado no vídeo microscópio.</li>
		<li>Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.</li>
		<li>Programe o horário de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por alvéolo, no modo de varredura de coçar a ferida. Um intervalo máximo de 2-h em necessários para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.</li>
		<li>No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dias 3, 4 e 5
<ol start="4"><li>
Análise de invasão de pilha usando um microscópio de vídeo.
	<ol>
<li>Repita a etapa 2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nós relatamos aqui duas modalidades diferentes para estudar o processo de migração e invasão celular. A análise deste processo é importante para a compreensão dos factores envolvidos na recorrência metastática, que pode ser explicada pelo aumento da mobilidade de uma subpopulação de células de câncer chamado câncer células-tronco10,11.
O experimento de câmara de Boyden é uma o mais frequentemente usado invasão e migração de células de ...

Migração e invasão celular estão envolvidas na disseminação das células cancerosas, que é a causa principal da resistência ao tratamento1 e podem levar a locorregional ou metastática recorrência após tratamento de câncer2. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é o processo inicial de invasão-migração celular no qual câncer células alternar de um epitélio para um fenótipo mesenquimal. E-caderina é um marcador extracelular do fenótipo epiteliais3e expressão aumentada de N-caderina e vimentina é característica do fenótipo mesenquimais4. Migração também depende da capacidade intrínseca das células cancerosas invadir a matriz extracelular (ECM) através da ação das metaloproteases de matriz5.
Esse mecanismo de invasão – migração tem sido descrito por câncer em muitos locais, particularmente no câncer de cabeça e pescoço6. Muitos pesquisadores têm incidido sobre os processos de migração e invasão de entender melhor como as células cancerosas se disseminar na esperança de que esse conhecimento vai levar a novas estratégias de tratamento. É fundamental que estes estudos são realizados utilizando ensaios confiáveis e reproduzíveis.
Análise in vitro da motilidade celular pode ser um desafio. O ensaio de câmara Boyden desenvolveu há muitos anos, é considerado para ser o padrão para análise de invasão – migração7. No entanto, é demorado e muitas vezes é impreciso. Um segundo teste é a cicatrização da ferida ensaio8, que envolve fazer um arranhão em uma cultura celular de monocamadas e captura de imagens da invasão celular e migração em intervalos de tempo fixo. Esta técnica tem sido criticada extensamente por causa das grandes variações entre os resultados de dois testes sucessivos. No entanto, a aplicação de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, melhorou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Microscópios de vídeo podem ser facilmente introduzidos em incubadoras e podem gerar imagens em tempo real de migração celular. Estes dispositivos gravar dados microscópicos e fornecem análise automática de confluência de célula ferida ao longo do tempo. O objetivo deste trabalho é descrever o ensaio de câmara Boyden e o ensaio da ferida zero otimizada e discutir as vantagens e fraquezas de cada abordagem.

<table><tbody><tr><td>Soro de bezerro fetal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona solúvel em água</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>A solução deve ser preparada imediatamente antes do uso porque é muito instável</td></tr><tr><td>Partícula Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Linha celular CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Presente do John Little ' s Fabricante</td> <td>de</td><td></td> Feridas</tr> de <tr><td>Laboratório</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Armazene em local seguro e seco</td></tr><tr><td>Placa ImageLock de 96 poços</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>Sistema CoolBox 96F com CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox com Sistema M30</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>BoydenDominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Inserto Revestido</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>Loja a -20 &deg; Placa C</td></tr><tr><td>Companion de 24 poços</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel padrão</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Armazene a -20&deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Coloração RAL 555</td><td>RAL Diagnostics</td><td>&nbsp; 361550</td><td>Armazenar em local seguro e seco</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara boyden

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

A capacidade de invasão e migração de células tumorais é principais contribuintes para a progressão do câncer e recorrência. Muitos estudos têm explorado as capacidades de migração e invasão de entender como as células cancerosas se disseminar, com o objectivo de desenvolver novas estratégias de tratamento. Análise das bases celulares e moleculares destas habilidades levou para a caracterização da mobilidade celular e as propriedades físico-químicas do citoesqueleto e microambiente celular. Por muitos anos, o ensaio de câmara Boyden e o risco de ferimento ensaio foram as técnicas padrão para estudar a migração e invasão celular. No entanto, estas duas técnicas têm limitações. O ensaio de câmara Boyden é difícil e demorado, e o ensaio da ferida zero tem baixa reprodutibilidade. Desenvolvimento de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, aumentou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Utilizando sistemas de análise poderosas, um microscópio de vídeo de "no-incubadora" pode ser usado para fornecer análise automática e em tempo real de migração celular e invasão. O objetivo deste trabalho é relatar e comparar os dois ensaios utilizados para estudar a migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e um otimizado em vitro vídeo microscópio com base em zero do ensaio de ferida.

Nós relatamos aqui dois métodos diferentes para analisar a migração e invasão celular. A Figura 1 mostra a Boyden experimento de câmara. As inserções são colocadas em uma placa de companheiro com quimiotático médio, e as células são semeadas em CM. A membrana pode ser sem revestimento (ensaio de migração) ou revestido (teste de invasão). As células são semeadas na câmara superior em s-CM. A câmara baixa é preenchida com CM como um quimiotático. As células são...

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

O objetivo geral deste experimento é relatar e comparar os dois ensaios usados para estudar a invasão e migração celular, o ensaio de câmara de Boyden e um ensaio otimizado de microscopia de vídeo in vitro baseado em microscópico. Esses experimentos podem ajudar a responder a questões-chave no campo de estudo de invasão e migração, como a escolha do método mais relevante. A principal vantagem deste ensaio otimizado de microscopia de vídeo in vitro baseado em arranhões é que ele fornece uma comparação reprodutível e precisa entre as condições de tratamento.Embora esse método possa avaliar a migração e invasão celular, ele também pode ser aplicado a outros campos de estudo, como cicatrização ou regeneração de tecidos. Prepare as células SQ20B 72 horas antes do primeiro dia do ensaio, semeando duas vezes 10 elevado a 1/6 de células em 25 mililitros de meio de cultura em um frasco de 175 centímetros quadrados. Permita que as células cresçam até 80% de confluência celular a 37 graus Celsius.No primeiro dia após a tripsinização e a contagem de células, semeie as células em um frasco de 25 centímetros quadrados com uma densidade celular de seis vezes 10 elevado a 1/5 de células em três mi

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.

Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

Aprenda a comparar ensaios de migração e invasão celular usando câmara de Boyden e ensaio de ferida com microscopia em vídeo. Este método otimizado oferece resultados reproduzíveis para pesquisas em biologia celular.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

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