Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

O objetivo geral desses procedimentos de feridas artificiais de cultura de células epiteliais é estudar a migração celular de uma perspectiva quantitativa e qualitativa, permitindo a avaliação dos efeitos de tratamentos específicos de interesse na cicatrização de feridas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cicatrização de feridas, pois permite a caracterização precisa dos papéis de processos de migração específicos durante a ruptura epitelial. A principal vantagem dessa abordagem é que ela permite a correlação de medidas migratórias celulares com mudanças no comportamento de marcadores moleculares relevantes.

A implicação dessas técnicas se estende para uma terapia de feridas clínicas, pois oferece uma configuração conveniente para testes precoces de drogas e para o fechamento de feridas. Geralmente, este método começará devido a dificuldades em obter uma reprodutibilidade consistente nas feridas com uma geração. Para um ensaio de arranhão de ferida artificial, comece semeando cada poço de uma placa de cultura com dois mililitros de células epiteliais de interesse em meio completo.

Cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por dois a três dias até 100% de confluência. Quando as células estiverem prontas, lave-as duas vezes com meio fresco sem soro, seguido de 24 horas de cultura em meio fresco sem soro. No dia seguinte, coloque a placa em uma área de trabalho estéril e arraste a extremidade estreita de uma ponta de micropipeta estéril pelo fundo de cada poço duas vezes para gerar uma ferida em forma de cruz.

Uma lacuna consistente da ferida é alcançada aplicando pressão constante e firme enquanto move suavemente a ponta ao longo da superfície epitelial. A pressão excessiva deforma a ponta, causando um raio irregular da ferida. Remova suavemente o sobrenadante para descartar as células destacadas e adicione cuidadosamente meio fresco sem soro aos poços.

Usando um microscópio de contraste de fase invertida conectado a uma câmera de dispositivo de carga acoplada, alinhe a borda do campo do microscópio com a interseção adjacente dos arranhões para obter até quatro imagens de referência de pré-tratamento da lacuna de arranhões em cada poço. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, substitua o meio nos alvéolos de tratamento designados por meio fresco, complementado com tratamentos selecionados de interesse e devolva as placas à incubadora de cultura de células. Quando pelo menos uma condição atingir cerca de 90% de fechamento da lacuna de arranhões, substitua suavemente o sobrenadante por um mililitro de formalina a quatro por cento em PBS por uma incubação de 15 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave suavemente as células com PBS pelo menos três vezes para remover qualquer excesso de formalina e obter imagens dos poços como acabamos de demonstrar, usando os mesmos parâmetros de imagem nas áreas de referência originais capturadas após a coceira. Para analisar as imagens usando o software de processamento de imagem apropriado, abra a imagem gravada de pré-tratamento de interesse e, no menu Imagem, defina o tipo de imagem como 8 bits. No menu Processo, selecione o submenu Filtros e aplique Filtragem de variação.

No menu Imagem, abra o submenu Ajustar e defina o Limite para preto e branco. No menu Processo, selecione o submenu Binário e aplique Preencher furos. No menu Analisar, selecione Definir medidas e ative Área.

Em seguida, desenhe a área mensurável, seguindo o contorno da borda migratória para delimitar a lacuna. No menu Analisar, selecione Analisar partículas e registre os valores da área total para a superfície da área desenhada. Para quantificar a migração absoluta para cada conjunto de amostras individuais como a diferença entre as medições da superfície da lacuna, exporte os valores da área total da superfície da lacuna pré e pós-tratamento para uma planilha e plote os resultados da quantificação.

Para um ensaio frontal de migração artificial, sob condições estéreis, adicione uma camada de até 33 lamínulas redondas esterilizadas em placas de cultura vazias de 10 centímetros. Quando a superfície da placa estiver completamente coberta, semeie suavemente as células epiteliais de interesse em uma concentração que permita 100% de confluência após dois ou três dias de cultivo. Se necessário, pressione suavemente as lamelas com uma ponta de micropipeta estéril para evitar flutuação.

Quando as células atingirem a confluência, substituir o sobrenadante por meio isento de soro durante mais 24 horas de cultura. Em seguida, use pinças estéreis para transferir cuidadosamente uma lamínula para uma nova placa de 10 centímetros contendo meio fresco sem soro, tomando cuidado para segurar a lamínula ao longo de sua periferia. Para criar as feridas artificiais, arraste uma lâmina de barbear esterilizada para frente e para trás em cada lamínula para fazer uma linha transversal de três a quatro milímetros sobre o centro de cada cultura de células para remover completamente a tira central de monocamada.

Tome cuidado para colocar o fio da lâmina de barbear fortemente na superfície da lamínula ao fazer a ferida para proteger contra um formato irregular da borda e a geração de porções epiteliais caídas. Transfira até quatro lamínulas enroladas, com a célula para cima, em poços individuais de uma placa de seis poços, contendo pelo menos dois mililitros de meio sem soro e lave suavemente cada poço duas vezes com meio fresco sem soro para remover quaisquer células destacadas. Quando todas as células destacadas tiverem sido descartadas, substitua suavemente o meio de lavagem por meio fresco suplementado com os tratamentos de interesse e coloque a placa na incubadora de cultura de células.

No final do período experimental apropriado, fixe as células com quatro por cento de formalina em PBS, conforme demonstrado, e comente as células com os anticorpos conjugados fluorescentes apropriados de interesse. Em seguida, imagine as mudanças estruturais que ocorrem na borda frontal migratória por microscopia de fluorescência de acordo com os parâmetros experimentais de interesse. Neste experimento, as lacunas da ferida foram medidas antes e após o tratamento com fator de crescimento epidérmico, um conhecido indutor da proliferação e migração de células epiteliais.

A migração absoluta foi então calculada como a diferença entre as áreas de superfície de lacuna pré e pós-tratamento. O tratamento com fator de crescimento epidérmico potencializa a dinâmica do citoesqueleto celular, conforme observado nessas imagens de microscopia de varredura a laser da coloração com F-Actina de células estimuladas por controle e fator de crescimento. Além disso, a superexpressão de c-Jun é observada com um aumento da expressão da proteína aparente nas células adjacentes à frente migratória.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a integridade das bordas da ferida quanto à presença de retalhos de células epiteliais que possam interromper a quantificação da migração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar quantitativa e qualitativamente o comportamento migratório do