Síntese de Core-shell Lanthanide dopados com nanocristais de Upconversion para aplicativos de celulares

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanocristais de conversão ascendente dopados com lantanídeos de casca de núcleo com base em uma abordagem de coprecipitação de alta temperatura e realizar modificações de superfície biocompatíveis que permitam outras aplicações celulares. Nos últimos anos, nosso laboratório desenvolveu uma conversão ascendente dopada com lantanídeos muito original de nanocristais, que indicou propriedades ópticas muito únicas, de modo que pode absorver luz infravermelha de comprimento de onda longo e basicamente converter essa luz em emissões multicoloridas em curto comprimento de onda, incluindo UV visível até mesmo para as janelas de luz infravermelha. Essas estruturas nanocristalinas exclusivas indicaram propriedades muito promissoras para aplicações biomédicas.

Este método fornece uma abordagem viável para sintetizar nanoestruturas de conversão ascendente núcleo-casca e sua técnica de modificação de superfície biocompatível para regulação de proteínas do canal de membrana de porta de luz após iluminação de luz infravermelha próxima. Para iniciar o procedimento, preparar soluções de reserva dos complexos de acetato de terras raras em metanol. Preparar 20 miligramas por mililitro de soluções de hidróxido de sódio e fluoreto de amónio em metanol.

Armazene as soluções de estoque a quatro graus Celsius. Em seguida, pipetar três mililitros de ácido oleico e sete mililitros de 1-octadeceno para um balão de 50 mililitros, três gargalos e fundo redondo. Adicione a isso, 1,089 mililitros da solução de acetato de ítrio, 0,608 mililitros da solução de acetato de itérbio, 83,6 microlitros da solução de acetato de túlio e 128,5 microlitros da solução de acetato de neodímio.

Equipar o balão com uma barra de agitação e um termómetro. Aqueça o frasco a 100 graus Celsius em banho de óleo, mexendo até que o metanol tenha evaporado. Em seguida, conecte o frasco a uma linha de Schlenk e bombeie o frasco por dois a três minutos para remover o metanol residual.

Em seguida, coloque o frasco sob uma atmosfera de nitrogênio. Aqueça a mistura de reação a 150 graus Celsius por uma hora, mexendo a 700 rpm. Em seguida, deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente.

Em seguida, coloque em um tubo de centrífuga de 15 mililitros dois mililitros da solução-mãe de hidróxido de sódio e 2,965 mililitros da solução-estoque de fluoreto de amônio. Tampe bem o tubo e vortex a mistura de hidróxido de sódio e fluoreto de amônio por cinco segundos. Ao longo de cinco minutos, use uma pipeta de vidro para adicionar lentamente a mistura de hidróxido de sódio e fluoreto de amônio ao frasco de reação, mexendo sempre.

Em seguida, aqueça a mistura de reação a não mais que 50 graus Celsius. Mantenha a mistura nessa temperatura por 30 minutos. Em seguida, aqueça a mistura a 100 graus Celsius para evaporar o metanol.

Ligar o balão à linha de Schlenk e remover o metanol residual sob vácuo durante dois a três minutos. Encha o frasco com gás nitrogênio e aqueça a mistura de reação a 290 graus Celsius a cinco graus Celsius por minuto. Mantenha a mistura igual ou ligeiramente acima de 290 graus Celsius por 1,5 horas.

Em seguida, deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente enquanto mexe. Transfira a mistura do produto para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enxágue o resíduo no tubo com 30 mililitros de etanol.

Centrifugue a mistura a 4 000 vezes g durante oito minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e disperse os sólidos em 10 mililitros de hexanos por sonicação por dois minutos. Adicione 30 mililitros de etanol à dispersão, centrifugue novamente a mistura nas mesmas condições e descarte o sobrenadante.

Disperse os sólidos em cinco mililitros de hexanos e armazene a dispersão a quatro graus Celsius. Verifique a emissão convertida da solução de UCNs núcleo-casca após irradiação de laser de 808 nanômetros no escuro. Para começar a preparar UCNs modificados com DBCO, lave os nanocristais de casca de núcleo preparados em 30 mililitros de etanol por centrifugação.

Descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de uma solução aquosa de pH quatro de ácido clorídrico. Sonicar a mistura por 30 minutos para dissolver os sólidos. Transfira a mistura para um frasco de vidro e mexa vigorosamente por duas horas.

Em seguida, lave a mistura com quatro porções de 30 mililitros de éter dietílico. Combine as frações de éter e reserve a camada aquosa lavada. Recupere UCNs livres de ligantes das camadas de éter com 10 mililitros de água deionizada e combine as camadas aquosas.

Adicione 20 mililitros de acetona às camadas aquosas combinadas e vortex a mistura por cinco segundos. Centrifugar a mistura a 35 000 vezes g durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e dissolva o precipitado em dois mililitros de água deionizada para obter uma solução de UCNs livres de ligantes.

Em seguida, dissolva 200 miligramas de ácido poliacrílico em 20 mililitros de água deionizada por sonicação por 20 minutos. Adicione a isso a solução de UCNs livres de ligantes, mexendo vigorosamente. Ajuste o pH da mistura para 7,4 com uma solução molar de hidróxido de sódio.

Sonice a mistura por 30 minutos e mexa a mistura por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a mistura a 35 000 vezes g durante 10 minutos. Lave os sólidos por centrifugação em 10 mililitros de água deionizada quatro vezes.

Disperse os sólidos lavados em oito mililitros de água deionizada para obter uma solução de 10 miligramas por mililitro de UCNs modificados com polímero. Centrifugar um miligrama dos UCN modificados com polímeros a 35 000 vezes g durante 10 minutos. Armazene a solução restante a quatro graus Celsius.

Lave os sólidos por centrifugação em porções de um mililitro de DMF seco três vezes. Em seguida, dissolva o precipitado em 200 microlitros de DMF seco. Adicione a esta solução 12,2 miligramas de HOBT, 14 miligramas de EDC, cinco miligramas de DBCO-amina e 16 microlitros de DIPEA.

Mexa a mistura em temperatura ambiente por 24 horas. Em seguida, centrifugue a mistura por 10 minutos a 35.000 vezes g. Lave os sólidos quatro vezes por centrifugação em porções de um mililitro de DMSO.

Disperse os UCNs modificados por DBCO em 0,2 mililitros de DMSO e armazene a dispersão a quatro graus Celsius. Primeiro, semeie uma vez 10 as quintas células HEK293 em uma placa de 12 poços e incube as células a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, em um tubo de microcentrífuga, combine um micrograma do plasmídeo escolhido com dois microlitros de agente de transfecção P3000 em 100 microlitros de MEM.

Em outro tubo de microcentrífuga, combine 1,5 microlitros do reagente de transfecção com 100 microlitros de MEM. Incube ambas as misturas em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, combine as misturas e adicione 400 microlitros de MEM de baixo soro.

Em seguida, lave as células incubadas duas vezes com porções de um mililitro de DMEM sem soro. Distribua a mistura de transfecção de 600 microlitros nos poços da placa de 12 poços. Incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas.

Em seguida, remova o meio e lave as células duas vezes com porções de um mililitro de DMEM. Distribuir entre os alvéolos um mililitro de uma solução tetra-acetilada de N-azidoacetil-manosamina em DMEM. Incube as células a 37 graus Celsius por dois dias.

Em seguida, lave, tripsinize e recultive as células em um prato confocal durante a noite. Em seguida, substitua o meio por um mililitro de DMEM fresco contendo dois microlitros de uma solução de 50 miligramas por mililitro de DBCO-UCNs. Incube as células a 37 graus Celsius por duas horas e lave as células duas vezes com DMEM.

Apague a luz da hotte e adicione as soluções tampão dieno adequadas às células para a obtenção de imagens de cálcio e incube as células durante 30 minutos no escuro. Lave as células com DMEM sem soro. Irradie as células com luz infravermelha próxima de 808 nanômetros, fornecendo 0,8 watts por centímetro quadrado.

Alterne cinco minutos de irradiação com intervalos de cinco minutos até que as células tenham sido irradiadas por 20 minutos. Visualize as células com um microscópio confocal. A microscopia eletrônica de transmissão dos UCNs do núcleo e da camada do núcleo mostrou estruturas esféricas com uma espessura de casca de cerca de cinco nanômetros.

O MET de alta resolução mostrou espaçamento d consistente com nanoestruturas altamente cristalizadas. Após a modificação da superfície, os UCNs foram facilmente dispersos em solução tampão. O espalhamento dinâmico de luz indicou que o diâmetro hidrodinâmico dos DBCO-UCNs em solução aquosa é de cerca de 96 nanômetros.

Os potenciais zeta dos UCNs modificados com PAA e DBCO indicam superfícies carregadas negativamente, o que é consistente com a solubilidade e estabilidade em soluções tampão aquosas. Os testes de emissão convertidos para cima mostraram que os UCNs modificados por PAA e DBCO tinham os mesmos padrões de emissão que os UCNs de casca de núcleo de base quando irradiados com luz de 808 nanômetros. Células HEK293 marcadas com azida expressando proteínas de canal de luz foram usadas para testar as bioaplicações de DBCO-UCNs.

A localização dos UCNs nas marcas de azida foi atribuída aos grupos DBCO sendo corados com um corante contendo azida. Quando essas células foram expostas à luz infravermelha próxima, os DBCO-UCNs facilitaram o fluxo de íons de cálcio através da membrana celular, conforme mostrado por imagem confocal e citometria de fluxo com um indicador fluorescente de cálcio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar os nanocristais de conversão ascendente da casca do núcleo com modificação de superfície biocompatível e suas aplicações biológicas adicionais para ativar o canal iônico dependente de luz em células vivas seguindo este procedimento.