Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

O objetivo geral deste experimento é detectar mudanças na insolubilidade de proteínas com a idade em C. elegans e avaliar como o knockdown de genes direcionados influencia esse marcador de envelhecimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento e da proteostase, como por que os organismos não conseguem manter um proteoma saudável com a idade. A principal vantagem desta técnica é a oportunidade de estudar a agregação de proteínas durante o envelhecimento normal na ausência de processos patológicos.

Embora este método possa fornecer informações sobre a agregação de proteínas em C. elegans, ele também pode ser adaptado a outros organismos modelo, por exemplo, para estudar a insolubilidade de proteínas relacionada à idade em camundongos. Para iniciar o tratamento, adicione 207,45 mililitros de meio S Basal com reagentes adicionais, conforme descrito no protocolo de texto anexo, a um frasco de cultura de Fernbach de 2.800 mililitros. Adicionar uma concentração final de 50 microgramas por mililitro de carbenicilina e um milimolar de IPTG e fechar o balão com uma tampa de rosca de membrana.

Retire os L1 da incubadora de 25 graus Celsius e transfira-os para tubos de 15 mililitros. Centrifugue os L1 a 1.900 vezes g por três minutos. Depois de girar, remova o sobrenadante.

Sob um microscópio, conte os L1 por dois microlitros e calcule a média dos números obtidos de pelo menos nove gotas. Em seguida, adicione 50.000 minhocas para a coleção de minhocas jovens e 100.000 minhocas para a coleção de minhocas envelhecidas em quatro frascos de cultura de Fernbach preparados na etapa anterior. Em seguida, adicione bactérias de controle de RNAi e bactérias de RNAi para o gene de interesse proporcionalmente ao número de vermes.

Depois de adicionar bactérias, complete a cultura de vermes com S Basal para trazer o volume total para 300 mililitros. Incubar a cultura de minhocas a 25 graus Celsius em uma incubadora agitada com 150 rpm até a coleta. Colete vermes jovens no segundo ou terceiro dia para medir os níveis basais de solubilidade em proteínas.

Despeje as minhocas de um frasco em um funil de separação e deixe as minhocas sedimentarem por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois que os vermes sedimentarem, abra a torneira de parada e pingue os vermes em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, divida o pellet de minhoca em dois tubos de 15 mililitros.

Encha os tubos até 15 mililitros com M9 e centrifugue os vermes. Para lavar os vermes, remova o sobrenadante e encha o tubo até 15 mililitros com M9. Repita a centrifugação. Quando a lavagem estiver concluída, transfira as minhocas para dois tubos de 50 mililitros e use M9 gelado para encher o volume total de 20 mililitros.

Para remover bactérias e vermes mortos, adicione os dois pellets de minhoca diluídos de 20 mililitros a dois tubos de 50 mililitros cheios de 20 mililitros de sacarose 60% gelada. Centrifugue rapidamente os tubos. Com uma pipeta de 25 mililitros, remova cuidadosamente até 15 mililitros da camada superior do sem-fim.

Coloque a camada superior do verme diretamente em 37 mililitros de M9 mais octoxinol-9 preparado no gelo. Em seguida, centrifugue os tubos a 2.700 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius aceleração nove e desaceleração sete. Depois de descartar o sobrenadante, transfira o pellet para quatro tubos de 15 mililitros e lave-os duas vezes com M9 gelado mais octoxinol-9.

Em seguida, centrifugue os tubos. Retirar o sobrenadante e encher os tubos até à marca dos 15 mililitros com M9 gelado mais octoxinol-9. Lave as minhocas com M9 gelado e combine os quatro tubos em dois tubos.

Encha os tubos até 15 mililitros e centrifugue. Remova o sobrenadante, encha os dois tubos com M9 em temperatura ambiente até um volume total de quatro mililitros e gire-os em um misturador nutante a 25 graus Celsius por 40 minutos. Após a nutação, lave as minhocas duas vezes com M9 gelado mais octoxinol-9.

Em seguida, lave-os duas vezes com M9 e transfira os vermes para um tubo. Lave os vermes na remontagem ou no tampão de extração com alto teor de sal RAB sem inibidores antes da coleta. Remova o sobrenadante até que não haja líquido em cima do pellet de minhoca.

Em seguida, estime o volume do pellet de minhoca e adicione um volume idêntico de RAB com inibidores. Prepare um tubo de 50 mililitros meio cheio de nitrogênio líquido em gelo seco e, usando uma pipeta Pasteur, retire as minhocas e pingue-as lentamente no tubo. Deixe o nitrogênio líquido evaporar e armazene os vermes congelados a menos 80 graus Celsius até o processamento posterior.

Resfrie a argamassa com nitrogênio líquido e realize a ruptura do animal em gelo seco. Transfira as minhocas congeladas para a argamassa pré-resfriada e triture-as por 2,5 minutos. Adicione 100 mililitros de nitrogênio líquido ao pó e triture por mais 2,5 minutos.

Use um microscópio para verificar se os corpos dos vermes estão quebrados em pequenos pedaços. Em seguida, transfira o pó para dois tubos de mililitros e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Em gelo seco, pesar duas vezes 350 miligramas de minhocas terrestres por ponto de tempo e por bactéria de RNAi em dois tubos de mililitro.

Para remover as proteínas solúveis em sal, adicione dois volumes por peso de RAB já preparado com inibidores, um PMSF milimolar, 200 unidades por mililitro de DNase I e 100 microgramas por mililitro de RNase A a cada tubo e solubilize o pó no gelo. Puxe a suspensão para uma seringa de um mililitro 15 vezes e incube-a no gelo por 10 minutos. Centrifugue a 18.400 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Passe pela camada de gordura e colete o sobrenadante contendo proteínas solúveis em sal em um tubo de dois mililitros por condição. Retire a gordura e descarte-a. Alíquota de proteínas solúveis com alto teor de sal para congelar a 80 graus Celsius negativos.

Para descartar os lipídios, solubilize o pellet com 700 microlitros de RAB com inibidores contendo uma sacarose molar sem DNase I e RNase A. Retire a suspensão em uma seringa 10 vezes e incube-a no gelo por cinco minutos. Certifique-se de remover todo o sobrenadante e lipídios e descartá-los. Para remover as proteínas solúveis em SDS, solubilize o pellet com 700 microlitros de tampão RIPA.

Puxe a suspensão para uma seringa 10 vezes e incube-a por 10 minutos no gelo. Centrifugue a 18.400 g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Recolher o sobrenadante que contém proteínas solúveis em SDS e alíquota para congelação a 80 graus Celsius negativos.

Agrupe duas amostras de cada condição após solubilizar cada pellet com 500 microlitros de tampão RIPA e retire a suspensão em uma seringa 10 vezes. Tenha o cuidado de remover todo o sobrenadante e descartá-lo. Solubilize o pellet final contendo proteínas altamente insolúveis com 400 microlitros de ácido fórmico a 70% e retire a suspensão para uma seringa 20 vezes.

Incube a suspensão por 20 minutos no gelo. Centrifugue a suspensão em tubos de ultracentrífuga para remover os detritos da cutícula do verme. Colete o sobrenadante que contém proteínas altamente insolúveis e congele-o a 80 graus Celsius negativos.

A coloração de proteína total do conteúdo de proteína insolúvel de vermes jovens e idosos revelou um forte aumento relacionado à idade nos níveis de proteína altamente insolúvel em animais de controle e não em animais de vida longa. A coloração de anticorpos de PAB-1, uma proteína de ligação ao RNA com um domínio semelhante ao príon previsto, confirmou os dados de espectrometria de massa de que os animais de vida longa mantiveram o PAB-1 solúvel com a idade. A análise in vivo foi realizada de animais transgênicos expressando tagRFP PAB-1 nos músculos faríngeos.

Em animais jovens, o tagRFP PAB-1 estava localizado principalmente difusamente em toda a faringe. Com a idade, um acúmulo progressivo em pontos brilhantes começando no bulbo faríngeo posterior. Durante o envelhecimento, também observamos agregação no bulbo faríngeo anterior em um número crescente de animais.

A quantificação de diferentes níveis de agregação tagRFP PAB-1 com a idade no tipo selvagem e o fundo mutante daf-2 revela agregação tagRFP PAB-1 fortemente atrasada com a idade em animais de vida longa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar um grande número de vermes para extração de proteínas e como isolar grandes agregados altamente insolúveis para análise posterior por espectrometria de massa ou página SDS.