Name: O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a estabelecer um ensaio de colonização pulmonar para visualizar células tumorais circulantes em tecidos pulmonares de camundongos. Este método permite observar células cancerígenas extravasadas precocemente durante a metástase.

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Os autores desejam agradecer Dr. Chang Ming-Min e MS. Ya-Hsin Cheng pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (a maioria-103-2325-B-006-009, a maioria-104-2325-B-006-001, a maioria-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e o Ministério da saúde e bem-estar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos também o apoio do laboratório de pesquisa do núcleo da faculdade de medicina, Universidade Nacional de Cheng Kung, seu microscópio confocal multi fóton.

Todas as experiências em ratos foram realizadas de acordo com as orientações do nosso Instituto (guia de cuidados e uso de animais de laboratório, NCKU Medical College).
1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos
<ol><li>Antes de iniciar os protocolos experimentais, obter suturas cirúrgicas estéril, seringas de 1 mL com agulha 26G/0,5 cm (para injeção de veia cauda), seringas de 3 mL com agulha de 24G/cm 3 (para perfusão do pulmão), modificado águia Media (DMEM de Dulbecco), solução do trypsin-EDTA (5 tripsina g/L e 0,53 mM), soro bovino fetal (FBS), 1X PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mm at2PHO4e 1,8 mM KH2PO4) e pratos de cultura de 6 cm.</li>
</ol>2. preparação e recuperação de células tumorais em suspensão
<ol><li>Prepare-se modificado águia Media (DMEM de estéril Dulbecco) contendo 10% ou 20% FBS e recentemente adicionar 2 mM L-glutamina, 1X PBS e 0,05% Trypsin-EDTA.</li>
	<li>Cultura de células em DMEM suplementado com 10% FBS a 37 ° C e cultivá-las até que haja uma confluência de 70-80% da placa de cultura.</li>
	<li>Retire os pratos, seguidos de duas lavagens com 2 mL de PBS estéril 1 x os meios de cultura (DMEM).</li>
	<li>Adicionar 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA para os pratos para cobrir completamente todas as células. Imediatamente remover 800 μL de solução e deixar apenas 200 μL nos pratos. Incubar os pratos a 37 ° C por 30 s a 1 min (dependendo do tipo de célula) e espere até que a maioria das células estão no estado suspenso.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de DMEM fresco contendo 10% FBS directamente para os pratos de parar a atividade enzimática da tripsina e vigorosamente Pipetar a suspensão de células acima e para baixo com uma pipeta de 1000 µ l para preparar uma suspensão de célula única.</li>
	<li>As células de transferência do prato para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e spin para baixo as células à temperatura ambiente a 162 x g, durante 3 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o tumor de células em 1,5 mL DMEM contendo 20% FBS e extremidade-sobre-extremidade girar as células em suspensão a 37 ° C por 2 h. Nota: Se o meio fica amarelo durante a recuperação, trocar o antigo médio com meio fresco contendo 20% FBS.</li>
</ol>3. fluorescência de coloração e a análise de células tumorais em suspensão com Carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE)
<ol><li>Após a recuperação de células em suspensão, contar o número de células viáveis apropriado com Trypan azul em uma contagem câmara para titulada a fluorescência de coloração doses de Neubauer e cauda veia injeção.</li>
	<li>Gire para baixo as células a 162 x g em temperatura ambiente por 3 min e ressuspender esterilizados de peletizadas células em 1 mL de 1X PBS, seguido por centrifugação de temperatura a 162 x g, durante 3 min.</li>
	<li>Ressuspender as células peletizadas em 500 µ l de 1X PBS contendo 10% FBS e 0, 5, 10, 20 ou 40 µM CFSE para titulação de dose e incube a suspensão de célula 37 oC por 10 min no escuro.</li>
	<li>Gire para baixo as células a 162 x g, à temperatura ambiente por 3 min e ressuspender as células peletizadas com 4 mL de DMEM contendo 1% FBS. Repita essa etapa de lavagem mais três vezes. Ressuspender as células peletizadas com 4 mL de DMEM sozinho para a lavagem final.</li>
	<li>Submeter as células CFSE-etiquetadas a fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) para quantificar a intensidade de fluorescência de uma única célula, ou injeção de veia da cauda. Nota: Manter as células no gelo antes de realizar as injeções de veia de FACS análise ou cauda.</li>
</ol>4. pulmão colonização ensaio
<ol><li>Preparar as células rotuladas com 20 µM CFSE (consulte 3.1 etapas através de 3.4). Nota: Decidir a dose de trabalho de CFSE para rotulagem de células tumorais, baseadas nos resultados de titulação, a partir da análise de FACS (consulte a etapa 3.3).</li>
	<li>Aquecer as caudas de 4-6 semana-velho macho C57BL/6 ratos (6 ratos) com uma lâmpada de iodetos durante 5-10 min em uma base por-do rato para dilatar as veias de cauda de rato.</li>
	<li>Homogeneizar bem e Aspire células tumorais CFSE-rotulado com uma seringa de 1 mL (26Gx1/2), evitando quaisquer bolhas na suspensão de célula (com uma densidade celular final de 5 x 106 células/mL).</li>
	<li>Cuidadosamente, injetar 1 x106 células de tumor CFSE-etiquetadas em 200 µ l de DMEM na veia de cauda de rato, que deve ser apresentada em uma retenção de rato. Nota: Durante a injeção, se a agulha é colocada diretamente no lúmen da veia da cauda, células tumorais devem ser facilmente entregues na circulação sem a necessidade de dar o máximo na seringa. Se é difícil para as células do tumor através de empurrar, eles provavelmente foram injetados fora da veia da cauda, no espaço subcutâneo.</li>
	<li>Dividir os ratos que receberam por via intravenosa as células do tumor CFSE-etiquetadas em dois grupos: um grupo passará por perfusão pulmonar, seguida por microscopia confocal e quantificação do ImageJ em ensaio de colonização o pulmão e o outro será deixada sozinho para 4-5 semanas na colonização de pulmão de longo prazo do ensaio.</li>
	<li>Em 20, 38 ou 45 h e com 1 x 106 células de tumor injetadas por via intravenosa durante uma titulação de curso e dose-dependente do tempo, anestesiamos tumor-rolamento ratos com 50-75 mg/kg zoletil 50, que é um bem aceita e adequada anesthetizer23. Nota: Uso veterinário pomada olhos de ratos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.</li>
	<li>Corte longitudinalmente a pele e subcutâneo do abdome para a região do peito com uma tesoura cirúrgica. Abra a cavidade pleural com tesoura cirúrgica e fórceps para expor totalmente o coração e os pulmões. Nota: Tenha cuidado para evitar cortar os vasos sanguíneos.</li>
	<li>Amarre a veia cava superior (SVC) e a veia cava inferior (VCI) com suturas cirúrgicas estéril para evitar o refluxo da solução de perfusão durante a perfusão pulmonar.</li>
	<li>Corte a parede do ventrículo esquerdo com uma tesoura cirúrgica para abrir uma fissura (cerca de 2-4 mm) para drenar a solução de perfusão dos pulmões.</li>
	<li>Injetar o ventrículo direito com uma seringa de 3 mL 1X PBS e remover a solução drenada com sucção constante durante a perfusão pulmonar até aos pulmões recorrer de uma cor avermelhada completamente pálido.</li>
</ol>5. confocal imagem microscópica e a análise de células tumorais de pulmão-colonizado
<ol><li>Remover os pulmões agora-pálido da cavidade pleural e separar os cinco lóbulos cortando os ligamentos da traqueia e do tecido conjuntivo com de tesoura e pinça cirúrgica24.</li>
	<li>Prepare um suporte de maca-como pulmão como mostrado na Figura 3B enrolando uma sutura de nylon em torno de duas hastes de metal para produzir uma textura reticulada, com um espaço entre as duas hastes para a colocação dos lobos do pulmão. Defina o titular do pulmão em um prato de 6 cm. Nota: O titular do pulmão será usado para estabilizar os lóbulos pulmonares debaixo da lente objetiva de um microscópio confocal.</li>
	<li>Apresentar e fixar os lóbulos pulmonares na textura reticulada do titular do pulmão. Cubra e Umedeça os lóbulos pulmonares com 1X PBS.</li>
	<li>O prato de 6cm cultura, abrigando os lóbulos pulmonares no suporte do pulmão para microscopia confocal para capturar imagens de fluorescência gravando as células do tumor de pulmão-colonização de assunto.</li>
	<li>Para a imagem latente, usar lentes objetivas (5 X, MPLN, Nd: 0.1, WD: 20, ar).</li>
	<li>Gire a roda de filtro para NIBA (excitação/emissão; 470-495 nm/510-550 nm) e com 488 nm laser para excitar CFSE, claramente visualizar imagens de pontos de fluorescência dos lóbulos pulmonares.</li>
	<li>Gire a roda de filtro para R690 (para MaiTai HP DeepSee laser) para digitalizar com 2.0 µs/pixel digitalização acelerar e otimizar o HV, ganho e deslocamento níveis.</li>
	<li>Capturar imagens de fluorescência (512 x 512 pixels) usando o software de microscópio com um 10 µs/pixel, velocidade de digitalização.</li>
	<li>Quantificar e analisar estatisticamente as imagens microscópicas usando o ImageJ e GraphPad software como descrito anteriormente,21.</li>
</ol>6. a longo prazo os ensaios de colonização do pulmão
Nota: Repita os passos 4.1 através de 4.5.
<ol><li>Sacrificar os ratos após inoculação de células de tumor por 4-5 semanas e consertar seus pulmões com líquido de Bouin25 para 1 a 2 dias.</li>
	<li>Quantificar e analisar estatisticamente os nódulos de tumor dos pulmões de ratos com software21.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Juntamente com longo prazo pulmonar colonização ensaios, a curto prazo, metodologia que utilizamos aqui para avaliar na vivo pulmonar colonização por CTC em órgãos distantes claramente revelada e diferenciado o papel específico de polyFN montado no CTC da colonização os pulmões, que em seguida levaram o extravasamento e processos metastáticos18,19,20,21. Apesar de rotulagem células com...

Metástase é a principal causa de morte de câncer1,2. Células tumorais derivadas de tecidos primários entram a circulação em suspensão e sobrevivem vários desafios hematogênica, por exemplo, anoikis, imunes agressões e danos devido à tensão de cisalhamento de pressão arterial ou restrições geométricas, antes de serem capazes de colonizar órgãos distantes, um passo fundamental a ditar o sucesso de metástase3,4,5,6. Portanto, atualmente foram desenvolvidos esforços vigorosos na caracterização de células tumorais circulantes (CTC) e correlacionando estas características com a malignidade do tumor, metástase e as taxas de sobrevivência de câncer pacientes7,8 , 9. uma vez que o processo de metástase de câncer especificamente retrata um evento na vivo , modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase10,11,12 .
CTC-se tecidos de tumor metastático através de vários eventos celulares, incluindo a colonização de órgãos distantes1,2. No entanto, o mais comumente usado metástase ensaios13,14,15 não fornecem uma maneira de observar a colonização de CTC de órgãos distantes. Portanto, um projeto de ensaio na vivo para visualização de colonização do CTC é urgentemente necessária. Embora vários in vivo e ex vivo curto desvantagens, problemas e colonização de pulmão termo ensaios foram projetados permanecem. Por exemplo, enquanto a proteína fluorescência verde (GFP)-tumor superexpressão células têm sido utilizadas nestes ensaios22,23, leva tempo para estàvel transfect e clonar células tumorais com intensidade fluorescente GFP suficiente, sob o microscópio. Da mesma forma, embora transitória de coloração de células tumorais com o marcador de célula de longo prazo CFSE tem sido empregado para substituir as células do tumor-expressando GFP, continua a ser difícil julgar se as células do tumor CFSE-etiquetados são anexadas ou meramente presente dentro do vasculatura do extirpado órgãos distantes16,17.
Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies de CTC foi encontrada criticamente, contribuir para o estabelecimento de tumor metastático tecidos18,19,20,21,22 final . Aqui, realizamos a curto prazo pulmão ensaios de colonização na qual suspensos células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) estàvel expressando FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com CFSE por via intravenosa foram inoculados em camundongos C57BL/6. Após 2-3 dias, pulmões do mouse primeiro foram perfundidos com solução salina tamponada fosfato (PBS) para remover completamente o CTC solto dentro da vasculatura antes de serem submetidos a microscopia confocal e quantificação de pulmão-colonizar LLCs. Mostramos claramente que os números de pulmão-colonizar shFN LLCs e nódulos de tumor foram significativamente reduzidos em comparação com shScr LLCs, corroborando substancialmente o papel do assembly polyFN no CTC facilitar a colonização e crescimento do CTC na pulmões. Nosso estudo garante mais investigação para o papel de polyFN em metástase do cancro.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino&nbsp;( BSA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's Fluid</td><td>MCC(medical chemical corporation)/POISON</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferação Dye</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>Nome completo: Carboxifluoresceína éster succinimidílico</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-6381-92-6</td><td>Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 0.53mM)&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lewis carcinoma de pulmão (LLC)</td><td>ATCC, Manassas, VA, EUA</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, USP&nbsp;</td><td>(Gibco) ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td> <td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td> <td>101-7447-40-7</td><td>Para preparado 1X PBS (concentração final: 2,7 mM)</td></tr> <tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td> <td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td> <td>101-7778-77-0</td><td>Para preparado 1X PBS (concentração final: 1,8 mM)</td></tr> <tr><td>Sódio cloreto (NaCl)</td> <td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td> <td>101-7647-14-5</td><td>Para preparado 1X PBS (concentração final: 137mM)</td></tr> <tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO 4)</td> <td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td> <td>101-10039-32-4</td><td>Para preparado 1X PBS (concentração final: 10mM )</td></tr> <tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,5 g misture com 100 mL 1X PBS</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td>Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 5g/L)</td></tr> <tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td></td><td>Para diluir com 1X PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa compacta 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura (6cm)</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>Seringa descartável (com agulha)</td> <td>Perfect Medical Industry Co.</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml & 26G/0,5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>Misturador de ponta a ponta</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>Para recuperação de células suspensas&nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Direct Heat CO2 incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>Limitador de Mouse (Limitador Cilíndrico 15-30 gm)</td> <td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Multifotônico BX61WI</td><td>Câmara</td> de contagem <td>Olympus FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>Suturas cirúrgicas&nbsp;</td><td>UNIK SUTURAS CIRÚRGICAS MFG. CO.</td><td>NO. 0034</td><td>Seda trançada preta; não absorvível (25YD; USP 4/0)</td></tr> <tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>615001</tr><tr><td>Tubo Greiner de 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

o estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de tumor nos tecidos do pulmão de circulação

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metástase é a principal causa de morte por cancro. O papel da circulação de células tumorais (CTC) na promoção de metástases, em que colonização pulmonar por CTC criticamente contribui para primeiros processos de pulmão metastático, foi investigado vigorosamente. Como tal, os modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase. Dado que os problemas ocorrem em projetos experimentais anteriores para analisar as contribuições da CTC para extravasamento dos vasos sanguíneos, estabelecemos um ensaio de colonização de pulmão na vivo em que uma célula de longo-prazo-fluorescência-tracer, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), era usado para rotular células tumorais suspenso e perfusão pulmonar foi realizada para limpar não especìfica preso CTC antes da remoção do pulmão, imagem latente confocal e quantificação. Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies CTC foi encontrada para mediar a colonização de pulmão no estabelecimento final de tecidos de tumor metastático. Aqui, para testar especificamente o requisito de assembly polyFN no CTC para a colonização de pulmão e extravasamento, realizamos a curto prazo suspenso de ensaios de colonização pulmonar em que células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) expressam estàvel FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com 20 μM de CFSE por via intravenosa foram inoculadas em camundongos C57BL/6. Temos demonstrado com sucesso que as habilidades de shFN células LLC para colonizar os pulmões do mouse foram significativamente reduzidas em comparação com células de shScr LLC. Portanto, esta metodologia a curto prazo pode ser amplamente aplicada para demonstrar especificamente a capacidade do CTC dentro a circulação para colonizar os pulmões.

Antes de realizar o ensaio de colonização de pulmão na vivo como ilustrado na figura 1A , para testar se polyFN em células tumorais suspenso Medeia colonização pulmonar e/ou extravasamento na facilitação de metástase, nós primeiro titulado diferentes concentrações de CFSE, um composto fluorescente que é a célula permeável e covalentemente conjuga intracelulares contendo amina moléculas26,27 e...

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase do câncer sobre o papel da colonização pulmonar na realização da metástase do câncer. A principal vantagem dessa técnica é que as células cancerígenas extravasadas precocemente podem ser visualizadas nos pulmões durante a metástase do câncer. Demonstrando o procedimento estará Cheng-Han Yang, um estudante de doutorado do meu laboratório.Quando a cultura de células tumorais atingir 70 a 80 por cento de confluência, lave a cultura duas vezes em dois mililitros de PBS estéril por lavagem e adicione um mililitro de 0,5% de tripsina-EDTA à placa de cultura. Remova imediatamente 800 microlitros do sobrenadante e coloque a placa de cultura a 37 graus Celsius por 30 a 60 segundos até que a maioria das células se desprenda da placa. Adicione um mililitro de meio fresco, suplementado com 10% de FBS para interromper a reação e use uma pipeta de 1000 microlitros para misturar vigorosamente a solução celular.Transfira a suspensão de célula única resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e colete as células por centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet de células tumorais em 1,5 mililitros de meio suplementado com 20% de FBS e gire as células por duas horas, a 37 graus Celsius. No final da incubação, contar as células viáveis por exclusão do azul de tripano e recolhê-las por centrifugação.Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS estéril para uma segunda centrifugação e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS suplementado com 10% de FBS e 20 microlitros de CFSE. Após dez minutos a 37 graus Celsius no escuro, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio suplementado com um por cento de FBS para outra centrifugação. Após a última lavagem, ressuspenda as células a cinco vezes dez elevado à sexta células tumorais por mililitro de meio fresco sem concentração de FBS e coloque as células no gelo.Em seguida, aqueça a cauda de um camundongo C570 Black Six macho de quatro a seis semanas por cinco a dez minutos para dilatar as veias da cauda e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 e meio para misturar completamente as células até que uma única suspensão celular seja alcançada. Carregue cuidadosamente a seringa com 200 microlitros de células e coloque o mouse em uma contenção. Em seguida, injete todo o volume de células no lúmen de uma veia da cauda dilatada.No momento pós-injeção apropriado, faça uma incisão longitudinal na pele e no tecido subcutâneo do abdômen ao tórax e abra a cavidade pleural para expor o coração e os pulmões. Usando suturas cirúrgicas estéreis, ligue as veias cavas superior e inferior para evitar o refluxo da solução de profusão e use uma tesoura para fazer uma fissura de dois a quatro milímetros no ventrículo esquerdo para facilitar a drenagem do perfusato dos pulmões. Em seguida, use uma seringa de três mililitros para injetar PBS no ventrículo direito e use sucção contínua para remover a solução drenada até que os pulmões mudem de uma cor avermelhada para completamente pálida.Tome cuidado para proteger adequadamente a veia cava superior e inferior para uma perfusão pulmonar bem-sucedida. Após a colheita dos pulmões, coloque os lóbulos em um suporte de pulmão feito sob medida em um prato de seis centímetros e prenda os pulmões na textura reticulada do suporte. Cubra e umedeça os lóbulos com PBS e coloque a placa de cultura no estágio de imagem de um microscópio confocal.Selecione a objetiva 5x e gire a roda do filtro para NIBA. Usando um laser de 488 nanômetros, excite o CFSE para permitir uma visualização clara das células tumorais marcadas com azul fluorescente nos lobos pulmonares. Gire a roda do filtro para R690 para digitalizar com uma velocidade de varredura de dois microssegundos por pixel e otimizar o ganho de alta tensão e os níveis de deslocamento.Em seguida, capture cinco imagens fluorescentes de 12 por cinco de 12 pixels usando uma velocidade de varredura de 10 microssegundos por pixel. Usando o método de coloração, como acabamos de demonstrar, as células tumorais são efetivamente marcadas com CFSE de maneira dose-dependente. Com a intensidade de fluorescência da marcação, quase atingindo um platô em seis vezes 10 para o quinto carcinoma de pulmão de Lewis células por mililitro na concentração de 20 micromolares.A perfusão pulmonar antes da colheita, como acabamos de demonstrar, limpa a vasculatura pulmonar de células tumorais circulantes não especificamente cortadas antes da análise de imagem. A microscopia confocal de fluorescência revela a presença das células tumorais marcadas com CFSE colonizadoras nos lobos pulmonares colhidos e perfundidos. O uso de um programa de software de análise de imagem apropriado para converter as imagens fluorescentes em preto e branco facilita a quantificação da colonização pulmonar.A administração intravenosa de células de carcinoma pulmonar de Lewis que expressam fibronectina ou codificada expressa fibronectina demonstra um número significativamente menor de células que expressam fibronectina no tecido pulmonar colhido 38 e 45 horas após a injeção, ressaltando o papel da fibronectina na colonização do lobo pulmonar e no desenvolvimento do tumor. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de perfundir cuidadosamente os pulmões para que as células soltas possam ser lavadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da metástase do câncer explorarem a colonização pulmonar circulando células tumorais em um modelo de zero grama de camundongo.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular fluorescentemente as suspensões de células tumorais, inocular por via intravenosa as células tumorais, perfundir os pulmões de camundongos e usar a microscopia de florescência confocal para obter imagens das células tumorais metastizadas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

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A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

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Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

Um grande desafio do desenvolvimento de novas terapias para o câncer de pulmão inclui a modelagem do microambiente tumoral à medida que a doença regional progride para a doença metastática. Aqui, descrevemos um método simples de estabelecer um modelo singênico ortotópico de câncer de pulmão que permite o rastreamento in vivo da doença ao longo do tempo.

Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

Esse protocolo apresenta um método detalhado para isolar suspensões unicelulares de alta qualidade tanto de tecido pulmonar murino saudável quanto de tumores. Esse protocolo pode ser aplicado ao scRNA-seq, análise de citometria de fluxo e isolamento de células primárias.

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular

Aprenda a estabelecer um ensaio de colonização pulmonar para visualizar células tumorais circulantes em tecidos pulmonares de camundongos. Este método permite observar células cancerígenas extravasadas precocemente durante a metástase.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação (Vídeo) | JoVE Journal

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

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