O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase do câncer sobre o papel da colonização pulmonar na realização da metástase do câncer. A principal vantagem dessa técnica é que as células cancerígenas extravasadas precocemente podem ser visualizadas nos pulmões durante a metástase do câncer. Demonstrando o procedimento estará Cheng-Han Yang, um estudante de doutorado do meu laboratório.

Quando a cultura de células tumorais atingir 70 a 80 por cento de confluência, lave a cultura duas vezes em dois mililitros de PBS estéril por lavagem e adicione um mililitro de 0,5% de tripsina-EDTA à placa de cultura. Remova imediatamente 800 microlitros do sobrenadante e coloque a placa de cultura a 37 graus Celsius por 30 a 60 segundos até que a maioria das células se desprenda da placa. Adicione um mililitro de meio fresco, suplementado com 10% de FBS para interromper a reação e use uma pipeta de 1000 microlitros para misturar vigorosamente a solução celular.

Transfira a suspensão de célula única resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e colete as células por centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet de células tumorais em 1,5 mililitros de meio suplementado com 20% de FBS e gire as células por duas horas, a 37 graus Celsius. No final da incubação, contar as células viáveis por exclusão do azul de tripano e recolhê-las por centrifugação.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS estéril para uma segunda centrifugação e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS suplementado com 10% de FBS e 20 microlitros de CFSE. Após dez minutos a 37 graus Celsius no escuro, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio suplementado com um por cento de FBS para outra centrifugação. Após a última lavagem, ressuspenda as células a cinco vezes dez elevado à sexta células tumorais por mililitro de meio fresco sem concentração de FBS e coloque as células no gelo.

Em seguida, aqueça a cauda de um camundongo C570 Black Six macho de quatro a seis semanas por cinco a dez minutos para dilatar as veias da cauda e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 e meio para misturar completamente as células até que uma única suspensão celular seja alcançada. Carregue cuidadosamente a seringa com 200 microlitros de células e coloque o mouse em uma contenção. Em seguida, injete todo o volume de células no lúmen de uma veia da cauda dilatada.

No momento pós-injeção apropriado, faça uma incisão longitudinal na pele e no tecido subcutâneo do abdômen ao tórax e abra a cavidade pleural para expor o coração e os pulmões. Usando suturas cirúrgicas estéreis, ligue as veias cavas superior e inferior para evitar o refluxo da solução de profusão e use uma tesoura para fazer uma fissura de dois a quatro milímetros no ventrículo esquerdo para facilitar a drenagem do perfusato dos pulmões. Em seguida, use uma seringa de três mililitros para injetar PBS no ventrículo direito e use sucção contínua para remover a solução drenada até que os pulmões mudem de uma cor avermelhada para completamente pálida.

Tome cuidado para proteger adequadamente a veia cava superior e inferior para uma perfusão pulmonar bem-sucedida. Após a colheita dos pulmões, coloque os lóbulos em um suporte de pulmão feito sob medida em um prato de seis centímetros e prenda os pulmões na textura reticulada do suporte. Cubra e umedeça os lóbulos com PBS e coloque a placa de cultura no estágio de imagem de um microscópio confocal.

Selecione a objetiva 5x e gire a roda do filtro para NIBA. Usando um laser de 488 nanômetros, excite o CFSE para permitir uma visualização clara das células tumorais marcadas com azul fluorescente nos lobos pulmonares. Gire a roda do filtro para R690 para digitalizar com uma velocidade de varredura de dois microssegundos por pixel e otimizar o ganho de alta tensão e os níveis de deslocamento.

Em seguida, capture cinco imagens fluorescentes de 12 por cinco de 12 pixels usando uma velocidade de varredura de 10 microssegundos por pixel. Usando o método de coloração, como acabamos de demonstrar, as células tumorais são efetivamente marcadas com CFSE de maneira dose-dependente. Com a intensidade de fluorescência da marcação, quase atingindo um platô em seis vezes 10 para o quinto carcinoma de pulmão de Lewis células por mililitro na concentração de 20 micromolares.

A perfusão pulmonar antes da colheita, como acabamos de demonstrar, limpa a vasculatura pulmonar de células tumorais circulantes não especificamente cortadas antes da análise de imagem. A microscopia confocal de fluorescência revela a presença das células tumorais marcadas com CFSE colonizadoras nos lobos pulmonares colhidos e perfundidos. O uso de um programa de software de análise de imagem apropriado para converter as imagens fluorescentes em preto e branco facilita a quantificação da colonização pulmonar.

A administração intravenosa de células de carcinoma pulmonar de Lewis que expressam fibronectina ou codificada expressa fibronectina demonstra um número significativamente menor de células que expressam fibronectina no tecido pulmonar colhido 38 e 45 horas após a injeção, ressaltando o papel da fibronectina na colonização do lobo pulmonar e no desenvolvimento do tumor. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de perfundir cuidadosamente os pulmões para que as células soltas possam ser lavadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da metástase do câncer explorarem a colonização pulmonar circulando células tumorais em um modelo de zero grama de camundongo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular fluorescentemente as suspensões de células tumorais, inocular por via intravenosa as células tumorais, perfundir os pulmões de camundongos e usar a microscopia de florescência confocal para obter imagens das células tumorais metastizadas.