Name: Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda o ensaio de metástase pulmonar para estudar células de osteossarcoma metastático em tecido pulmonar viável. Este método permite visualizar diretamente o crescimento celular em ambiente tridimensional.

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Gostaríamos de agradecer o Dr. Arnulfo Mendoza que forneceu treinamento na técnica de PuMA. Além disso, gostaríamos de reconhecer os Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para fornecer o uso de seus microscópios no decorrer deste estudo. Esta pesquisa foi apoiada (em parte) pelo programa de pesquisa Intramural de institutos nacionais de saúde, centro de pesquisa de câncer, filial de oncologia pediátrica. M.M.L. foi apoiado pelo programa nacional de institutos de saúde Intramural visitando Fellow (prêmio 15335) e atualmente é suportado por Joan Parker doutorado em pesquisa de metástase. EP é suportado pelo British Columbia Cancer Foundation.

Todos os protocolos de animais, dos quais foram obtidos dados de imagem foram realizados com a aprovação do cuidado Animal e Comissão de uso do Instituto Nacional do câncer, os institutos nacionais de saúde. Todos os animais protocolos discutidos e retratado no artigo vídeo foram aprovados pelo Comitê de cuidados animais Universidade da Colúmbia Britânica.
1. preparação de células tumorais para injeção e materiais para o modelo PuMA
Nota: A quantidade de células e soluções será suficiente para 1 rato. Aumenta conforme necessário se mais ratos são usados no estudo. Para receitas de mídia, consulte a tabela 1 e tabela 2.
<ol><li>Pré-aqueça 5ml de mídia-A em um tubo cônico de 15 mL em banho maria a 37 oC.</li>
	<li>Derreta a 1,2% baixa fusão agarose solução (em água estéril) usando o microondas de laboratório.</li>
	<li>Transferir 5ml do agarose derretido em um tubo cônico de 15 mL e aquecer em banho maria a 37 oC. Garantir que a agarose derretida é 37 oC e líquido antes da etapa de insuflação pulmonar.</li>
	<li>Pre-frio 30 mL de cultura de células da classe PBS suplementado com 1 X caneta/inflamada em um balde de gelo.</li>
	<li>Em um poço de uma placa de 6, pre-embeba uma esponja gelatinosa em 1,5 mL de B-media. A esponja será a âncora de suporte para as fatias de pulmão.</li>
	<li>Certifique-se de células do sistema operacional são cerca de 70-90% confluentes no dia do procedimento. Não use pilhas que são excesso confluente ou se a mídia é laranja para amarelo desde que as células geralmente estão estressadas e diminuíram a viabilidade neste ponto. Para as linhas de célula de osteossarcoma, MNNG e HOS, 5 x 105 em um volume de 100 μL será usado para injetar na veia da cauda do 1 rato. Upscale em conformidade se mais ratos são utilizados para o estudo.</li>
	<li>Colha as células do tumor usando 0,25% do trypsin-EDTA (3 mL para um balão de T75 ou 2 mL em um prato de cultura de 10 cm). Quando as células estão começando a levantar a placa, neutralize o tripsina-EDTA com mídia completa. Gire para baixo as células e lave uma vez com o grau de cultura celular PBS. Resuspenda o pellet em 5 mL de PBS.</li>
	<li>Realizar uma contagem de células por métodos padrão. É melhor fazer a suspensão de células mais do que o que realmente é necessário desde perda de suspensão de células, muitas vezes ocorre durante a agulha elaborar e tentativas de injeção.</li>
	<li>Realize um ensaio de exclusão Trypan azul em uma amostra de suspensão de células para avaliar a viabilidade das células. Prossiga somente se a célula mostrar viabilidade 90% ou superior.</li>
	<li>Injete 5 x 105 células em um volume de 100 μL. Para preparar um excesso de 2 X deste montante, devem ser giradas para baixo e resuspended em 0,2 mL de HBSS a 1 x 106 células.</li>
	<li>Coloque a suspensão de células em um balde de gelo enquanto prepara os ratos para a injeção.</li>
</ol>2. cauda veia injeção e insuflação pulmonar
Nota: A quantidade de soluções e células nesta seção será suficiente para 1 rato. Aumenta conforme necessário se mais ratos são usados no estudo. Para obter uma lista dos equipamentos, materiais e instrumentos cirúrgicos utilizados nas etapas a seguir, consulte a tabela 3 e tabela 4.
<ol><li>Aquecer um rato fêmea (6-8 semanas de idade) sob uma lâmpada de aquecimento por 5 min para fazer a sua cauda veia mais visivelmente aparente. Para as células K7M2 ou K12 murino, usar camundongos Balb/c; para células humanas MG63.3, MG63, MNNG e HOS, use ratos de imunodeficiência combinada grave.</li>
	<li>Certifique-se que a suspensão de eritrócitos é uniforme, agitando suavemente o tubo. Elaborar cuidadosamente a suspensão de células para a seringa de 1 mL sem a agulha. Tampa da seringa com um 27 medidor de agulha. Certifique-se que o bisel da agulha é o mesmo lado que as marcas de volume na agulha.</li>
	<li>Coloque o mouse na retenção e limpar o rabo com uma compressa com álcool.</li>
	<li>Proceda para realizar uma injeção de veia de cauda e injetar a 100 μL da suspensão celular. 5 min após a injeção, posicione o mouse em uma câmara de2 CO e começar o procedimento operacional padrão de eutanásia (como contorno pela vossa Comissão institucional cuidados com animais). Deslocamento cervical não deve ser usado como um meio de eutanásia, desde que o procedimento irá danificar a traqueia.</li>
	<li>Uma vez que o mouse é eutanásia, começa a preparação do exaustor de fluxo laminar para insuflação do pulmão do rato com a solução de agarose/A-media. Dentro do capô de fluxo laminar, configure uma área de trabalho com a sua almofada estéril. Sobre esta placa você colocará seus instrumentos esterilizados, cateter IV, IV conjunto de extensão e aparelho de perfusão de gravidade (ver suplementar Figura 1).</li>
	<li>Posicione o mouse no recumbancy dorsal. Com uma tesoura pequena estéril, disse cuidadosamente para fora o esterno para expor a cavidade torácica. Tome cuidado para não perfurar o pulmão, pois será usada uma solução de agarose/A-media para insufle o pulmão.</li>
	<li>Quando dissecando fora do esterno, disse passado da entrada torácica em ambos os lados da traqueia. Expor a traqueia, embora a dissecar os tecidos moles circundantes.</li>
	<li>Canule a traqueia com um cateter IV de 20 calibre. Vagamente um nó cirúrgico usando sutura catgut estéril ao redor da traqueia canulada.</li>
	<li>Anexe uma extensão de IV conjunto da traqueia catheterized para a seringa de 10 mL de aparelho de perfusão de gravidade.</li>
	<li>Combine o pré-aquecido 37 oC agarose (5 mL) e A mídia (5 mL) em uma mistura 1:1. Despeje a solução de agarose/A-media líquida para a seringa de 10 mL do dispositivo de perfusão de gravidade. Antes da insuflação dos pulmões com solução de agarose/A-media, certifique-se de que todo o comprimento do conjunto de extensão foi preparado com agarose/A-media, eliminando desse modo insuflação inadvertida de amostras do pulmão com ar.</li>
	<li>Encha o pulmão a solução de agarose/A-media até o pulmão está totalmente insuflado.</li>
	<li>Uma vez que o pulmão está totalmente insuflado, remover a cânula e firmemente amarrar o nó cirúrgico para evitar o vazamento da mídia-agarase/A solução através da traqueia.</li>
	<li>Prossiga para dissecar para fora o Sá (traqueia, coração e pulmão) da cavidade torácica. Tome cuidado para não perfure ou danificar a superfície do pulmão.</li>
	<li>Lugar o pluck (em nenhuma orientação específica) no pre-refrigerado 30 mL de PBS suplementado com 1 X caneta/inflamada e permitir que a mídia de agarose/A solidificar por 20 min.</li>
	<li>Usando bem tesoura e pinça, corte pequenos pedaços do pulmão (3 x 1,5 mm), como indicado na figura 1A. Fatias menores do pulmão podem ser facilmente fotografadas usando um objectivo X 2,5. Várias fatias podem ser cortadas por condição experimental, normalmente de 4-10 fatias por grupo. Nota: Para cada grupo experimental, coloque as rodelas de pulmão em um poço separado (placa de 6) contendo uma esponja de gelatina 2 x 2 cm previamente embebida em B-media. A quantidade de mídia por bem deve ser de 1,5 mL. Mude os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Para estudos de drogas, a frequência da mudança a mídia/droga é usuário determinado.</li>
</ol>3. Widefield fluorescência por imagens do pulmão fatias e análise
Nota: Para fluorescência widefield fatias de imagem, menores são cortadas (3 x 1,5 x 1 mm) para montar a seção de pulmão em 1 imagem utilizando um objectivo X 2,5.
Aquisição de imagem em um microscópio de fluorescência widefield:
<ol><li>Fatias de pulmão são tipicamente fotografadas em 0, 3, 7 e 14 dias pós-injeção. No ambiente estéril do gabinete biológico, transferir com cuidado as fatias de pulmão da gelatina esponjas para um vidro estéril 35mm-fundo redondo prato. Cuide-se para dab fora o excesso de líquido da fatia pulmão como o excesso de líquido irá atuar como um espelho e refletem a luz fluorescente, proveniente das células do tumor.</li>
	<li>Disponha as fatias de pulmão em uma maneira similar, representada na figura 1A. Cada coluna representaria uma condição experimental diferente. Tome cuidado para não Cruz-contaminar os pulmões com a pinça. Enxague com 70% de etanol e seque antes de manusear as fatias do pulmão de um outro grupo experimental.</li>
	<li>Otimizar os parâmetros de imagem (ie. ganho, deslocamento, exposição tempo, binning) que fornece o melhor contraste entre as células tumorais fluorescente e tecido pulmonar de fundo no controle (veículo não tratado) grupo. Use os mesmos parâmetros do grupo controle para os grupos experimentais de imagem. Salve como formato de imagem tiff.</li>
	<li>Para uma referência de escala, tire uma foto digital de um micrômetro no mesmo objetivo.</li>
	<li>Desde que o pulmão autofluorescência muda ao longo do tempo, os parâmetros de imagem devem ser ajustados para os pulmões de controle cada sessão de imagens. Os parâmetros de imagem para uma sessão podem não ser necessariamente ideais para sessões de imagens subsequentes.</li>
</ol>Análise de imagem: Nota: As seguintes etapas de processamento de imagem são feitas com ImageJ 1,51 h software pacote 17.
<ol><li>Abra um arquivo de imagem no ImageJ (Figura 3A).</li>
	<li>Subtrair o fundo: processo > fundo subtrair > raio de bola de Rolling (iniciar com 50 pixels), desmarque a opção "Luz de fundo" (Figura 3B).</li>
	<li>Converter a imagem para o formato de 8 bits: imagem > tipo > 8 bits (Figura 3).</li>
	<li>Definir unidades para pixels: imagem > Enter "Pixels" na unidade de comprimento, insira 1 no "Pixel de largura", "Altura do Pixel", "Profundidade do Voxel". Marque a caixa de "Global" para aplicar a imagens subsequentes.</li>
	<li>Usando a ferramenta de seleção Polygon, delinear a forma da fatia inteira do pulmão e determinar a área (pixel2) da fatia total do pulmão. Esse valor será usado para calcular o peso percentual do tumor do pulmão.</li>
	<li>Imagem de limiar: imagem > ajustar > limiar > destacar "Padrão" e "B & W" > use o controle deslizante de limiar a imagem, tal que a maioria das células tumorais é realçada com precisão. Pressionar "Aplicar" irá resultar em uma imagem preto e branca, onde o pulmão é todo preto, e as lesões fluorescentes são brancas (Figura 3D). Pressionar "Aplicar" uma segunda vez irá inverter a imagem onde todas as estruturas fluorescentes agora são formas pretas (Figura 3E).</li>
	<li>Quantificação do número e forma das lesões: Analisar > definir medidas > verificar "Área". Desmarque todas as outras caixas. Analisar partículas > tamanho (pixel2): 0-infinito representa o intervalo de formas que irá enumerar ImageJ. Determine empiricamente a lesão menor que é considerada para ser uma célula de tumor único em imagens de veículo do dia 0. Use a área desta célula de tumor único como o limite inferior para as restantes imagens no conjunto de dados. Para o trabalho apresentado neste artigo, 11 pixel2 é definido como o limite inferior. O trabalho apresentado no vídeo de exemplo, 24 pixel2 é definido como o limite inferior. Deixe o intervalo de "Circularidade" como 0-1. "Show" pode ser definido como "Nada". Alternativamente, se "Mostrar" e "Contornos" é selecionada, é gerado um desenho de todas as formas contornadas. Verificar o "Exibir resultados" para uma janela separada das medições de pop-up. Opcionalmente, ter "Adicionar ao Gerenciador" caixa marcada vai salvar todas as formas quantificadas para um gerente de ROI, que pode ser salvos para referência futura. Depois de pressionar Okey, uma janela de "Resultados" irá aparecer contendo todas as formas enumeradas e medições de área (Figura 3F).</li>
	<li>Copie e cole os dados da janela "Resultados" em uma planilha. Use a função matemática de soma no Excel para somar todas as áreas das Lesões metastáticas para aquela fatia de pulmão particular. Para avaliar o fardo de tumor de pulmão percentual da fatia do pulmão, divida a soma das áreas das Lesões metastáticas pela área total da fatia do pulmão. Este parâmetro também é conhecida como fração de área (A), que é descrita por Underwood 18. Fardo de tumor de pulmão = soma da área de lesão metastática áreas/total da fatia de pulmão</li>
	<li>Calcule o peso do tumor de pulmão para o resto das seções pulmonar no grupo controle e restantes grupos. Sinopse o fardo de tumor pulmonar média por grupo nos dias 0, 3, 7 e 14. Representante widefield fotos fluorescentes de alta e baixa metastáticas OS células de origem humanas crescendo no modelo PuMA em pontos de tempo progressivo são mostradas (Figura 4A). Um gráfico de linha, mostrando a mudança de dobra (normalizada para o dia 0) em fardo de tumor metastático por cento ao longo do tempo é mostrado (Figura 4B).</li>
</ol>4. confocal fluorescência imagem latente do modelo PuMA
Nota: Para a imagem latente confocal, processamento do tecido é semelhante ao que na seção anterior exceto que fatias maiores do pulmão são cortadas (seções transversais completas, 1-2 mm de espessura) para permitir mais ROIs ser fotografada.
Rotulagem de parênquima pulmonar com DAR4M:
<ol><li>Mergulhe as fatias de pulmão em 10 μμM de DAR4M (em HBSS) por 45 min a 37 ° C. DAR4M etiquetas de espécies reativas de nitrogênio dentro das células do pulmão.</li>
	<li>Depois de 45 min. de incubação, lave as fatias de pulmão com HBSS fresco.</li>
	<li>Coloque a fatia de pulmão em um vidro de 35mm-fundo redondo prato e a imagem no microscópio confocal.</li>
	<li>Os parâmetros de imagem para as imagens de exemplo mostrados na Figura 5 estão listados na tabela 5.</li>
	<li>Adquira uma pilha-Z para uma região de interesse. Use a espessura da fatia Z sugerida para amostragem de Nyquist. Um filme representativo de uma pilha 3D mostrando fluorescente verde OS células no tecido pulmonar DAR4M-etiquetado é fornecido no filme 1 e suplementar 1 filme.</li>
</ol>Para as imagens confocal do exemplo mostradas na Figura 5, a sessão de imagem era terminal. Se imagem longitudinal é necessária, o uso de um 2-fóton ou fóton multi equipada LSM microscópio confocal para a imagem latente é aconselhável desde que há menos photodamage para viver tecidos19,20. Imagem latente mito-RFP expressando MG63 células no modelo PuMA:
<ol><li>Execute o protocolo de PuMA como contorno no passo 1 e 2 com o uso de células MG63 expressando a construção do mito-RFP.</li>
	<li>Coloque a fatia de pulmão em um vidro de 35mm-fundo redondo prato e a imagem no microscópio confocal.</li>
	<li>Os parâmetros de imagem para as imagens de exemplo mostrados na Figura 6 estão listados na tabela 6. Um filme representativo de uma pilha 3D mostrando células verde fluorescentes-OS com vermelho fluorescentes mitocôndrias é fornecido em Movie 2 e suplementar Movie 2.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O seguinte artigo técnico descreve alguns aspectos práticos do modelo PuMA em estudar a colonização de pulmão no sistema operacional. Alguns passos críticos no protocolo onde pesquisadores devem tomar cuidado extra incluem o seguinte:
a) canulação da traqueia. A traqueia pode ser facilmente danificada enquanto dissecando o circundante do músculo e do tecido conjuntivo. Além disso, a agulha do cateter pode facilmente ser empurrada através da traqueia. Preste atenção a como o bisel da agulha pen...

Melhorado os resultados para pacientes pediátricos com metástase osteossarcoma (OS) continua a ser uma necessidade crítica de clínicas atendidas 1. Isto ressalta a importância do desenvolvimento de novas terapias de alvo molecular. Chemotherapeutics convencional que a proliferação de células de tumor alvo não provaram para ser eficazes no tratamento da doença metastática e, assim, novas estratégias deve direcionar o próprio processo metastático 2. O atual artigo aborda os aspectos práticos de um tipo relativamente novo de ex vivo modelo metástase do pulmão, o ensaio de metástase pulmonar (PuMA) desenvolvido por Mendoza e colegas3, que fornece uma ferramenta útil na descoberta de novos motoristas moleculares em progressão de metástases pulmonares em OS 4,5. Antes de prosseguir, no entanto, seria prudente tocar brevemente sobre vários modelos atuais de metástase, e como o modelo da PuMA oferece diversas vantagens sobre os convencionais em vitro ensaios.
Modelos mais experimentais usados para estudar a metástase é composto por sistemas in vitro e in vivo que recapitular uma etapa específica ou várias etapas da cascata metastática. Estas etapas incluem: células de tumor 1) migrando longe o tumor primário, 2) intravasation em navios nas proximidades (sangue ou linfático) e trânsito na circulação, 3) prender no site secundário, 4) extravasamento e sobrevivência no local secundário, formação de 5) de micrometastases e 6) crescimento em metástases vascularizados (Figura 1). Modelos in vitro de metástase podem incluir a migração de 2-dimensional (2D) e 3-dimensional (3D) Matrigel invasão os ensaios que são revisados em detalham em outro lugar 6. Para os modelos na vivo , os dois sistemas modelo comumente usados incluem: 1) o modelo espontâneo de metástase é onde um células tumorais são orthotopically injetado em um tipo específico de tecido para formar um tumor local que derrama espontaneamente células metastáticas para locais distantes; 2) o modelo experimental de metástase é onde as células do tumor são injetadas para o vaso sanguíneo montante do órgão alvo. Por exemplo, uma injeção veia cauda dos resultados de células de tumor no pulmão do desenvolvimento metástases5,7,8. Outros modelos experimentais metástase incluem injeção de células de tumor no baço ou veia mesentérica, que resulta no desenvolvimento de metástases hepáticas9,10. Considerações práticas desses modelos na vivo são discutidas em detalhe por Welch 11. Outro modelo na vivo costumava estudar metástase em sarcomas pediátricos é o modelo de implantação de tumor subcapsular renal rim que resulta na formação de tumor local e metástases espontânea para os pulmões 12,13. Uma técnica mais tecnicamente exigente como tele-microscopia intravital pode visualizar diretamente, em tempo real, as interações entre as células do câncer metastático e a microvasculatura de um site metastático (ie. pulmão ou fígado) conforme descrito por MacDonald14 e Entenberg15, ou extravasamento de células de câncer na membrana corioalantoicas como descrito por Kim 16.
O modelo de PuMA é um ex vivo, explante de tecido do pulmão, sistema de cultura fechado onde o crescimento de células tumorais fluorescentes pode ser longitudinalmente observado através de microscopia de fluorescência durante um período de um mês (ver Figura 2A). Este modelo recapitula os estágios iniciais de colonização de pulmão (passos 3 a 5) na cascata metastática. Algumas vantagens principais do modelo PuMA sobre modelos convencionais em vitro são: 1) fornece uma oportunidade para medir o crescimento de células de câncer metastático em um microambiente 3D que mantém muitas características do microambiente do pulmão longitudinalmente em vivo 3; 2) puMA permite ao pesquisador avaliar se a derrubada de um tratamento de gene ou drogas de candidato tem atividade antimetastática no contexto de um microambiente pulmonar 3D; 3) o modelo de PuMA é flexível, com vários tipos de plataformas de microscopia fluorescência (Figura 2B) tais como a microscopia de fluorescência widefield ou microscopia confocal de varredura a laser, exemplos de cada um são mostrados na Figura 2 & D, respectivamente. Este artigo irá discutir como usar o modelo de PuMA para obter dados de imagem longitudinais sobre o crescimento metastático da proteína verde fluorescente melhorada (eGFP)-expressar, células humanas osteossarcoma de alto e baixo metastático (MNNG e HOS células, respectivamente) usando baixa ampliação widefield fluorescência. Exemplos de imagens, uma tintura fluorescente que rotula o parênquima pulmonar e uma proteína fluorescente vermelha repórter genética que rotula as mitocôndrias no so células no modelo PuMA usando microscopia confocal de varredura a laser também são discutidos.

<table><tbody><tr><td>Tabela 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de cultura de células para A-media, B-media e meio completo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>linha celular OS altamente metastática</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>linha celular OS pouco metastática</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td> Linha <td>celular OS altamente metastática N</td> <td>/ A</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>linha celular OS mal metastática</td></tr><tr><td>10X M199 mídia</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Mídia de base para mídia A e mídia B</td></tr><tr><td>Água destilada (esterilizada)</td> <td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Componente de mídia A e B-media</td></tr><tr><td>7,5% solução de bicarbonato de sódio</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Acetato-água de retinol solúvel</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 10X solução concentrada (10000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Componente de A-media & B-mídia, mídia completa.</td></tr><tr><td>Solução de insulina bovina (10mg / ml)</td> <td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Componente de A-media & Meio B</td></tr><tr><td>DMEM, alto teor de glicose</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Meio de base do meio completo</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Componente do meio completo</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Componente do meio completo</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Usado em cultura de células.</td></tr><tr><td>Hank' s Solução de sais tamponados, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Usado para ressuspender o pellet celular antes da injeção</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Usado em cultura de células.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Usado para marcar o parênquima pulmonar.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Tabela 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiais para PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal</td><td>LSM Zeiss</td><td>N/A</td><td>Vertical LSM Confocal microscópio</td></tr><tr><td>Zeiss 780 LSM Confocal</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscópio confocal LSM invertido</td></tr><tr><td>Camundongos SCID</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, mulher, idade 6-8 semanas</td></tr><tr><td>Aparelho GelFoam</td><td>Harvard</td><td>59-9863</td><td>Usado como suporte para seções de tecido pulmonar.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Usado durante a insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml com agulha de calibre 27</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Usada para injeção na veia da cauda.</td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Usada para insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Cateter de calibre 20</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Usado durante a insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Conjunto de extensão Abbott IV (30", Estéril)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Usado durante a insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Cotonetes com álcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td>Para limpar a veia da cauda antes da injeção</td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Fisherscientific</td><td>Varia com o tamanho</td><td>Manuseio ascético de pulmões de camundongo</td></tr><tr><td>Régua de 30 cm</td><td>Grampos</td><td></td><td>Usado para insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Suporte para régua</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Usado para insuflação do pulmão.</td></tr><tr><td>Placa de cultura com fundo de vidro de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Utilizada durante a obtenção de imagens de fatias pulmonares</td></tr><tr><td>Almofadas absorventes com barreira de humidade à prova de água</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Utilizada para revestir a área de trabalho estéril na capa biológica.</td></tr><tr><td>Sutura Absorvível Catgut Plain</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Usado para amarrar a traqueia canulada.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Tabela 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos para PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura de Dissecação 3.5" Reta Afiada</td>/<td>Afiada Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Para cortar seções pulmonares</td></tr><tr><td>de 4" (10 cm) Ponta Extra Delicada Longa Serrilhada Reta 0.5mm Roboz</td><td></td><td>RS-5132</td><td>Para manipular/segurar seções pulmonares.</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Curva ligeira serrilhada longa 0.8mm Ponta</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Para manipular/guardar seções pulmonares.</td></tr><tr><td>Pinça de Curativo de Polegar; Serrilhada; Delicado; 4,5" de comprimento; Largura da ponta de 1,3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Para dissecção geral.</td></tr><tr><td>Pinça de Curativo de Polegar 4.5" Serrilhada 2.2 mm Largura da Ponta</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Para dissecção geral.</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação Micro Extra Fina 3.5" Reta Afiada/Afiada, lâmina de 20mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>Para dissecação geral.</td></tr><tr><td>Tesoura Knapp; Reto; Afiado-contundente; Comprimento da lâmina de 27mm; 4" Comprimento Total</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>Para dissecção geral.</td></tr></tbody></table>

considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

O ensaio de metástase pulmonar (PuMA) é um ex vivo explante de pulmão e o sistema de cultura de célula fechada que permite aos pesquisadores estudar a biologia da colonização de pulmão no osteossarcoma (OS) por microscopia de fluorescência. Este artigo fornece uma descrição detalhada do protocolo e discute exemplos de obtenção de dados de imagem em crescimento metastático usando widefield ou plataformas de microscopia de fluorescência confocal. A flexibilidade do modelo PuMA permite que os pesquisadores a estudar não só o crescimento de células do sistema operacional no microambiente do pulmão, mas também para avaliar os efeitos da terapêutica antimetastático ao longo do tempo. Microscopia confocal permite sem precedentes, de alta resolução de imagem de interações de celular so com o parênquima pulmonar. Além disso, quando o modelo de PuMA é combinado com corantes fluorescentes ou repórteres genética de proteína fluorescente, pesquisadores podem estudar o microambiente pulmonar, estruturas celulares e subcelulares, função do gene e atividade de promotor em células metastáticas do sistema operacional. O modelo da PuMA oferece uma nova ferramenta para investigadores de osteossarcoma descobrir a nova biologia metástase e avaliar a atividade da novela terapias anti metastáticas, direcionadas.

Microscopia de fluorescência widefield Low-ampliação
Para microscopia de fluorescência widefield de fatias de pulmão PuMA, imagens representativas e quantificação de dados é mostradas na Figura 2e Figura 4A e B. As propensões metastáticos para linhas de alta e baixa metastático célula são visualmente aparentes sobre pontos de t...

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

O objetivo geral deste ensaio de metástase pulmonar é visualizar e estudar diretamente o crescimento de células de osteossarcoma metastático em tecido pulmonar viável. Este método pode ajudar a responder a perguntas realmente importantes no campo da metástase do osteossarcoma. Por exemplo, como as células do osteossarcoma metastático se adaptam, sobrevivem e proliferam no microambiente pulmonar.A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma visualização direta do crescimento celular do osteossarcoma metastático em um microambiente tridimensional relevante. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido às etapas tecnicamente desafiadoras de canular a traqueia e insuflar o pulmão. A injeção de células tumorais na veia da cauda e a eutanásia de camundongos são feitas de acordo com as diretrizes institucionais padrão.Após cinco minutos, coloque o camundongo eutanasiado em decúbito dorsal em uma almofada estéril em uma capa de fluxo laminar e use uma tesoura pequena e estéril para dissecar cuidadosamente o esterno, passando pela entrada torácica em ambos os lados da traqueia, sem perfurar os pulmões. A dissecação de todo o músculo e tecido conjuntivo

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve os procedimentos de um ensaio de metástase experimental que é usado para determinar o potencial metastático de linhagens de células humanas de câncer.

Ensaio Metástase Experimental

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.

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Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

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Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Aqui, uma implantação ortotópica sinténica seguida de um procedimento de amputação do osteossarcoma com metástase pulmonar espontânea que pode ser usada para investigação pré-inlinética da biologia da metástase e desenvolvimento de novas terapêuticas é descrita.

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O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Esse protocolo experimental oferece um método estável, econômico e eficiente que combina knockdown de lncRNA com ensaios formadores de colônias para quantificar o efeito do lncRNA na proliferação celular do osteossarcoma.

Ensaio de Formação de Colônias Detectando a Capacidade Proliferativa de Células de Osteossarcoma por Knockdown de RNAs LncRNA

Aprenda o ensaio de metástase pulmonar para estudar células de osteossarcoma metastático em tecido pulmonar viável. Este método permite visualizar diretamente o crescimento celular em ambiente tridimensional.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

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