Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

O objetivo geral deste ensaio de metástase pulmonar é visualizar e estudar diretamente o crescimento de células de osteossarcoma metastático em tecido pulmonar viável. Este método pode ajudar a responder a perguntas realmente importantes no campo da metástase do osteossarcoma. Por exemplo, como as células do osteossarcoma metastático se adaptam, sobrevivem e proliferam no microambiente pulmonar.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma visualização direta do crescimento celular do osteossarcoma metastático em um microambiente tridimensional relevante. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, devido às etapas tecnicamente desafiadoras de canular a traqueia e insuflar o pulmão. A injeção de células tumorais na veia da cauda e a eutanásia de camundongos são feitas de acordo com as diretrizes institucionais padrão.

Após cinco minutos, coloque o camundongo eutanasiado em decúbito dorsal em uma almofada estéril em uma capa de fluxo laminar e use uma tesoura pequena e estéril para dissecar cuidadosamente o esterno, passando pela entrada torácica em ambos os lados da traqueia, sem perfurar os pulmões. A dissecação de todo o músculo e tecido conjuntivo ao redor da traqueia é essencial para uma canulação bem-sucedida. Em seguida, use um cateter IV de calibre 20 para canular cuidadosamente a traqueia e use uma sutura de categute estéril para prender frouxamente o cateter e a traqueia.

Conecte um conjunto de extensão IV do cateter à seringa de 10 mililitros de um aparelho de profusão por gravidade e despeje agarose líquida a 37 graus Celsius misturada com uma solução média na seringa. Encha os pulmões com a solução de agarose até que estejam totalmente insuflados. Em seguida, remova a cânula e amarre firmemente a sutura para evitar vazamento da solução de agarose.

É importante manter o pulmão intacto durante a insuflação. Uma insuflação adequada com agarose e subsequente resfriamento da arrancada manterá o pulmão em um estado expandido. Colha a decolagem, a traqueia, o coração e o pulmão, tomando cuidado para não perfurar ou danificar a superfície do pulmão.

Coloque os tecidos em 30 mililitros de PBS pré-resfriado suplementado com antibióticos e deixe a agarose solidificar. Coloque a arrancada no gelo por 20 minutos. Após 20 minutos, use uma tesoura fina e uma pinça para cortar o pulmão em pedaços de 3 x 1,5 milímetros e coloque as fatias em poços individuais de uma placa de 6 poços contendo esponjas de gelatina de 2 x 2 centímetros pré-embebidas em meio B.

No dia da imagem, transfira cuidadosamente as fatias de pulmão da placa de 6 poços para uma placa redonda de fundo de vidro estéril de 35 milímetros em colunas de acordo com seu grupo experimental. Em seguida, em um microscópio de fluorescência de campo amplo, selecione a objetiva de 2,5x e defina os parâmetros de imagem para fornecer o melhor contraste entre as células tumorais fluorescentes e o tecido de fundo não fluorescente no grupo de amostra de tecido controle. Visualize todas as amostras usando os mesmos parâmetros dos tecidos de controle.

Se o software não estiver calibrado em escala, crie uma imagem de um micrômetro usando a mesma objetiva do tecido pulmonar para obter uma referência de escala e salve todas as imagens como arquivos tif. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, para analisar as imagens no ImageJ, abra o primeiro arquivo. Use a ferramenta de seleção de polígonos para delinear toda a fatia de pulmão para determinar a área da fatia total de pulmão.

Selecione o processo e subtraia o plano de fundo. Defina o raio da bola rolante para um valor inicial de 50 pixels. Esse valor dependerá do grau de fluorescência de fundo e deve ser otimizado para cada conjunto de dados.

Certifique-se de desmarcar o fundo claro. Selecione a imagem e o tipo, 8 bits, depois a imagem e as propriedades, insira os pixels. Em unidade de comprimento, insira 1 para a largura do pixel, a altura do pixel e a profundidade do voxel.

Em seguida, marque global para aplicar esses parâmetros a todas as imagens subsequentes. Em seguida, selecione a imagem, ajuste e limite. Realce o padrão e preto e branco e use o controle deslizante para limitar a imagem para que a maioria das células tumorais seja destacada com precisão.

Clique em aplicar uma vez para tornar o pulmão preto e as lesões fluorescentes brancas. Em seguida, clique em aplicar uma segunda vez para inverter a imagem para que todas as estruturas fluorescentes fiquem pretas. Para quantificar o número e a forma das lesões, selecione analisar e definir medidas e verificar a área.

Desmarque todas as outras caixas. Em seguida, selecione analisar partículas e, no campo de tamanho, use a área da menor lesão determinada como uma única célula pelo ImageJ, para definir o intervalo de formas que o programa irá enumerar. Use uma imagem do grupo de veículos do dia zero para escolher a menor área que é considerada uma única célula tumoral.

Quando o limite inferior tiver sido definido, clique em OK. Uma janela de resultados aparecerá contendo todas as formas enumeradas e medidas de área. Em seguida, copie e cole os dados da janela de resultados em uma planilha e use a função matemática de soma para adicionar todas as áreas das lesões metastáticas para essa fatia de pulmão específica.

As propensões metastáticas para linhagens celulares metastáticas altas e baixas são visualmente aparentes em pontos de tempo progressivos. Mais especificamente, essas imagens de microscopia mostram como as células altamente metastáticas são capazes de colonizar o pulmão com mais eficiência do que as linhas celulares com baixa metastática. A análise de imagem, quantificação e análise estatística dos dados de imagem confirmam que células tumorais altamente metastáticas podem colonizar eficientemente o tecido pulmonar.

Considerando que as células metastáticas baixas não podem crescer. A microscopia de fluorescência confocal de alta ampliação permite a visualização das células do parênquima pulmonar com grande detalhe espacial em comparação com as células tumorais que expressam EGFP. Além de facilitar a análise de estruturas subcelulares, como essas mitocôndrias.

Dependendo do número de ratos usados, essa técnica pode ser concluída em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar com equipamentos cirúrgicos limpos e estéreis. Após seu desenvolvimento, a técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer explorarem a progressão da metástase nos pulmões de camundongos.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de cultura de células in vitro e western blotting, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os efeitos do knockdown genético ou do tratamento medicamentoso nas células cancerígenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de metástase pulmonar. Não se esqueça de que trabalhar com células cancerígenas humanas pode ser extremamente perigoso e que precauções como trabalhar em um laboratório de segurança de nível biológico devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.