Name: Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a preparar fatias frescas de retina de zebrafish para imagem ao vivo de biosensores fluorescentes. Este método permite estudar dinâmica de cálcio em tipos celulares específicos da retina.

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Agradecemos Ralph Nelson e Daniel Possin pensativa orientação durante o desenvolvimento deste protocolo e Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton para geração de linhas de zebrafish transgênicos estável. O trabalho foi apoiado pela NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 de W.C. e M.G. e EY026020 de J.H. e S.B.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Washington institucional Animal cuidados e Comissão de utilização.
1. preparar o equipamento e animais
Nota: O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma folha escura de tecido circundante fora da retina cuja pigmentação pode obscurecer as características da retina e danificar o tecido quando confocal de imagem ex vivo. Na escuridão, o RPE de zebrafish está retraída longe da retina; escuridão se adaptar peixe para facilitar a futura remoção do RPE da retina antes de fatiar e a imagem latente.
<ol><li>Transferir peixes de um tanque de desova, cheio de água de peixes e, em seguida, enrole o tanque de desova com tecido escuro ou colocá-lo em um armário escuro.<ol>
<li>Escuridão se adaptar zebrafish pelo menos 1 h antes da eutanásia para permitir a separação completa do RPE da retina. adaptação de escuro 30 min é suficiente para remover a maioria dos RPE, embora partes dela podem permanecer intercalados entre fotorreceptores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derreter ~ 15 mL de petróleo de geleia em um copo de 50 mL em um prato quente e em seguida, desenhe 3 mL do líquido em uma seringa de ponta de 3 mL de deslizamento. Inverter a seringa, coloque em um tubo de ensaio de rack e permitir vaselina esfriar.</li>
	<li>Fazer uma câmara de corte reutilizável em uma corrediça do microscópio simples 7 X 2,5 cm.<ol>
<li>Usando esmaltes claros, pintura de linhas estreitas para criar um retângulo de 3 X 2,5 cm no centro do slide, deixe-a secar e em seguida, adicione outra camada de esmalte para as linhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a imagem escadas em lamínulas para segurar fatias durante a imagem latente. As fatias irão formar os "degraus" da escada.<ol>
<li>Para imagens estáticas ou experimentos de injeção com fluxo mínimo de solução, fazer escadas de vaselina, consistindo de duas tiras plana larga paralelas da vaselina em 18mm lamínulas de vidro quadrado. Usar a seringa para aplicar dois achatados ~ esfregaços longo de 1cm da refrigeração vaselina 0,5 centímetros distante na lamínula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pronto o cortador de tecido.<ol>
<li>Limpar uma lâmina de barbear de borda duplo com etanol e deixe-o ar seco. Corte em quartos à tesoura, primeiro longitudinalmente em metades, em seguida, através de cada lâmina.</li>
		<li>Coloque a câmara de corte no palco do cortador de tecido, centralizá-lo horizontalmente no palco e marcar uma borda longa com marcador permanente para alinhamento.</li>
		<li>Carregar uma seção da lâmina sobre o braço do cortador de tecido, assegurar que a lâmina encontra-se plana e centrado no slide sem tocar o lustrador de prego e, em seguida, aperte suavemente o aparelho de lâmina. Menor o braço de lâmina, ajustando o botão ¼ virar, então lugar um pedaço de papel de filtro no centro da câmara de imagem e teste cortá-la. Se o papel não é cortar totalmente, remonte a lâmina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a seringa, coloque um pequeno ponto da refrigeração vaselina em um prato de Petri de 10 cm ~ 1,5 cm à direita do centro. Pressione uma escada de imagens nele usando fórceps com geleia de petróleo para cima. Faça outro ponto pequeno vaselina ~ 1 cm da borda da câmara de imagem de entrada.</li>
	<li>Encaixe a seringa de vaselina com uma agulha 20g e destampe-lo. Segure a agulha na seringa e usá-lo para fazer duas tiras de 1 cm paralelo longas e finas de vaselina longitudinalmente no centro da câmara de corte. As tiras do espaço ~ 1 centímetros distante.</li>
	<li>Fazer uma ferramenta de laço do fio reutilizáveis olho envolvendo o centro de um ~ fechado de segmento de 4 cm de fio de tungstênio 30g em torno de um par de pinças uma vez firmemente. Ajustar o diâmetro do loop deslizando o fio para cima ou para baixo a pinça até é um pouco maior que um olho de peixe-zebra, tipicamente ~ 2-3 mm. torça as extremidades do fio e fixe-os à extremidade de uma vara de madeira de 6 cm, usando fita de laboratório.</li>
	<li>Prepare a solução de Ringer.<ol>
<li>Descongelar 50 X suplemento solução estoque (tabela 1) e adicioná-lo fresco, solução de Ringer tampão HEPES, não-bicarbonato (tabela 2) pela manhã do experimento; Dilua 200 µ l de solução-mãe de suplemento em cada 10 mL de solução de Ringer em um tubo de centrifuga conico ou frasco de vidro estéril. Experiências de imagem estáticas, prepare pelo menos 30 mL de solução de Ringer por experiência. O volume de solução de Ringer, necessário para as experiências de perfusão dependerá da taxa de fluxo e tempo total de experiência.</li>
		<li>Verificar que o pH da solução completada é 7,4 usando uma sonda de pH digital ou papel de pH e ajustar conformemente com diluir NaOH ou HCl.</li>
		<li>Oxigenar a solução de Ringer complementado no gelo por borbulhamento com gás de oxigênio 100% pelo menos 5 min, usando um tanque de oxigênio médico padrão e regulador equipado com uma mangueira ou um tubo borbulhador de gás opcional usado para perfusão. Armazenar a solução de Ringer oxigenado no gelo em um tubo de centrifuga conico selado ou frasco de vidro estéril perto o microscópio de dissecação; Use esta solução para dissecação, imagem latente e para diluir corantes ou agentes farmacológicos.</li>
		<li>Se outras soluções estão sendo usadas no experimento, tais como at+-livre solução de Ringer (tabela 3), repita as etapas 1.9.1.-1.9.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolher os pratos de Petri, pinças, microtesoura e outras ferramentas perto o microscópio de dissecação e preparar um banho de gelo de água de peixes para eutanásia zebrafish.</li>
</ol>2. preparar fatias da retina (ver Figura 1)
<ol><li>Trabalhando sob luz ambiente vermelha para minimizar a adaptação de luz (o que pode fazer a vara RPE mais firmemente para a retina), eutanásia zebrafish por imersão no banho de gelo até toque de resposta é perdida, geralmente 1-2 min. Transfira o peixe para um prato de Petri e usar um bisturi para cervically deslocar mas não decapitar o peixe.</li>
	<li>Use o laço de fio para soltar o tecido conjuntivo ao redor de um olho e então puxe o olho para a frente suavemente com o loop em uma mão. Usando microtesoura na outra mão, corte o nervo óptico branco sob o olho, tomando cuidado para não cortar a parte de trás do olho.</li>
	<li>Transferir o olho usando fórceps para uma placa de Petri de solução de Ringer frio no gelo e repita para o segundo olho. Mantenha os olhos no escuro ou sob luz vermelha até o RPE é removido da retina.</li>
	<li>Disse as viseiras sob um microscópio de dissecação de baixa potência em uma gota de solução de Ringer frio em um slide de vidro liso em uma placa de Petri.<ol>
<li>Perfurar a córnea com pinça fina e, em seguida, delicadamente remova pedaços de clear, quebradiça córnea e esclera prateada com pinças ou tesouras. Remova e descarte a lente e a maior parte da esclera (ver figura 1A) e lidar com a viseira isolada minimamente.</li>
		<li>Pedaços de gordura, pequenos pedaços de esclera e RPE preto podem permanecer ligados a viseira e removido depois da retina. Se a retina separa o RPE na etapa 2.4.1, prossiga com as mesmas etapas usando o cuidado extra para não danificar o delicado retina isolada.</li>
		<li>Posicione o lado aberto viseira para baixo (RPE acima) no slide e corte em terços ou quartos com uma lâmina de barbear de borda única fresco com um movimento (ver figura 1B). Descarte os pedaços de tecido que são altamente curvados.</li>
	</ol></li>
	<li>Apartamento Monte retina no papel de filtro.<ol>
<li>Molhe um pedaço de papel de filtro com solução de Ringer e colocá-lo no slide ao lado as peças de viseira. Use pinça plana ao manusear o papel de filtro molhado intacto para Evite puncioná-la. Adicione a solução de Ringer frio para cobrir o papel de filtro e o tecido.</li>
		<li>Usar o fórceps em cada mão, cuidadosamente arraste o filtro de papel por baixo de cada peça ocular com o RPE e fotorreceptores virada para cima, ou seja, com a parte de trás do olho virado para cima. Posicionar as peças de viseira em uma única linha ao longo do centro do filtro de papel (ver Figura 1). Lidar com as peças de viseira suavemente com a pinça bem perto de uma borda ou um canto.</li>
		<li>Para ajudar as retinas aderir o papel de filtro, coloque o papel de filtro molhado sobre uma toalha de papel seca por 3 s para a umidade para baixo, mas não deixe o tecido tornar-se seco. Repita até que as peças de viseira deite-se do papel de filtro. Aplicar sucção suave na parte inferior do filtro de papel ajuda a achatar a retina, mas este passo não é essencial.</li>
	</ol></li>
	<li>Se lençóis pretos de RPE permanecem sobre as peças de ocular, usar pinça fina para suavemente descascá-lo fora a partir de um canto (ver Figura 1), enquanto que o tecido está sentado em uma gota de solução de Ringer. Deve a retina decolar o papel de filtro, repito a etapa wicking 2.5.3. A retina pode aparecer rosa devido a pigmentos visuais crus.</li>
	<li>Repita a dissecção de retina e plano de montagem passos no 2.4-2.6 para o segundo olho, se desejado, mantendo a primeira retina plano montado imergida em solução de Ringer frio. Para simplificar o procedimento de corte, peças de ambas as retinas podem ser colocadas em um papel de filtro. Uma vez que o RPE foi removido, o protocolo pode será efectuado sob a luz do quarto normal salvo experimentos necessitam de escuridão.</li>
	<li>Coloque o papel de filtro em um slide e apará-lo em um retângulo com uma lâmina única borda, deixando ~ 0,5 cm do papel de filtro em ambos os lados da linha de retina. Mover o papel de filtro para a câmara de corte preparada, empurrar as bordas do papel de filtro longo para as linhas finas geleia de petróleo usando fórceps e mergulhe as retinas em 3-4 gotas de solução de Ringer frio. Nota: Alguns corantes, tais como corantes lipofílicos, melhor são carregados em montagens planas nesta fase antes de fatiar. Estas podem ser carregadas, ímpios fora com um tecido e lavadas na câmara de corte. Por exemplo, C12 558/568 BODIPY intensamente manchas na retina de células fotorreceptoras exterior segmentos (ver Figura 4A) e membranas quando carregado no ~ 5 µ g/mL para 15 min à temperatura ambiente (normalmente 23-27 ° C), seguido por uma lavagem em solução de Ringer em excesso .</li>
	<li>Transferência da câmara de corte para a fase de cortador de tecido, posicione a borda longa ao longo da linha marcada e prenda as extremidades da câmara para o palco com fita de laboratório. Começando em uma extremidade, corte a retina e exercendo uma pressão firme, suave no braço do corte de papel de filtro. Verifique se a primeira fatia foi cortada completamente, então use o micrômetro para cortar ~ 400 µm de fatias.</li>
	<li>Monte a escada de imagem.<ol>
<li>Lugar da câmara corte com seções da retina fatiadas na prato de Petri da etapa 1.7 adjacente para a imagem da escada (ver Figura 1E). Encha o prato com solução de Ringer frio para submergir seu conteúdo.</li>
		<li>Usando fórceps e mantendo fatias submergidas, suavemente transferência de tiras de papel de filtro e retina para a escada deslizando o prato de Petri da esquerda para a direita. Tome cuidado para não tocar as retinas diretamente. Girar as fatias 90° e enterrar as bordas do papel de filtro em vaselina.</li>
		<li>Finamente, posição fatias da retina na escada com fórceps para que camadas da retina são claramente visíveis sob o microscópio de dissecação (ver Figura 1). Para fatias de cada lado da escada, certifique-se de que o tecido é virada para dentro para as outras fatias para minimizar o movimento do tecido durante a injeção ou fluxo. Descartar qualquer fatias da retina que não são bem respeitados para o papel de filtro (ver Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Se desejado, carregar corantes em fatias da retina nesta fase e lave com solução de Ringer em excesso antes da imagem latente. Nota: Iodeto de Propidium (PI) e Hoechst 33342 robustamente mancham núcleos de mortos e de todas as células, respectivamente (ver Figura 2B), quando incubadas com fatias da retina em 5 µ g/mL por 20 min em temperatura ambiente. Diversos (TMRM) acumula-se na mitocôndria ativamente desoxigenada durante todo a retina quando incubados a 1 nM por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Enquanto as fatias são de coloração, prepare o aparelho de imagens de câmara e injeção. Use a seringa para lavar o tubo com solução de Ringer e limpar as bolhas, anexar a extremidade aberta do tubo para a entrada de imagem da câmara e fechar a torneira. Remova a seringa e preenchê-lo com termos para injeção e, em seguida, reconectá-lo para a tubulação.</li>
	<li>Usar fórceps para transferir a lamela com fatias da retina para a câmara de imagem, pressionando a lamela para o ponto de geleia de petróleo perto da borda da entrada da câmara de imagem (consulte a Figura 1 H). Encha a câmara de imagem com solução de Ringer para cobrir as fatias.</li>
</ol>3. imagem latente retinais fatias
<ol><li>Coloque a câmara de imagem preenchida com o aparelho conectado injeção no palco de um microscópio confocal vertical equipado com uma água de 20 ou 40 X lente de imersão. Fixe a câmara de imagem com clipes de palco.</li>
	<li>Abaixe a lente de imersão sobre a escada e focar uma fatia em uma extremidade da escada sob luz fraca trans-iluminado. Examine cada fatia para orientação transversal, presença de segmentos exteriores fotoreceptor e adesão seguro para o papel de filtro.</li>
	<li>Selecione a melhor fatia para a imagem latente de lapso de tempo e configurar o software de microscópio para aquisição de imagens de lapso de tempo. A tabela 4 descreve as configurações típicas de imagem para vários marcadores fluorescentes e corantes. Nota: A taxa de aquisição de imagem pode variar dependendo do microscópio, marker(s) fluorescente e processo biológico em estudo. Por exemplo, use a resolução de 800 x 800 pixels, 2 µs/pixel scan velocidade e uma taxa de quadros de 10-s para imagem dinâmica do cálcio em fotorreceptores com GCaMP3 e um corante vermelho.<ol>
<li>Se estiver disponível, use o software para rastrear Marcos físicos em fatia (segmentos exteriores fotoreceptor, corpos celulares, núcleos) para auxiliar a reorientação potencial durante o lapso de tempo. Também configurar o software para monitorar em tempo real da fluorescência do outro lado da fatia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Begin fluorescência de base de imagem e monitor. Quando fluorescência em toda a fatia estabiliza (normalmente dentro de 2-5 min), prosseguir com o experimento. Para injeção, abra a torneira de seringa, então lentamente prima e retiraram-se sobre o êmbolo duas vezes para auxiliar a mistura. Nota: por exemplo, aboli a função mitocondrial pela injeção de uma solução concentrada do protonophore CCCP para atingir uma concentração final de 1 µM na câmara de imagens. Isto induz um robusto Ca2 + estourar no citosol fotorreceptoras relatado por GCaMP, em seguida, uma diminuição constante no potencial de membrana mitocondrial, relatado por TMRM.</li>
	<li>Estreitamente monitorar fatias para drift durante o experimento e usar o software para fazer microajustes de acordo com Marcos físicos. Normalmente deriva na direção Z durante a injeção ou perfusão é < 5 µm.</li>
</ol>4. a imagem da retina fatias durante experimentos de perfusão onde as soluções são alteradas ou fluiu continuamente
Nota: Imagem retinal fatias durante experimentos de perfusão onde as soluções são alteradas ou fluiu continuamente é semelhante a configuração para experimentos de imagem ou injeção estáticas, com as seguintes modificações.
<ol><li>Em vez de escadas de vaselina descritas na etapa 1.4, use escadas de cera mais resistentes para prender fatias da retina constante durante o fluxo de solução.<ol>
<li>Coloque dois pequenos cilindros paralelos de cera dental sem sabor ~ 0,5 cm de distância em uma lamela. Sobre uma superfície plana, use o polegar para pressionar cada cilindro baixo e para fora em direção a borda paralela da lamela. Marcar os dois cilindros achatados horizontalmente com uma lamela #1 (ver Figura 1E, lado direito) em seguida manchar uma camada fina de vaselina entre as tiras de cera com uma espátula.</li>
		<li>Ao montar a escada de imagem na etapa 2.10.2, pressione as bordas do papel de filtro cortado dentro os escores de cera usando pinça fina (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para configurar para perfusão na etapa 2.12, encha a seringa reservatórios com soluções preoxygenated, ou use um tubo de gás opcional para oxigenar soluções em cada reservatório. Liberar todos os tubos com solução de Ringer, certifique-se de que todas as linhas de fluxo quando abriu e expurgar grandes bolhas.</li>
	<li>Antes de encher a câmara de imagem na etapa 2.13, use a seringa para colocar outro ponto de vaselina sobre cada canto exposto da lamela para impedi-lo de deslizar lateralmente durante o fluxo.</li>
	<li>Quando a câmara de imagem é cheio e montada na fase de microscópio, ligue o aspirador e conecte o tubo do aspirador. Testar o fluxo de solução de Ringer e usar o micropositioner para situar o tubo aspirador pela câmara de vazão para que pequenas quantidades de líquido são desenhadas antes que a câmara estouros (tipicamente ~ 1 mm acima da superfície da solução para uma taxa de fluxo de 2 mL/min). Manter a solução de Ringer fluindo enquanto seleciona fatias no passo 3.4.</li>
	<li>Para realizar o experimento no passo 3.4 para perfusão, alternar o fluxo de soluções, fechando a torneira de passagem da primeira solução durante a abertura da segunda solução.<ol>
<li>Por exemplo, para esgotar extracelular at+ da câmara de imagem, use dois reservatórios de seringa preenchidos com solução de Ringer ou nd+-livre solução (tabela 3). Fluxo de solução de Ringer para estabelecer a linha de base e, em seguida, alternar para at+-livre de solução. Isso resulta em grande citosólico Ca2 + aumenta em segmentos exteriores fotoreceptor e corpos celulares (ver Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para sistemas de perfusão de gravidade-alimentado, monitore o nível da solução em cada reservatório, assim a taxa de fluxo é constante durante a imagem latente. Acima de reservatórios conforme necessário com soluções oxigenadas, ou manter o oxigênio contínuo borbulhando com um tubo de gás.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Ex vivo por imagens do zebrafish frescos fatias da retina tem provado para ser uma ferramenta versátil para estudar fotorreceptoras biologia20,21,22e é o única que permite a análise de células individuais em um maduro, totalmente diferenciada de retina. Com prática, é possível realizar várias experiências com tecido de um único peixe, mesmo usando seriais fatias da mesma região da retina. Além dos desafios e sugestões r...

O peixe-zebra (Danio rerio) tem-se amplamente utilizado em pesquisa científica básica e médica1, devido ao seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e sistemas de órgãos de vertebrados. A transparência natural das larvas de zebrafish combinada com métodos estabelecidos por transgênese permitiram a visualização detalhada dos processos celulares em um animal vivo. Um número de biosensores fluorescentes geneticamente codificados têm sido alvo de células específicas do zebrafish para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrogênio3, apoptotic ativação4 e ATP5.
Na vivo por imagens do zebrafish larvas conduziu a descobertas no campo da neurociência, incluindo o mapeamento do cérebro circuitos6 e7de distúrbios do desenvolvimento de drogas para o sistema nervoso central. Zebrafish são adequados para a pesquisa de visão porque suas retinas apresentam a estrutura laminar e tipos de neurônio de vertebrados superiores, e eles exibem comportamentos visual robusto8,9. Vários tipos dos degenerations retinais análogos à doença humana foram modelados com sucesso e estudados no zebrafish10,11, incluindo imagens ao vivo de fotorreceptores individuais degenerando dentro de uma retina2, 12.
Enquanto na vivo zebrafish larval imagiologia é uma ferramenta valiosa, torna-se mais desafiador como peixe cresce e desenvolver pigmentação, e alguns tratamentos farmacológicos não podem permear um animal inteiro. Além disso, determinados processos celulares mudam com desenvolvimento e idade, fazendo mais tarde pontos de tempo crítico para a função de compreensão e a progressão da doença em animais adultos. Métodos bioquímicos como immunoblot, quantitativo PCR, O consumo de2 e metabolómica análises podem fornecer pistas importantes sobre a biologia da retina como um todo, mas é difícil discernir contribuições de tipos de células individuais afectados pela doença. Imagem tecido retinal isolada ex vivo ignora essas questões e enquanto imagem plana montado as retinas proporciona uma vista sobre a retina exterior13, características da retina interiores mais profundas são obscurecidas. Fatias transversais da retina, como aqueles apresentados no fixo análises imuno-histoquímica, permitem uma visão clara de todas as camadas e tipos de células, mas apenas oferecem um único instantâneo dos processos dinâmicos envolvidos na doença e função normal.
Aqui, apresentamos um método para gerar ex vivo transversais da retina fatias de zebrafish adulto para a imagem latente. É semelhante aos métodos para a preparação de anfíbios e zebrafish fatias da retina para14,Estudos eletrofisiológicos e morfológicos15, com importantes modificações para o lapso de tempo de imagem ex vivo usando confocal microscopia. Respostas de fluorescência de biosensores ou corantes em fatias são monitoradas em tempo real com um microscópio confocal ao entregar agentes farmacológicos usando a perfusão. Enquanto o método foi desenvolvido por fotorreceptores de imagem, ela pode ser viável usá-lo para a visualização de células Müller, células bipolares, células horizontais, amacrine células ou células ganglionares da retina com marcadores fluorescentes apropriados. Além disso, as fatias podem ser carregadas com corantes fluorescentes de célula-permeável a viabilidade celular de relatório, transporte vesicular, função mitocondrial ou estado de redox. Esta preparação versátil permite a visualização de uma ampla gama de processos subcelulares ao longo da retina, incluindo Ca2 + dinâmica, transdução de sinal e estado metabólico.

<table><tbody><tr><td>peixe-zebra</td><td>Universidade de Washington South Lake Union Aquatics Facility</td><td></td><td>estoques mantidos internamente como linhas transgênicas estáveis</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>para seringa de vaselina</td></tr><tr><td>Seringa de ponta deslizante de 3 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td>para seringa de vaselina</td></tr><tr><td>20g Agulha de ponta deslizante de 3,8 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>para vaselina seringa</td></tr><tr><td>simples 7 cm X 2,5 cm lâmina de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>para dissecção ocular, câmara de fatiamento</td></tr><tr><td>Seche Vite esmalte transparente</td><td>Amazon</td><td>B00150LT40</td><td>para câmara de fatiamento</td></tr><tr><td>18 mm X 18 mm #1 lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>para escadas de imagem</td></tr><tr><td>cera dental sem sabor</td><td>Amazon</td><td>B01K8WNL5A</td><td>para escadas de imagem</td></tr><tr><td>lâminas de barbear de dupla borda</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td>para fatiamento de tecido fatiador de</td></tr><tr><td>tecido com micrômetro digital</td><td>Stoelting</td><td>51415</td><td>para papel de filtro de fatiamento de tecido</td></tr><tr><td>- celulose mista gradeada branca, 13 mm de diâmetro, 0,45 &micro; tamanho de poro</td><td>m EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>papel de filtro para montagem de retinas</td></tr><tr><td>placa de Petri de 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>para eutanásia de peixes, dissecação, montagem de escada de imagem</td></tr><tr><td>15 cm aplicador de madeira de ponta lisa Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-400-112</td><td>para ferramenta de laço de olhal de fio</td></tr><tr><td>30g (0,25 mm de diâmetro) fio de tungstênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>para ferramenta de laço de olho de fio</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>componente de solução de estoque de</td></tr><tr><td>suplemento L-lactato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td>componente de solução de estoque de suplemento</td></tr><tr><td>piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>componente de solução de estoque de suplemento</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G3126</td><td>componente de solução de estoque de suplemento</td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutationa, reduzido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>componente da solução estoque do suplemento</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>componente da solução estoque do suplemento</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>componente da solução de Ringer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>componente da solução</td></tr> <tr><td>de RingerCaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>componente da solução de Ringer</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>componente da solução de Ringer</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M0250</td><td>componente da solução de Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Componente Aldrich</td><td>H3375</td><td>da solução de Ringer</td></tr><tr><td>Base Tris Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP152</td><td>componente de solução de Ringer livre de Na+</td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-063</td><td>componente de solução de Ringer livre de Na+-free</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>componente de solução de Ringer livre de Na+ solução de Ringer</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 50 mL</td><td>Recipiente Denville Scientific</td><td>C1062-P</td><td>para solução de Ringer</td></tr><tr><td>Tesoura Vannas - lâminas angulares de 5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td>micro-tesoura para dissecção da ocular</td></tr><tr><td>Pinças suíças - #5, 11 cm, retas, pontas de 0,06 X 0,07 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>pinça fina para dissecção da ocular e manipulação de fatias</td></tr><tr><td>lâminas de barbear de borda única</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>para dissecção da ocular e aparar papel de filtro</td></tr><tr><td>EMD Pinça de filtro Millipore</td> Pinça plana <td>XX6200006P</td><td>Fisher Scientific</td><td>para manuseio de papel de filtro úmido</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>cora núcleos de células vivas; incubar 5 e micro; g/mL por 15 min à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>iodeto de propídio (PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>cora núcleos de células mortas; incubar 5 &micro; g/mL por 20 min em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>cora núcleos de células vivas; incubar 5 &micro; g/mL por 20 min à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>cora mitocôndrias funcionais, carregadas negativamente; incubar 1 nM por 30 min em câmara</td></tr> de <tr><td>perfusão tecidual</td> à temperatura ambiente Câmara de imagem <td>[-SY]Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV para</td> <td>injeção ou perfusão</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-Desoxiglicose (NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td><td>fluorescente glicose análogo administrado oralmente ao peixe-zebra 30 min antes da eutanásia</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser Olympus</td> Microscópio confocal <td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>para visualização de fluorescência de fatias com resolução de célula única</td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td>reagente experimental que elimina a respiração mitocondrial; trate as fatias até uma concentração final de 1 &micro; </td></tr><tr><td>M posicionador de aspirador miniatura</td><td>Cell MicroControls</td><td>FL-1</td><td>para coletor de perfusão</td>de</tr><tr><td>perfusão, coletor de borbulhador de gás, válvula de fluxo, suporte de seringa de 60cc</td><td>Warner Instruments</td><td>vários</td><td>para perfusão</td></tr></tbody></table>

prepara frescas fatias da retina de adultos do zebrafish para ex vivo experimentos de imagem

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

A retina é um tecido complexo que inicia e integra os primeiros passos da visão. Disfunção das células da retina é uma marca registrada de muitas doenças ofuscante, e terapias futuras dependem de entendimentos fundamentais sobre como diferentes da retina células funcionam normalmente. Ganhar essa informação com métodos bioquímicos provou difícil porque as contribuições dos tipos de célula específica são diminuídas no meio de células da retina. Imagem da retina ao vivo pode fornecer uma visão dos numerosos processos biológicos em nível subcelular, graças a um número crescente de biosensores fluorescentes geneticamente codificados. No entanto, esta técnica tem sido limitada a girinos e larvas de peixe-zebra, as camadas da retina ultraperiféricas da retina isolada, ou imagens de resolução mais baixa da retina em animais vivos. Aqui nós apresentamos um método para gerar ao vivo ex vivo da retina fatias de adultos do zebrafish para geração de imagens ao vivo através de microscopia confocal. Esta preparação rende fatias transversais com todas as camadas da retina e a maioria dos tipos de células visíveis para a realização de experimentos de imagiologia confocal usando a perfusão. Zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes ou biossensores em tipos específicos de células da retina ou organelas são usados para extrair informação de célula única de uma retina intacta. Além disso, as fatias da retina podem ser carregadas com corantes fluorescentes indicador, adicionando à versatilidade do método. Este protocolo foi desenvolvido para imagem Ca2 + dentro do zebrafish cones fotorreceptores, mas com marcadores adequadas poderia ser adaptado para medir Ca2 + ou metabolitos em células Müller, células bipolares e horizontais, micróglia, células de amacrine ou da retina células ganglionares. O epithelium retinal do pigment é removido do fatias assim que este método não é adequado para estudar esse tipo de célula. Com prática, é possível gerar seriais fatias de um animal para múltiplas experiências. Esta técnica adaptável fornece uma ferramenta poderosa para responder às muitas perguntas sobre biologia celular da retina, Ca2 +e homeostase de energia.

Posicionamento estável e orientação transversal de fatias são chave para o sucesso de imagem com injeção ou perfusão de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine e reposicionar fatias antes da imagem latente confocal conforme necessário para garantir que todas as camadas da retina são visíveis (Figura 2A, fatia ii). Se uma fatia é girada ligeiramente para a frente (Fig. 2A, fatia iii), feixes de segmentos exteriores será vis...

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias frescas de retinas de peixe-zebra para experimentos que requerem imagens ao vivo de proteínas fluorescentes ou biossensores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa da visão, como os papéis fisiológicos e metabólicos dos íons de cálcio em tipos específicos de células e compartimentos celulares dentro de uma retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações espaciais e temporais sobre os principais metabólitos e moléculas de sinalização em tecidos vivos.Para tornar possível remover o epitélio pigmentar da retina, ou RPE, do peixe-zebra, adapte o peixe por uma hora antes de fazer fatias de tecido. Para uma câmara de fatiamento, pinte linhas de esmalte em um slide. Usando esmalte transparente, pinte linhas estreitas para criar um retângulo.Repinte o polidor uma vez quando estiver seco. Se a câmara for usada para imagens estáticas ou experimentos de injeção com fluxo mínimo de solução, use uma seringa para aplicar duas tiras paralelas de vaselina em uma lamínula, com um centímetro de comprimento e 0,5 centímetros de distância. Agora prepare as lâminas.Primeiro, limpe uma navalha de dois gumes com etanol e deixe secar ao ar. Em seguida, use uma tesoura para cortá-lo em pedaços de aproximadamente um centímetro. Em seguida, coloque a câmara de corte no palco do cortador de tecido, centralize-o horizontalmente no palco e marque a borda longa com marcador permanente para alinhamento.Em seguida, carregue um pedaço de lâmina no braço do fatiador. Prenda a lâmina, de modo que a borda fique no meio da corrediça e corra paralela à superfície da corrediça, mas não toque no esmalte. Em seguida, abaixe o braço da lâmina usando um quarto de volta.Agora, tente fatiar papel de filtro. Remonte a lâmina, se necessário. Para prosseguir, usando a seringa, deposite um único e pequeno ponto de geléia em um prato de 10 centímetros, a cerca de 1,5 centímetros do ponto médio.Em seguida, pressione o lado seco de uma lamínula na geléia usando uma pinça. Em seguida, coloque outro pequeno ponto de gelatina a cerca de um centímetro da borda de entrada da câmara de imagem. Agora, use uma agulha de calibre 20 para fazer duas tiras paralelas finas de um centímetro de comprimento de vaselina longitudinalmente ao longo do centro da câmara de corte com cerca de um centímetro de distância.Em seguida, transfira o peixe-zebra para um prato e desloque o peixe cervical sem decapitação. Agora, use um laço de arame para soltar o tecido conjuntivo ao redor de um olho e, em seguida, puxe o olho para a frente suavemente. Em seguida, corte cuidadosamente o nervo óptico branco sob o olho usando uma microtesoura, mas não corte a parte de trás do olho.Para prosseguir, transfira o olho para um prato de solução fria de Ringer no gelo. Em seguida, colha o outro olho. Continue trabalhando sob luz vermelha até que todo o RPE seja removido.Em seguida, transfira um olho para uma gota de solução fria de Ringer em uma lâmina de vidro em uma placa de Petri. Em seguida, coloque o prato sob um microscópio de dissecção de baixa potência para dissecar a ocular sob luz vermelha. Primeiro, perfure a córnea com uma pinça fina.Em seguida, use fórceps e tesouras para remover suavemente pedaços de córnea quebradiça clara e esclera prateada. Em seguida, remova e descarte a lente e a maior parte da esclera para isolar a ocular. Com o mínimo de manuseio, remova todos os pedaços de gordura e esclera que permanecem presos à ocular sem remover a retina.Se a retina se separar do EPR, proceda com cuidado extra para evitar danificar a retina delicada. Agora, reposicione a ocular com o lado aberto para baixo e corte-a em terços ou quartos com uma nova lâmina. Descarte os pedaços de ocular que estão muito curvos para serem achatados.Essas peças geralmente são pequenas demais para serem úteis em qualquer caso. Para montar as seções de retina, molhe um pedaço de papel de filtro com solução de Ringer e use uma pinça plana para colocá-lo próximo às peças da ocular. Em seguida, mergulhe o papel de filtro e os lenços de papel na solução de Ringer fria.Em seguida, use uma pinça para posicionar os pedaços de retina em cima do papel de filtro com o EPR e os fotorreceptores para cima. Manuseie suavemente as bordas das peças do copo ocular com uma pinça fina para orientá-las em uma única linha no centro do papel de filtro. Agora alise a retina usando uma pinça para levantar o papel de filtro com a retina presa e colocando-o em uma toalha de papel seca.Por cerca de três segundos, deixe a força da absorção de líquido na toalha de papel achatar a retina. Processe todas as peças da retina dessa maneira, mas não as deixe secar. Agora, aplique uma gota da solução de Ringer e use uma pinça fina para retirar quaisquer folhas pretas restantes de EPR do tecido.Descasque suavemente e, se a retina se soltar do papel, retire mais solução como antes e ela deve achatar novamente. Agora transfira o papel com pedaços de retina para uma lâmina e corte o papel em um retângulo, deixando cerca de 0,5 centímetros de cada lado da fileira de tecido. Em seguida, mova o papel de filtro para a câmara de corte preparada.Empurre as longas bordas do papel de filtro nas linhas finas de vaselina usando uma pinça e, em seguida, mergulhe as retinas em três a quatro gotas de solução fria de Ringer. Primeiro, transfira a preparação para o estágio de fatiador de tecidos. Posicione a borda longa ao longo da linha marcada e prenda as extremidades da câmara ao palco com fita adesiva de laboratório.Em seguida, começando por uma extremidade, corte a retina e o papel de filtro usando uma pressão firme e suave no braço de corte. Verifique se a primeira fatia foi totalmente cortada e, em seguida, use o micrômetro para cortar fatias com aproximadamente 400 mícrons de espessura. Em seguida, transfira a câmara com seções fatiadas para a placa de Petri contendo a lamínula preparada, que servirá como uma escada de imagem.Inunde o prato com solução de Ringer fria e coloque-o no palco do microscópio de dissecação. Agora, sob baixa ampliação, use a pinça para prender uma tira e mova-a para a escada de imagem deslizando a placa de Petri subjacente. Gire as fatias 90 graus e enterre as bordas do papel de filtro na geléia.É importante manter a retina submersa e evitar qualquer contato direto com a retina. Em seguida, reposicione as fatias nas escadas para que as camadas da retina fiquem claramente visíveis. Para as fatias em cada extremidade da escada, faça a retina voltada para dentro em direção às outras fatias para minimizar o movimento durante a injeção ou fluxo.Descarte todas as fatias que não aderirem bem ao papel. Agora, manche o tecido. Enquanto isso, prepare a câmara de imagem e o aparelho de injeção.Primeiro, lave o tubo com a solução de Ringer, até que não haja bolhas de ar. Em seguida, conecte a tubulação à entrada da câmara de imagem e feche a torneira de parada. Em seguida, volte a encher a seringa com a solução injetável e volte a colocá-la no tubo.Agora, use uma pinça para transferir a escada de imagem preparada para a câmara de imagem. Pressione-o no ponto de geléia perto da borda de entrada e encha a câmara com a solução de Ringer para cobrir as fatias. Em seguida, prossiga com a imagem.Usando as técnicas descritas, cortes perfeitamente transversais podem ser visualizados através de todas as camadas da retina. Quando ligeiramente girado, feixes dos segmentos externos serão visíveis. Usando a coloração PI, as células mortas podem ser eliminadas da análise.Os fotorreceptores PI-negativos saudáveis têm uma morfologia estereotipada polarizada alongada. Quando em Ringer oxigenado, eles podem ser fotografados por até quatro horas. Uma estratégia de imagem é visualizar a dinâmica do retículo endoplasmático do fotorreceptor do cone em relação ao núcleo.Usando tecidos que expressam GFP e o cone ER, enquanto contra-coloram com um corante nuclear. Uma estratégia semelhante pode ser empregada para visualizar o citoesqueleto de actina com tecido que expressa actina fundida com GFP. Usando imagens de lapso de tempo, a dinâmica celular, como flutuações citosólicas de cálcio em um fotorreceptor de cone, pode ser observada.Por exemplo, ao esgotar isotonicamente o sódio na câmara de imagem, o GCaMP pode ser usado para visualizar o aumento das concentrações citosólicas de cálcio. Ao quantificar as respostas de fluorescência de segmentos externos de cone único, corpos celulares e sinapses, a dinâmica do cálcio intracelular pode ser determinada durante manipulações farmacológicas e assim por diante. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a luz vermelha antes que o EPR seja removido.Alise cuidadosamente as oculares antes de cortar e mantenha as fatias submersas o tempo todo. Uma vez dominado, a dissecção, o corte e a preparação do tecido para imagens podem ser feitos em menos de 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar fatias de retina de peixe-zebra para estudar o metabolismo e a fisiologia em tipos específicos de células em compartimentos celulares.

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

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A microscopia eletrônica 2D em larga escala (EM), ou nanotomia, é a aplicação em todo o tecido da resolução em nanoescala. Aqui descrevemos um método universal de nanotomia aplicado para investigar o cérebro larval do peixe-zebra na saúde e em lesões cerebrais não invasivas.

Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

Aqui, vamos discutir um protocolo do método que permite uma análise fácil da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida em configurações de longo prazo patologias vasculares relacionadas a neoangiogênese e mudanças estruturais.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Aprenda a preparar fatias frescas de retina de zebrafish para imagem ao vivo de biosensores fluorescentes. Este método permite estudar dinâmica de cálcio em tipos celulares específicos da retina.

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

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