Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias frescas de retinas de peixe-zebra para experimentos que requerem imagens ao vivo de proteínas fluorescentes ou biossensores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa da visão, como os papéis fisiológicos e metabólicos dos íons de cálcio em tipos específicos de células e compartimentos celulares dentro de uma retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações espaciais e temporais sobre os principais metabólitos e moléculas de sinalização em tecidos vivos.

Para tornar possível remover o epitélio pigmentar da retina, ou RPE, do peixe-zebra, adapte o peixe por uma hora antes de fazer fatias de tecido. Para uma câmara de fatiamento, pinte linhas de esmalte em um slide. Usando esmalte transparente, pinte linhas estreitas para criar um retângulo.

Repinte o polidor uma vez quando estiver seco. Se a câmara for usada para imagens estáticas ou experimentos de injeção com fluxo mínimo de solução, use uma seringa para aplicar duas tiras paralelas de vaselina em uma lamínula, com um centímetro de comprimento e 0,5 centímetros de distância. Agora prepare as lâminas.

Primeiro, limpe uma navalha de dois gumes com etanol e deixe secar ao ar. Em seguida, use uma tesoura para cortá-lo em pedaços de aproximadamente um centímetro. Em seguida, coloque a câmara de corte no palco do cortador de tecido, centralize-o horizontalmente no palco e marque a borda longa com marcador permanente para alinhamento.

Em seguida, carregue um pedaço de lâmina no braço do fatiador. Prenda a lâmina, de modo que a borda fique no meio da corrediça e corra paralela à superfície da corrediça, mas não toque no esmalte. Em seguida, abaixe o braço da lâmina usando um quarto de volta.

Agora, tente fatiar papel de filtro. Remonte a lâmina, se necessário. Para prosseguir, usando a seringa, deposite um único e pequeno ponto de geléia em um prato de 10 centímetros, a cerca de 1,5 centímetros do ponto médio.

Em seguida, pressione o lado seco de uma lamínula na geléia usando uma pinça. Em seguida, coloque outro pequeno ponto de gelatina a cerca de um centímetro da borda de entrada da câmara de imagem. Agora, use uma agulha de calibre 20 para fazer duas tiras paralelas finas de um centímetro de comprimento de vaselina longitudinalmente ao longo do centro da câmara de corte com cerca de um centímetro de distância.

Em seguida, transfira o peixe-zebra para um prato e desloque o peixe cervical sem decapitação. Agora, use um laço de arame para soltar o tecido conjuntivo ao redor de um olho e, em seguida, puxe o olho para a frente suavemente. Em seguida, corte cuidadosamente o nervo óptico branco sob o olho usando uma microtesoura, mas não corte a parte de trás do olho.

Para prosseguir, transfira o olho para um prato de solução fria de Ringer no gelo. Em seguida, colha o outro olho. Continue trabalhando sob luz vermelha até que todo o RPE seja removido.

Em seguida, transfira um olho para uma gota de solução fria de Ringer em uma lâmina de vidro em uma placa de Petri. Em seguida, coloque o prato sob um microscópio de dissecção de baixa potência para dissecar a ocular sob luz vermelha. Primeiro, perfure a córnea com uma pinça fina.

Em seguida, use fórceps e tesouras para remover suavemente pedaços de córnea quebradiça clara e esclera prateada. Em seguida, remova e descarte a lente e a maior parte da esclera para isolar a ocular. Com o mínimo de manuseio, remova todos os pedaços de gordura e esclera que permanecem presos à ocular sem remover a retina.

Se a retina se separar do EPR, proceda com cuidado extra para evitar danificar a retina delicada. Agora, reposicione a ocular com o lado aberto para baixo e corte-a em terços ou quartos com uma nova lâmina. Descarte os pedaços de ocular que estão muito curvos para serem achatados.

Essas peças geralmente são pequenas demais para serem úteis em qualquer caso. Para montar as seções de retina, molhe um pedaço de papel de filtro com solução de Ringer e use uma pinça plana para colocá-lo próximo às peças da ocular. Em seguida, mergulhe o papel de filtro e os lenços de papel na solução de Ringer fria.

Em seguida, use uma pinça para posicionar os pedaços de retina em cima do papel de filtro com o EPR e os fotorreceptores para cima. Manuseie suavemente as bordas das peças do copo ocular com uma pinça fina para orientá-las em uma única linha no centro do papel de filtro. Agora alise a retina usando uma pinça para levantar o papel de filtro com a retina presa e colocando-o em uma toalha de papel seca.

Por cerca de três segundos, deixe a força da absorção de líquido na toalha de papel achatar a retina. Processe todas as peças da retina dessa maneira, mas não as deixe secar. Agora, aplique uma gota da solução de Ringer e use uma pinça fina para retirar quaisquer folhas pretas restantes de EPR do tecido.

Descasque suavemente e, se a retina se soltar do papel, retire mais solução como antes e ela deve achatar novamente. Agora transfira o papel com pedaços de retina para uma lâmina e corte o papel em um retângulo, deixando cerca de 0,5 centímetros de cada lado da fileira de tecido. Em seguida, mova o papel de filtro para a câmara de corte preparada.

Empurre as longas bordas do papel de filtro nas linhas finas de vaselina usando uma pinça e, em seguida, mergulhe as retinas em três a quatro gotas de solução fria de Ringer. Primeiro, transfira a preparação para o estágio de fatiador de tecidos. Posicione a borda longa ao longo da linha marcada e prenda as extremidades da câmara ao palco com fita adesiva de laboratório.

Em seguida, começando por uma extremidade, corte a retina e o papel de filtro usando uma pressão firme e suave no braço de corte. Verifique se a primeira fatia foi totalmente cortada e, em seguida, use o micrômetro para cortar fatias com aproximadamente 400 mícrons de espessura. Em seguida, transfira a câmara com seções fatiadas para a placa de Petri contendo a lamínula preparada, que servirá como uma escada de imagem.

Inunde o prato com solução de Ringer fria e coloque-o no palco do microscópio de dissecação. Agora, sob baixa ampliação, use a pinça para prender uma tira e mova-a para a escada de imagem deslizando a placa de Petri subjacente. Gire as fatias 90 graus e enterre as bordas do papel de filtro na geléia.

É importante manter a retina submersa e evitar qualquer contato direto com a retina. Em seguida, reposicione as fatias nas escadas para que as camadas da retina fiquem claramente visíveis. Para as fatias em cada extremidade da escada, faça a retina voltada para dentro em direção às outras fatias para minimizar o movimento durante a injeção ou fluxo.

Descarte todas as fatias que não aderirem bem ao papel. Agora, manche o tecido. Enquanto isso, prepare a câmara de imagem e o aparelho de injeção.

Primeiro, lave o tubo com a solução de Ringer, até que não haja bolhas de ar. Em seguida, conecte a tubulação à entrada da câmara de imagem e feche a torneira de parada. Em seguida, volte a encher a seringa com a solução injetável e volte a colocá-la no tubo.

Agora, use uma pinça para transferir a escada de imagem preparada para a câmara de imagem. Pressione-o no ponto de geléia perto da borda de entrada e encha a câmara com a solução de Ringer para cobrir as fatias. Em seguida, prossiga com a imagem.

Usando as técnicas descritas, cortes perfeitamente transversais podem ser visualizados através de todas as camadas da retina. Quando ligeiramente girado, feixes dos segmentos externos serão visíveis. Usando a coloração PI, as células mortas podem ser eliminadas da análise.

Os fotorreceptores PI-negativos saudáveis têm uma morfologia estereotipada polarizada alongada. Quando em Ringer oxigenado, eles podem ser fotografados por até quatro horas. Uma estratégia de imagem é visualizar a dinâmica do retículo endoplasmático do fotorreceptor do cone em relação ao núcleo.

Usando tecidos que expressam GFP e o cone ER, enquanto contra-coloram com um corante nuclear. Uma estratégia semelhante pode ser empregada para visualizar o citoesqueleto de actina com tecido que expressa actina fundida com GFP. Usando imagens de lapso de tempo, a dinâmica celular, como flutuações citosólicas de cálcio em um fotorreceptor de cone, pode ser observada.

Por exemplo, ao esgotar isotonicamente o sódio na câmara de imagem, o GCaMP pode ser usado para visualizar o aumento das concentrações citosólicas de cálcio. Ao quantificar as respostas de fluorescência de segmentos externos de cone único, corpos celulares e sinapses, a dinâmica do cálcio intracelular pode ser determinada durante manipulações farmacológicas e assim por diante. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a luz vermelha antes que o EPR seja removido.

Alise cuidadosamente as oculares antes de cortar e mantenha as fatias submersas o tempo todo. Uma vez dominado, a dissecção, o corte e a preparação do tecido para imagens podem ser feitos em menos de 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar fatias de retina de peixe-zebra para estudar o metabolismo e a fisiologia em tipos específicos de células em compartimentos celulares.