Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

O objetivo geral desses métodos de coloração é quantificar a abundância de lipídios intracelulares e avaliar a distribuição de lipídios entre diferentes tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no metabolismo lipídico, como como os lipídios são regulados genética e bioquimicamente e quais estados de doença regulam a homeostase lipídica. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente simples e barata de realizar.

Para realizar a coloração lipídica do Vermelho do Nilo, os vermes da placa em meio de crescimento de nematóides ou NGM semeados com E.coli OP50 de log tardio e cultivem os vermes a 20 graus Celsius até o estágio inicial de L4. Lave os vermes com um milímetro de solução PBST e transfira a suspensão sem-fim para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto.

Em seguida, remova o sobrenadante e repita a lavagem com PBST até que a E.coli seja removida da suspensão. Em seguida, ao pellet de minhoca, adicione 100 microlitros de 40% de isopropanol ou 60% para coloração ORO e incube a amostra em temperatura ambiente por três minutos. A adição de isopropanol é crucial para a permeabilização adequada dos vermes antes da coloração.

Centrifugue os vermes a 560 vezes a gravidade por um minuto e remova o sobrenadante sem interromper o pellet do verme. É importante minimizar a exposição à luz durante as etapas de centrifugação. Agora, enquanto estiver no escuro, adicione 600 microlitros de solução de trabalho NR previamente preparada a cada amostra.

Inverta os tubos três vezes e misture totalmente os vermes e a solução. Em seguida, incubar a amostra no escuro à temperatura ambiente durante duas horas. Após a incubação, centrifugue os vermes e remova o sobrenadante.

Em seguida, adicione 600 microlitros de PBST e incube as amostras no escuro por 30 minutos para remover o excesso de mancha NR. Depois de girar as amostras novamente como antes, remova tudo, exceto aproximadamente 50 microlitros de sobrenadante e ressuspenda o pellet de minhoca na solução restante. Para preparar lâminas para imagens, pipete cinco microlitros de suspensão sem-fim em uma lâmina de microscópio e aplique cuidadosamente uma lamínula para evitar prender bolhas de ar.

Usando o canal FITC GFP para obter imagens de vermes corados com NR e tentando diferentes tempos de exposição, obtenha imagens dos vermes com uma ampliação de cinco vezes para capturar vários animais por campo de visão. Em seguida, mude para uma ampliação de 10 vezes para melhor quantificação de vermes individuais. Para quantificar as imagens, faça o upload das micrografias para o ImageJ.

No menu suspenso de imagens, ajuste o brilho, o contraste do painel de imagens e propague as alterações em todas as imagens clicando em aplicar. Use a ferramenta de seleção de polígono para delinear cada verme com imagem e, no menu suspenso de análise, use a função de medição para qualificar a intensidade de fluorescência emitida pelo NR. Para cada imagem, meça cinco locais de fundo e calcule a intensidade média de fluorescência de fundo. Adicione 600 microlitros de solução de trabalho Oil Red O ou ORO a cada amostra e inverta o tubo três vezes para misturar bem os vermes e o ORO.

Girar as amostras a 30 RPM e RT durante duas horas. Centrifugar as amostras a 560 vezes a gravidade durante um minuto e aspirar todo o sobrenadante, com excepção de 100 microlitros. Em seguida, use 600 microlitros de PBST para ressuspender as amostras e gire os tubos a 30 RPM por 30 minutos para remover o excesso de coloração ORO.

Para distinguir melhor a localização da linha germinativa dos animais nas células intestinais, core os núcleos adicionando um microlitro de DAPI para cada mililitro de solução de trabalho ORO. Em seguida, para preparar as lâminas para a obtenção de imagens, ressuspenda os vermes e o sobrenadante restante e misture bem a solução. Coloque cinco microlitros de suspensão sem-fim em uma lâmina de microscópio e aplique cuidadosamente uma lamínula, garantindo que não se formem bolhas de ar.

Para obter imagens dos vermes corados com ORO, use uma câmera colorida com ampliação de cinco vezes para obter imagens de vários vermes em um campo de visão. Em seguida, mude para uma ampliação de 10 vezes para um melhor exame de vermes individuais. Por fim, após fazer o upload das imagens para o ImageJ e criar um deck de imagens de acordo com o protocolo de texto, categorize as imagens de acordo com o acúmulo de lipídios em todo o corpo do animal ou em tecidos específicos.

O SKN-1 compartilha homologia com o Nrf2 de mamíferos e demonstrou mediar a oxidação de ácidos graxos. Esta figura mostra animais SKN-1 ativados expostos a condições que levam ao aumento dos níveis de lipídios. Como visto nessas imagens, a fluorescência NR capturada usando o canal FITC GFP é proeminente ao longo do intestino, mas é mais fraca na cabeça, cauda e lúmen intestinal.

Embora seja fácil categorizar os vermes de acordo com a presença ou ausência de depleção somática de gordura dependente da idade ou ASDF, pode ser difícil identificar animais com perda de gordura intermediária. Em comparação com animais não ASDF, que apresentam coloração vermelha brilhante em todo o corpo com poucas áreas translúcidas, os vermes ASDF exibem depleção de gordura perceptível nas células intestinais. Animais em processo de desenvolvimento de ASDF geralmente apresentam manchas translúcidas onde ocorre a maior parte da perda de gordura.

Além disso, os vermes ASDF ainda podem apresentar coloração vermelha brilhante nas regiões da cabeça e da cauda porque o fenótipo não é definido pela perda completa de gordura somática, mas pela extensa depleção de gordura em relação a animais não idosos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas mais o tempo de imagem, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar e permeabilizar os vermes no máximo 30 minutos antes da coloração.

Após esse procedimento, outros métodos, como a microscopia CARS, podem ser realizados para comparar o tipo de espécie lipídica que cada tecnologia identifica e determinar qual método é mais adequado para tipos específicos de perguntas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar lipídios e avaliar a distribuição de lipídios nos vermes usando a coloração Nile Red e Oil Red O, seguida de análise de micrografia ImageJ.